Transcript 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳

生物化学实验 CQMU
P、74
生物化学与分子生物学实验室
2008.09
一 实验目的
二 实验原理
三 实验材料与仪器
四 实验步骤
五 注意事项
六 思考题
一 、 实验目的
学习掌握电泳技术的基本原理
熟悉醋酸纤维薄膜电泳法分离血清
蛋白质的方法
了解血清蛋白质测定的临床意义
二、电泳法的基本原理
带电质点在电场中向所带电荷相反方向泳
行的现象叫电泳（Electrophoresis）。
蛋白质是兼性离子，由于不同蛋白质分子
的氨基酸种类和数目组成不同，各种血清蛋白
质的分子量和等电点也不相同，故在同一pH条
件下，它们的电泳速度各不相同，因此可以彼
此分开。
蛋白质两性电离和等电点
COOH
COO－
COOH
H＋
OH－
PP
NH23＋
pH=pI
不显电性
不移动
P
NH3＋
pH﹤pI
带负电,向正极移
OH－
H＋
COO－
P
NH2
pH﹥pI
带负电,向正极移
血清蛋白电泳的基本原理
本实验以醋酸纤薄膜为支持物，利用
血清蛋白质的等电点都低于8，在pH8.6的
巴比妥缓冲液中均带负电荷，在电场中向
正极移动，经50分钟电泳后，用氨基黑
10B染色，可将血清蛋白分为清蛋白、α1、
α2、β、γ球蛋白五个区带。
三、实验材料与仪器
1 器材：
血清、
醋酸纤维薄膜(8X2mm)；
常压电泳仪；水平电泳槽；
分光光度计等
电泳仪
分光光度计
电泳槽
2 试剂：
（1）pH8.6巴比妥缓冲液(离子强度0.07)
（2）0.5%氨基黑10B染色液
（3）漂洗液:乙醇:冰醋酸:H2O =45:5:40ml
（4）洗脱液：0.4 mol/L NaOH溶液
四、实验步骤
（一）准备：
取缓冲液中浸泡的薄膜1张；
用滤纸吸干多余水分；
识别无光泽面；
记下上样端的编号。
（二）点样：
用X光片蘸血清点于薄膜条无光泽面
的点样线上（距膜端1.5厘米处），使血
清渗入膜内。
1.5cm
（+）
（-）
无光泽面
点样线
(三) 电泳：
将薄膜点样面（无光泽面）向下，两
端拉平紧贴于电泳槽架的滤纸垫上，点
样端在阴极，盖上槽盖。
通电: 电压110-120 V，50-60 min。
关闭电源。
(四) 染色与漂洗
取出膜条，浸入氨基黑10B溶液中
染色5 min(浸透后再放第二张)。
取出薄膜，浸入漂洗液中漂洗3-4次
至背景基本无色，呈现出清晰的血
清蛋白电泳图谱，晾干备用.
人血清蛋白电泳图
清
α α蛋
γ β 2 1 白
—
+
人血清脂蛋
白电泳图
(五)定量(洗脱定量法与扫描定量法)
1 洗脱：
取试管6支，依次编号为0（空白）、A、α1、
α2、β、γ，各管中加0.4mol/L NaoH 5ml。
将电泳图谱按A、α1、α2、β、γ蛋白区带
剪开，分别装入相应试管中。在图谱两端无蛋
白部位剪一大小与α1相同的薄膜放入空白管。
反复摇动，使薄膜上染料充分洗脱在NaOH液中
2 比色
在波长650nm，以空白管调零，读
取清蛋白、α1、α2、β及γ球
蛋白各管的吸光度。
3 计算
先按下式计算光吸收值总和(T):
T = A + α1 + α2 + β + γ
再按以下算式计算各组分蛋白质的百分数
清蛋白 (%)＝（ A/T ）×100%
α1球蛋白(%)＝（α1/T）×100%
α2球蛋白(%)＝（α2/T）×100%
β球蛋白 (%)＝（β/T ）×100%
γ球蛋白 (%)＝（γ/T ）×100%
A/G ＝ A÷(Aα1＋Aα2＋Aβ＋Aγ)
五、注意事项
醋酸纤维薄膜的预处理
点样位置及上样量
薄膜在槽中的摆放方向和膜面的朝向
电压电流的高低与分离效果
控制染色方法和时间
六、思考题
为什么电泳时采用pH8.6的缓冲液？
与滤纸电泳比较，血清蛋白醋酸纤维
薄膜电泳有哪些优点？
影响电泳的因素
1、质点的大小、形状、带电性质
2、溶液的pH: pH=pI;
pH>pI; pH<pI
3、电压大小: 10～12V/cm长
4、电流强度: 0.4～0.5mA/cm宽
5、电渗:溶液对固定相的相对移动
电泳方向:
受带电性质，
溶液的pH决定和影响.
用
途:
分离纯化蛋白质.
某些疾病患者血清醋酸纤维薄膜电泳结果
急性肾炎
营养不良水肿
肝脾肿大
红斑狼疮
(五) 透明
将脱色后干燥的电泳图谱膜条放入透明A
液2分钟→随即转入B液1分钟→取出后将薄膜
平贴于玻璃板上3～5分钟→薄膜完全透明。
膜与玻璃板间不能有气泡。
干燥后此透明薄膜,区带着色清晰,可用于
光吸收扫描,长期保存不褪色。
2 扫描定量法
透明（P、76）
扫描
用光密度扫描分析仪，扫描透
明 过的电泳薄膜，便可得出电泳曲线，
即距离—光密度曲线（图）。
求积定量
算出曲线每个峰的面积与
总面积的百分比，就是各区带蛋白质占血
清总蛋白的百分比。