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电泳技术
1 电泳:带电粒子在电场中向着与其本身电荷
相反的电极移动的过程。
2 电泳技术优点:快速、准确、重现性好
3 电泳方法分类
按电场分:常压(<500V,适用大分子)、高
压(>500V,适用小分子)
支持体分:自由电泳、区带电泳
仪器装置分:水平式、垂直式、悬架式
4 电泳条件:水溶液(缓冲液)、支持物(区
带电泳)、电场(电泳仪、电泳槽)
一 电泳的基本原理
电泳分离:
移动方向:带电性质决定
泳动度:带电颗粒在单位电场强度下的移动速
度。
μ =v/E=(d/t)/(V/l)=(dl)/Vt
影响μ的因素:
1颗粒本身:带电、大小、形状
2 外界因素:电场强度E、pH、离子强度I、电
渗、缓冲液粘度及温度等。
二 纸电泳
以滤纸为支持体的电泳技术
操作要点:
1 选择缓冲液
对显色剂和紫外光吸收等观察区带的方法无影
响
A 分离蛋白质,pI≈ 5,选pH8.6的缓冲液
(巴比妥缓冲液pH8.6、硼酸pH8.6、磷酸
pH7.4)
B 分离氨基酸:邻苯二甲酸氢钠、磷酸—醋
酸,pH5.9
C 分离核苷酸巴比妥-醋酸pH2.5,柠檬酸
pH2~3
D 分离糖类:HAC-NaAC, pH3~5
2 滤纸的选择与处理
层析用滤纸,纸宽2~3cm/样品组分,长短影响电场
强度。
3 点样
点圆点(量少)、点条状(一般),点中间(未知样
品)、点一边(已知样品)
干法、湿法
4 电泳
电桥水平、加盖、电压稳定、注意时间
5 显色及分析
蛋白:溴酚兰、氨黑10B、偶氮胭脂红B
Aa:茚三酮、靛红
核酸:紫外光下观察
一般洗脱定量
三 薄膜电泳
支持体:薄膜
优点:分辨力较高、简便、快速、区带清晰、
易于定量、便于保存
广泛应用于蛋白质和同工酶等的分离分析
操作
1 薄膜的处理与放置
2 点样
平衡
3 电泳:E 10~25V/cm,0.5~2h
4 显色
四 薄层电泳
将支持物与缓冲液调制成适当厚度的薄层进行
电泳。
常用支持物:淀粉、琼脂、纤维素粉、硅胶等
操作:
1 缓冲液选择
离子强度较高的缓冲液
2 支持物处理
精制品
3 薄层板制作
4加样:挖沟、混合样品、填埋
5 电泳
6分析:印染法
五 凝胶电泳
支持物:多孔凝胶
聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等
具有电泳和分子筛的双重作用,分辨力高
最常用聚丙烯酰胺凝胶,原因:
机械强度好,透明有弹性,稳定,无吸附作用
和电渗作用,可制成不同孔径的凝胶。
分类:垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳;
连续、不连续、梯度、SDS凝胶电泳
1 聚丙烯酰胺凝胶的制备
丙稀酰胺(单体)+N,N-甲叉双丙稀酰胺
(交联剂)→(催化剂) →聚合
催化剂:
(1)过硫酸铵+四甲基乙二胺(TEMED)
(2)核黄素(VitB2)+光
改变单体浓度可改变凝胶孔径
交联剂对孔径有影响:5%最小
根据要分离物质的相对分子质量选择合适
的单体浓度。
2 不连续电泳中样品压缩成层的原理
不连续电泳含两层或三层不同孔径的凝
胶,用不同pH值的缓冲液:
样品胶:大孔径,pH6.7~6.8Tris-HCl缓
冲液
浓缩胶:与样品胶相同
分离胶:小孔径,pH8.8~8.9 Tris-HCl缓
冲液
样品压缩成层原理:
电极缓冲液:pH8.3Tris-甘氨酸
HCl→ (解离) →Cl - , Cl -泳动速度最快(快离子)
CH2(NH2)COOH → (样品胶、浓缩胶pH6.7~6.8) →
CH2(NH2)COO-(0.1%~1.0%)泳动速度最慢(慢
离子)
蛋白质(P)泳动速度介于快慢离子之间
电泳时, Cl -超过P走在最前面,其后形成一个离子
浓度较低的低电导区→较高电位梯度→P和慢离子加
速移动→P压缩成层
样品进入分离胶后,pH为9.5(电泳过程实测),
CH2(NH2)COO-增加,泳动速度增大,很快超过P, P
在均一的电位梯度和pH条件下分离
SDS-凝胶电泳原理
聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS,P电泳迁移
率取决于其分子量,而与形状及所带电荷无关。
加入SDS和巯基乙醇后,巯基乙醇使P二硫键
还原,SDS使氢键、疏水键打开,并结合到P
分子上,形成P-SDS,带上相同密度负电荷,
形状为长椭圆形,短轴一定,长轴长度正比于
P分子量。
分离测定:
测分子量(与标准蛋白比较)
鉴定样品纯度(条带数目)
测定样品P含量:扫描定量(比色)
凝胶电泳的操作要点
1 凝胶制备
2 电极缓冲液
3 样品处理及加样
4 电泳
5 染色与固定
6 脱色
7 分析
烟曲霉菌中抗真菌活性肽类物质的分离与纯化
六 等电点聚焦电泳
电泳系统中加进两性电解质载体,当通已直流
电时,两性电解质载体即形成一个由阳极到阴
极连续增高的pH梯度。P进入时,不同的P移
动到与其等电点相当的pH位置上,从而使不
同等电点的P得以分离。
优点:分辨率高,区带清晰、窄,加样部位自
由,重现性好,可测定P或多肽的等电点。
缺点:需无盐溶液,不适用于在等电点不溶解
或发生变性的P。
1 稳定的pH梯度的形成
2 两性电解质载体
要求:
由多乙烯多胺与丙烯酸加成制备(有不同pH
范围的商品两性电解质载体)
3 支持pH梯度的介质
密度梯度溶液(用于自由电泳)
凝胶(如聚丙烯酰胺凝胶)
4 操作要点
pH梯度支持介质的制备
聚焦电泳
检测
两性电解质载体的除去
电泳技术思考题
1名词解释
电泳、电泳分离技术、泳动度、电渗、区带电
泳、相对迁移率、不连续凝胶电泳
2 影响泳动度的主要因素有哪些?
3 区带电泳的操作步骤一般有哪些?
4 如何制备聚丙烯酰胺凝胶?
5 不连续电泳样品压缩成层原理。
6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
7 采用电泳技术如何测定蛋白质分子量?如何
测定蛋白质等电点?