Transcript 根瘤菌质粒的快速检测
实验十二 根瘤菌质粒的快速检测 根瘤菌质粒的快速检测 • 目的要求 • 实验材料 • 实验程序 • 思考题 目的要求 • 了解根瘤菌质粒的有关特性 • 学习并掌握根瘤菌质粒的快速检 测方法 实验材料Ⅰ • PA液体培养基： 蛋白胨4g、MgSO4•7H2O 5g、dH2O（蒸馏水）1000mL、pH 6.8—7.0。 • TY固体培养基： 胰蛋白胨5g、酵母粉3g、CaCl2•6H2O 1.3g、dH2O 1000mL、 pH7.0。 • 10 X TBE电泳缓冲液： Tris108g、H3BO3 55g、EDTA 9.3g、dH2O 1000mL、pH 8.3。 • Tris-蔗糖溶液： 蔗糖25g、0.025mol• L-1Tris-HCl（pH8.0）100mL、高压灭 菌后40C保存。 • RNA酶缓冲液： Tris-HCl（ pH7.5）10m mol、NaCl 15 m mol、高压灭菌后40C保存。 实验材料Ⅱ • RNA酶溶液：RNA酶（Ribonuclease A，Sigma公司 产品）4mg、 RNA酶缓冲液10mL、分装于小管中， 1000C水浴中处理15min以灭活DNA酶，-200C保存。 • 溶菌酶溶液：溶菌酶（Lysoxyme，Sigma公司产品） 100mg、灭菌双蒸水（d2H2o）5mL、分装于小管中， 每管50L，-200C保存。 • 裂解液（临用前配制）： Tris-蔗糖1mL（用后归于 40C）、溶菌酶溶液（20mg/mL）50L、 RNA酶溶液 （400 g/ mL）50L、溴酚蓝指示剂1—2滴。 实验材料Ⅲ • 溴酚蓝指示剂：溴酚蓝0.25g、蔗糖40g、 dH2O 100 mL、配后存于40C备用。 • 10%SDS：SDS10g、 dH2O 100 mL。 • SDS琼脂糖凝胶：0.65%琼脂糖凝胶2mL、 10%SDS 0.35mL、1XTBE 1.15mL、溴酚蓝指示剂 1滴。 • 溴化乙锭染色剂：溴化乙锭100mg、 dH2O 100 Ml。 避光保存，因溴化乙锭是诱变剂，配制时要带手套， 避免与皮肤接触。 实验程序 • 琼脂糖凝胶的制备 • 根瘤菌质粒DNA的制备 • 电泳及观察 实验程序Ⅰ （琼脂糖凝胶的制备） • 用70%酒精擦洗电泳胶板、挡板、隔板及梳子。 • 用夹子将隔板及梳子夹住，平放在电泳胶板上。注意隔板及梳子 的底端要齐，并且梳子的底部与胶板的间距约0.5mm，同时下 好挡板。 • 配制0.65%的琼脂糖-TBE胶，在微波炉上熔化摇匀，冷却至 650C左右倒在胶板上。倒胶之前先用琼脂糖胶封住电泳胶板的 四周，以免漏胶。 • 配制3.5mL的SDS琼脂糖凝胶，熔化后于650C水浴中保存备用。 • 待凝胶完全冷却后，小心地取出隔板，再将SDS凝胶注满由隔 板形成的凹槽。 • 待SDS胶冷却后，小心地拔出梳子，放入电泳槽中，准备点样。 实验程序Ⅱ （根瘤菌质粒DNA的制备） • 将待测的根瘤菌在TY固体培养基上活化。 • 将活化后的菌株接种于5mLPA液体培养基中，与 280C振荡培养过夜，直至对数生长中期（菌数约为 104 个/mL） • 取1mL菌悬液至1.5mL的小离心管中离心，弃去上 清液并用滤纸条尽量吸去多余的液体，置于冰上 30min。 • 加入新鲜配制的裂解液约50L（视菌体多少而定）， 搅匀后用点样器点入点样槽内，一般每槽点样为20— 30 L。 实验程序Ⅳ （电泳及观察） • 接通电源，使点样槽位于负极，先20V低电压电泳 30min，然后升高到100V电泳6h。电泳过程中应 注意观察溴酚蓝指示剂的电泳位置及情况。 • 关闭电源，取出电泳胶板，将凝胶放在含0.5g/mL 溴化乙锭的染色剂中染15—30min，再转入蒸馏水 中脱色15—30min。 • 将脱色后的凝胶放在暗室中的紫外透射仪上观察结 果，并注意戴好防护面罩。 思考题 • 如何区分染色体DNA与质粒 DNA？ • 正常情况下，实验应出现怎样的 结果？ 实验十二 结 束