Transcript 实验四酵母核糖核酸的分离及组分鉴定

实验四 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定







(先打开水浴锅,温度设置成100摄氏度)
一、目的
二、原理
三、器材
四、试剂和材料
五、操作
六、注意事项
2010版
一、目的


了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分
的方法以
了解苔黑酚定量测定RNA的方法。
2010版
二、原理


酵母核糖核酸中RNA含量较多，RNA可溶
于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙
醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，即
得到RNA的粗制品。
核糖核酸中含有核糖、嘌蛉碱，嘧啶碱
和磷酸各组分，加硫酸煮沸可使其水解，
从水解液中可以测出上述组分的存在。
2010版
三、器材





锥形瓶
大研钵
电子天平
离心机
恒温水浴锅
注意仪器使用方法
离心管平衡!!
2010版
四、试剂和材料





酵母粉
0.04 M NaOH,95%乙醇,1.5 M H2SO4溶液,浓氨水,0.1M
AgNO3
酸性乙醇溶液：30ml95%乙醇加0.3ml浓盐酸混匀。
苔黑酚--FeCl3溶液：将100 mg苔黑酚溶于100ml浓HCl中,再
加入100mgFeCl3.6H2O，临用时配制。
定磷试剂：
按顺序以A：B：C：蒸馏水＝1：1：1：2（V/V）混匀,现配。
A、17% H2SO4： 将17ml浓硫酸缓缓加入83ml水中。
B、2.5%（NH4）6Mo7O24：2.5g（NH4）4Mo2O7溶于100ml蒸
馏水中。
C、10%Vc：10g Vc溶于100ml蒸馏水中，用棕色瓶贮存。颜
色呈淡黄色时可以使用，如呈深黄或棕色则失效。
2010版
五、操作

1、酵母RNA的提取(2-3人一份)
将4g酵母溶于20ml0.04 M NaOH溶液中（先以少量
NaOH溶液湿润酵母，并充分研磨)， 将悬浮液转移
到250ml锥形瓶中，在沸水浴30分钟，不时搅拌,冷
却后转入离心管进行离心 . ----（蛋白质变性沉淀，RNA溶于
碱性溶液）


离心10min（4000rpm),将上清液倾入10ml酸性乙醇
溶液中，待核糖核酸沉淀完全后，离心3min
（4000rpm），弃去上清。 --- RNA不溶于乙醇，pI=2.5）
用95%乙醇洗涤沉淀，离心3min（4000rpm）弃去
上清液，共进行两次。 沉淀可在空气中干燥，即为
酵母RNA的粗制品。
2010版
五、操作


2、RNA水解液的制备：
取200mg 提取的核酸，加入1.5 M H2SO4 10ml ，
在沸水浴中加热10分钟后制成水解液并进行组分
的鉴定。
3、RNA组分的鉴定：
① 嘌呤碱：取水解液1ml加入过量的浓氨水，然后
加入约1ml 0.1 M AgNO3溶液 观察溶液的变化。
② 核糖：取1支试管加入水解液1ml，加苔黑酚-FeCl3溶液１ml，放沸水浴中10分钟，注意溶液颜
色的变化。
③ 磷酸：取1支试管，加入水解液1ml和定磷试剂
1ml，在水浴中加热，观察溶液颜色的变化。
2010版
六、注意事项



1. 先以少量 NaOH溶液湿润酵母，并进
行充分研磨，再用剩余的NaOH溶液冲洗
研钵一起转入离心管。
提取时,注意每个步骤的目的和意义
2.值日第五组
3.完成实验报告
2010版