Transcript 生物工程分析与检验实验

实验1 折光法测
定甘油护肤水中
甘油的含量
一、实验目的及要求
熟悉掌握折光仪的使用方法
二、实验原理
丙三醇溶液的折射率在一定范围内与其浓
度成正比，根据丙三醇折光率的标准曲线，
计算甘油护肤水中丙三醇的含量。
三、实验材料
仪器：阿贝折光仪、电子天平、25mL容量瓶
（5个）、玻璃棒、100mL烧杯、滴管、洗
瓶、擦镜纸、室内温度计；
试剂：丙三醇（AR）50mL，甘油护肤水
（若干滴）。
10
5
1.3340
0
1.3330
1.3320
1.3310
目镜视野和读数
四、方法和步骤
1. 折光仪的校正 用测定蒸馏水折射率的方法进行
校正（参照教材）；
2. 标准曲线的制备 精密称取甘油适量，加蒸馏水
配制成浓度分别为28.00％(0.28g/ml)、29.00％
(0.29g/ml)、30.00％(0.30g/ml)、31.00％
(0.31g/ml)、32.00％(0.32g/ml)的溶液，用折光法
在20℃分别测定其折光率；
3.样品测定 在相同条件下测定甘油护肤水的折光率。
五、实验结果
1. 标准曲线方程
丙三醇浓度（％）
折射率
RSD
28.00
29.00
30.00
31.00
32.00
RSD: relative standard deviation, 相对标准偏差
2. 甘油护肤水中丙三醇的含量
六、思考题
1. 折光仪的工作原理和应用范围。
2. RSD的计算方法和意义。
七、 注意事项
1、折射仪在开始测量前必须用蒸馏水校正。
2、在使用折射仪时，切勿使滴管尖端直接接
触镜面，以防造成刻痕。
3、如果在折射仪的目镜中观察不到半明半暗
的分界线，而是畸形的分界线，表明棱镜
间未充满液体。若出现弧形光环，则可能
是有部分光线未经过棱镜面直接照射在聚
光镜上，应重新调整入射光的角度范围。
实验2 旋光法测定味精纯度
一、实验目的及要求
1、了解旋光仪的构造、使用方法；
2、掌握旋光度的测定原理与方法。
二、实验原理
味精的主要成分为L-谷氨酸钠盐（如图1），在盐
酸溶液中以L-谷氨酸形式存在。已知在20℃下，
2mol/L盐酸溶液中，L-谷氨酸的比旋光度为＋32º。
在一定温度下，测定味精盐酸溶液的旋光度，根
据旋光度换算L-谷氨酸的含量。
图1 L－谷氨酸钠盐分子结构式
比旋光度：在一定温度和一定光源情况下，当
溶液浓度为 1 g/ml ，液层厚度为 1分米 时偏振
光所旋转的角度。记为：
[ ] = α/ L C
t
——查手册得到不同物质的比旋光度。
α—— 测定样液的旋光度。
L—— 旋光管长度（液层厚度）分米。
C—— 样液浓度（所求值）。
t——测定温度为20℃。
λ——光源波长通常为D钠线589.3nm。
三、实验材料
仪器：WZZ-2S旋光仪(试管:100mm或1dm、
200mm或2dm)、电子天平、100mL容量瓶（2
个）、玻璃棒（1根）、10mL移液管（1根）、
100mL烧杯、吸耳球、擦镜纸、温度计；
试剂：味精（10g），盐酸（32mL），蒸馏水
（250mL）
四、方法和步骤
1、样品溶液的配制 精确称取味精样品10.00g，
加入40~50ml蒸馏水溶解，搅拌下加入分析纯盐
酸16ml，使味精全部溶解，冷却至室温，全部转
入100ml容量瓶，定容至刻度；
2、旋光仪零点校正 接通电源，打开电源开关，
等待5min使钠灯发光稳定。按“测量”键，这时
液晶屏应有数字显示（注意：开机后“测量”键
只需按一次，如果误按该键，则仪器停止测量，
液晶屏无显示。可再次按“测量”键，液晶重新
显示，此时需重新校零。若液晶屏已有数字显示，
则不需按“测量”键）。取16ml分析纯盐酸，用
蒸馏水定容至100ml，装满旋光管，放进样品室，
放入仪器试样室的试样槽中，按下“清零”键，
使显示为零；
3、样品液的测定 用样品液洗涤旋光管3～5次，装
满，放进试样室的试样槽中，液晶屏显示所测的
旋光度值，此时指示灯“1” （见仪器正面）点亮。
记录旋光度。按“复测”键一次，指示灯“2”点
亮，表示仪器显示第二次测量结果，再次按“复
测”键，指示灯“3”点亮，表示仪器显示第三次
测量结果。按“shift/1 2 3”键，可切换显示各次
测量的旋光度值。按“平均”键，显示平均值，
指示灯“AV”点亮。
4、温度校正 测试前或测试后，测定试样溶液的温
度，以进行温度校正计算。
五、实验结果
1、根据测定的旋光度a ，计算样品溶液中L-谷氨酸的浓
度C（％）。
[ ]
t
为测定温度t时，L-谷氨酸的比旋光度：
式中，0.06为L-谷氨酸比旋光度的温度校正系数。
2、根据样品溶液中L-谷氨酸的浓度，计算样品
中味精的纯度：
六、思考题
1、什么叫旋光度？物质的旋光度与哪些因素有
关？
2、测定旋光度时如光通路上有气泡，将会产生
什么影响？
七、实验中应注意的问题
1、旋光仪在开始测量前，必须预热5—10min，至
钠光灯充分受热。
2.一般情况下本仪器如在不放试管时示数为零，放
入无旋光度溶剂后（例如蒸馏水）测数也为零，
但须注意倘若在测试光束的通路上有小汽泡或试
管的护片上有油污，不洁物或将试管护片旋得过
紧而引起附加旋光数，则将会影响空白测数，在
有空白测数存在时必须仔细检查上述因素或者用
装有溶剂的空白试管放入试样槽后再清零。
3. 本方法适用于纯味精，或者只加了食盐的味精，
含量低于80%的味精和其它调味料，都添加了其
他物质，如糖，呈味核苷酸等，这此物质对旋光
度都会产生影响，因此不适用于旋光度法。
实验3 白酒中总酸的测定
一、实验目的及要求
1、了解酸碱滴定法的原理；
2、掌握酸碱滴定的基本操作。
二、实验原理
有机酸（弱酸）用标准碱液滴定时，被中
和生成盐类。用酚酞作指示剂，当滴定到
终点（pH=8.2,指示剂显红色）时，根据消
耗的标准碱液体积，计算出样品总酸的含
量。其反应式如下：RCOOH + NaOH→
RCOONa +H2O。白酒中总酸以中和法测
定。
三、实验材料
仪器：25mL碱式滴定管、水蒸汽蒸馏装置（蒸汽发
生瓶、样品瓶、冷凝管、接受瓶）、250mL锥形
瓶（3个）、 电子天平、100mL量筒（1个）、
1000mL容量瓶，100mL容量瓶，玻璃棒（1根）、
10mL移液管（1根）、100mL烧杯、铁架台，蝴
蝶夹；。
试剂：白酒（250mL），盐酸（48mL），蒸馏水
（250mL），1%酚酞乙醇溶液、0.1mol/L氢氧化
钠标准溶液，10％磷酸溶液。
四、方法和步骤
1、氢氧化钠标准溶液的配制 称取120g NaOH，溶
于100mL水中，摇匀，倒入聚乙烯容器中，密闭
放置至溶液清亮。用塑料管吸取5.6mL上层清液，
注入1000mL无CO2的蒸馏水中摇匀。称取0.6g于
105-110℃烘至质量恒定的基准邻二甲酸氢钾，称
准至0.0001 g，溶于80mL体积的无CO2的水中，
加2滴酚酞指示液，用配制好的NaOH溶液滴定至
溶液呈粉红色，同时作空白试验；
2、总酸的测定：吸取25ml白酒于250mL锥型瓶中，
加入100ml水，加1 %酚酞2滴，用0.1NaOH滴定
微红色，同时做空白实验；
五、实验结果
1、氢氧化钠标准溶液浓度：
M
C（NaOH）= V V  0.2042
0
式中：C（NaOH）——氢氧化钠标准溶液之物质的浓度，
mol/L；
V——消耗氢氧化钠的量，mL；
V0——空白试验消耗氢氧化钠的量，mL；
M——邻苯二甲酸氢钾的质量，g；
0.2042——邻苯二甲酸氢钾的摩尔质量。K g/ mol。
2、白酒的总酸度：
V C  K
 100
总酸度（以乙酸计g/100ml）=
25
式中：C—氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度；
V—氢氧化钠标准溶液的用量（mL）；
K—换算为适当酸的系数：苹果酸0.067；柠檬酸0.064；柠檬
酸（一分子水）0.070；醋酸0.060；酒石酸0.075；乳酸
0.090。
六、思考题
1、为什么需要标定NaOH的浓度？
实验4 苔黑酚法RNA的定量测定
一、实验目的及要求
1、掌握RNA提取的原理及方法。
2、学会用苔黑酚法测定RNA含量。
二、实验原理
酵母核酸中RNA含量较多（酵母含
RNA约2.67-10%），RNA可溶于碱性溶
液，再用乙醇沉淀得到RNA粗制品。将
RNA粗制品经过硫酸水解后鉴定其成分
及定量。
RNA水解产生的核糖、嘌呤碱和磷酸可用下述方法鉴
定：
1、嘌呤与硝酸银共热产生嘌呤盐基银化合物的白色絮状
沉淀。
2、核糖在浓盐酸中，与苔黑酚（3,5-二羟甲苯）及高铁
盐酸试剂共热产生特殊的绿色（670nm定量）。
3、磷酸与钼酸铵试剂作用产生磷钼酸，后者在还原剂抗
坏血酸（或硫酸亚铁）的作用下形成蓝色的钼蓝
（660nm定量）。
三、实验材料
1、仪器：沸水浴（铝锅）、电子天平、离心机、恒
温水浴锅、布氏漏斗及抽滤装置、真空泵、分光光
度计（670nm）比色皿、pH试纸（5-7），250 mL
锥形瓶、100mL锥形瓶、100mL烧杯、100mL量筒、
滤纸（预先烘干称重），烘箱、50mL容量瓶、
10mL试管（15根）、
2、试剂：
酵母粉（8g）、0.2% NaOH（40mL）、 乙酸（滴
瓶）2mL、95%乙醇 （90mL）、乙醚（20mL）瓶、
浓氨水（2mL）、5% AgNO3 （1mL）、
10%H2SO4 （5mL）、
苔黑酚-FeCl3溶液 400mL (用前配制) 100mg苔黑
酚溶于100mL浓HCl ，再加入100mg FeCl3·6H2O
定磷试剂 100mL，将以下溶液按顺序以A：B：C：蒸馏水＝1：
1：1：2（V/V）混匀，本试剂不能长期保存。
A、17% H2SO4： 将17ml浓硫酸缓缓加入83ml水中。
B、2.5% (NH4)4Mo2O7 ：2.5g (NH4)4Mo2O7溶于100ml蒸馏水
中。
C、10%Vc：10g Vc溶于100ml蒸馏水中，用棕色瓶贮存。4℃，
1个月。颜色呈淡黄色时可以使用，如呈深黄或棕色则失效。
标准RNA母液：准确称取酵母RNA10.0mg，用少量蒸馏水溶
解（如不溶，可滴加浓氨水，调pH7.0），定容到10ml。
标准RNA溶液：取母液1ml，定容到10ml，此溶液RNA浓度为
100μg/ml。
四、操作
1、酵母RNA的提取
（1）将8g酵母溶于40ml(25+15ml) NaOH溶液中（先以25
mlNaOH溶液湿润酵母，并充分研磨10min ， 将悬浮液转移到
250ml锥形瓶中，再用15ml NaOH溶液将残余悬浮液转移到锥形
瓶中），在沸水浴30 min ，不时搅拌，冷却后加入约5滴乙酸
（使pH5-6）转入离心管进行离心。离心10min（ 4000转/分)。 ---（蛋白质变性沉淀，RNA溶于碱性溶液）
（2）量取上清，缓缓加入2倍体积的95%乙醇，边倒边搅，待核
糖核酸沉淀完全后（静置片刻），离心3min（ 3000转/分），弃
去上清。 --- （RNA不溶于乙醇，pI=2.5）
向沉淀中加适量95%乙醇（10ml）搅散转移到布氏漏斗抽干，重
复一次。用乙醚洗沉淀2次。干滤渣即RNA粗制品，称量并记录
总量
（3）准确称量50mg干滤渣（M2）用于苔黑酚法测RNA含量，其
余的干滤渣用于以下鉴定

2.鉴定
将用于鉴定的干滤渣转移到锥形瓶中，加入10%H2SO4 5mL，
煮沸2min后鉴定组分。
① 嘌呤碱：水解液1ml+1mlAgNO3溶液+过量的浓氨水，观察溶液
颜色变化。
（水解液1ml+过量的浓氨水+1mlAgNO3溶液，观察溶液颜色
变化）
② 核糖：取1支试管加入水解液1ml，加三氯化铁-盐酸溶液2 ml，
再加苔黑 酚（地衣酚）溶液0.2ml，水浴加热， 注意溶液颜色变
化。
③ 磷酸：取1支试管，加入水解液1ml和定磷试剂1ml，水浴加热，
注意溶液颜色变化。
(浓氨水，FeCl3-浓HCl，定磷试剂在通风柜中)
3.苔黑酚法测RNA含量
（1）制作标准曲线 取小试管6只，如下表加入试剂，
沸水浴保温45min，冷却，测定其A670；
试剂
1
2
3
4
5
6
RNA标准溶 0
液（mL）
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
蒸馏水（mL）2.0
1.6
1.2
0.8
0.4
0
2.0
苔黑酚-FeCl3溶液
（mL）
0
RNA浓度
（μg/ml）
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
10
20
30
40
50
标准RNA溶液为100μg/ml。
（2）测定样品溶液浓度：将M2用蒸馏水配成
1mg/mL (即50 mg/50mL)，稀释10倍后，取
三只试管，各加入1 mL用于定量，使浓度在
10-100μg/mL范围。加蒸馏水1.0mL及苔黑酚
试剂2.0mL，沸水浴保温45min，冷却，测定
其A670，并在标准曲线上查找样品的质量；
五、实验结果
1、RNA标准曲线：
2、50mg干滤渣（M2）中RNA含量：
W1= M1 / M2 × 50×10×10-3 × 100%
3、转换成酵母干粉中RNA含量：
W= M / 8 × W1 × 100%
M： 总的干滤渣 （g）
M1 ：稀释后样品在标准曲线上查找的质量 （μg）
M2 ：干滤渣 （50mg）
10： 稀释倍数
50：从50mL中取1mL用于测量
8 ： 称取的干酵母粉 （g）
六、思考题
1、实验中两次离心，每次离心后应保留上清液，
还是沉淀？为什么？
实验5 牛奶中氨苄西林的荧光分光光
度法测定
一、实验目的及要求
1、掌握氨苄西林荧光分光光度法的原理及方法。
2、学会使用荧光分光光度计。
二、实验原理
氨苄西林（氨苄青霉素）在酸性溶液内加热
后水解形成荧光产物,可在荧光分光光度计上
以激发/发射波长360/420μm测定。
三、实验材料
1、仪器：荧光分光光度计、电子天平、水浴锅、
500mL容量瓶、100mL容量瓶（3个）、
10mL移液管（2）、25mL容量瓶（7个）。
2、试剂：氨苄西林（0.15g）、牛奶（20mL）、
20%三氯乙酸（7mL）、1mol/L HCl
（7mL）、甲醇（35mL）、
四、方法和步骤
1、溶液的制备
（1）对照品 精密称取氨苄西林0.1500g，置于500mL容量瓶中，
加水溶解并稀释至刻度，摇匀（全班共用）。精密量取
10.00mL于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。
（2）待测品 精密量取牛奶10.0mL，置于100mL容量瓶中，加
水稀释至刻度，摇匀。
（3）加标回收品 分别精密量取牛奶10.0mL，0.03g/100mL氨苄
西林溶液5.0mL，置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇
匀。
2. 衍生化 精密量取对照液1.0mL、2.0mL、5.0mL、10.0mL及待
测品溶液5.0mL、加标回收品5.0mL分别置于25mL容量瓶中，
各加20%三氯乙酸 1.0mL、1mol/L HCl 1.0mL振摇30s，于沸
水浴加热90min，取出后冷至室温，各加甲醇5.0mL，加水稀
释至刻度。同时以水按同法操作作为空白。
3. 测定 在荧光分光光度计上以激发波长360nm、发射波长
430nm测定。
五、实验结果
1、计算氨苄西林标准曲线。
2、牛奶中氨苄西林含量。
3、计算氨苄西林回收率。
六、思考题
1、应用荧光分光光度法测定氨苄西林浓度时有
哪些注意事项？
实验6 薄层层析法测定红辣椒中的有
效成分
一、实验目的及要求
1、学习用薄层层析分离天然产物的原理和实验
方法。
二、实验原理
红辣椒中含有多种色素，已知的有辣椒红、辣椒玉
红素和β-胡萝卜素，它们都属于类胡萝卜素类化合
物，从结构上说都属于四萜化合物。
其中辣椒红是以脂肪酸酯的形式存在的，它是辣椒显深
红色的主要因素。辣椒玉红素可能也是以脂肪酸酯的形
式存在的。
本实验是以二氯甲烷为萃取溶剂，从红辣椒中只萃取出
色素，经浓缩后用薄层层析法作初步分析。
三、实验材料
1、仪器材料：研钵or粉碎机、电子天平、水浴
锅、250 mL圆底烧瓶、回流冷凝管、毛细管。
2、试剂：红辣椒（1g）、二氯甲烷（40 mL）、
石油醚（30～60 ℃）（30）。
四、方法和步骤
1．色素的萃取和浓缩
将干的红辣椒剪碎研细，称取1 g，置于250 mL圆
底烧瓶中，加入10 mL二氯甲烷和两三粒沸石，装
上回流冷凝管，水浴加热回流20分钟。冷至室温后
抽滤。将所得滤液用水浴加热蒸馏浓缩至剩约1 mL
残液，即为混合色素的浓缩液。
2．薄层层析分析
取一块硅胶玻璃板，活化后，用平口毛细管汲取前
面制得的混合色素浓缩液点样，用1体积石油醚
（30～60 ℃）与3体积二氯甲烷的混合液作展开剂，
展开后记录各斑点的大小、颜色并计算其Rf值。
五、实验结果
1、已知Rf值最大的三个斑点是辣椒红的脂肪酸
酯、辣椒玉红素和β-胡萝卜素，试根据它们
的结构分别指出这三个斑点的归属。
六、思考题
1、有机溶剂二氯甲烷抽提色素时的水浴温度为多少，
为什么？
七、注意事项
1．选用的展开剂一般能获得良好的分离效果。如果
样点分不开或严重拖尾,可酌减点样量或稍增二氯甲
烷比例。
2．不可用同一支毛细管汲取不同的样液。