Transcript 总糖和还原糖的测定

实验一、总糖和还原糖的测定
——3,5-二硝基水杨酸法
一、实验目的
1、掌握还原糖和总糖测定的基本原理；
2、学习用3,5-二硝基水杨酸法测定还原
糖的方法。
二、实验原理
 还原糖是指含有自由醛基或者酮基的糖类，
单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还
原糖；利用糖的溶解度不同，可将植物样
品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来；
对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解
法使其降解成有还原性的单糖进行测定，
再分别求出样品中还原糖和总糖的含量
（还原糖以葡萄糖含量计）。
 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及
其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为
棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
NaOH
加热
黄色
棕红色
 在过量的NaOH碱性溶液中， 3-氨基-5-硝
基水杨酸呈橘红色，在540nm处有最大吸
收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与
光吸收值成线性关系。利用比色法，在
540nm 波长下测定光密度值，查对标准曲
线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖
的含量。
三、实验器材
1、材料：山芋粉
2、仪器：电子分析天平、水浴锅、V-1100
可见分光光度计、移液器
3、其他：试管、容量瓶、三角烧瓶、量筒、
吸管（移液管）、洗耳球、玻棒、洗瓶、
漏斗、离心管、六凹反应盘、pH试纸（1
～14）
四、实验试剂
1、标准葡萄糖溶液（1.0mg/ml）
2、DNS试剂
3、6mol/L HCl
4、6mol/L NaOH
5、I2-KI溶液
五、操作
1、样品中还原糖的提取
准确称取0.5g山芋粉置于100ml三角烧瓶中
加3ml蒸馏水，调成糊状
再加30ml蒸馏水
50℃水浴，30min (不时搅拌)
转移至50ml离心管中，4000rpm，5min
上清液1
沉淀
加20ml蒸馏水，洗涤沉淀，4000rpm，5min
上清液2
沉淀(弃)
置于容量瓶中，蒸馏水定容至100ml,混匀，
取1ml即可进行还原糖的测定。
2、样品中总糖的水解、提取
准确称取0.2g山芋粉置于100ml三角烧瓶中
加3ml蒸馏水，调成糊状
取1～2滴于六凹
反应盘中，加1滴
I2-KI溶液，如果
完全不显蓝色，
即可进行下面的
操作。
再加12ml蒸馏水，5ml 6mol/L HCl
沸水浴，30min (不时搅拌)
冷却至室温
用6mol/L NaOH调pH7.0（ pH试纸）
蒸馏水定容至100ml,混匀
滤纸过滤，取5ml滤液用蒸馏水定容至50ml，
成稀释1000倍的总糖水解液，混匀,取1ml总
糖水解液，测定其还原糖的含量
3、制作葡萄糖标准曲线及还原糖、总糖
含量的测定。
取8支洁净的试管，分别用记号笔标上0～
7号，按照下表进行操作。其中0～5管，用于
标准曲线的制作,以吸光度为纵坐标，各标准
液浓度（mg/ml）为横坐标作图得标准曲线
（用Excel表制作）。
管号
0
1
2
3
4
5
6
7
标准葡萄糖溶液
/ml
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.0
1.0
蒸馏水/ml
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
0
DNS试剂/ml
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
试剂
沸水浴中准确煮沸5min，取出，用自来水冷却至室温
蒸馏水/ml
9.0
9.0
9.0
9.0
9.0
9.0
葡萄糖含量/mg
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
A540nm
9.0
9.0
C1
C2
a
b
六、计算
C1V1
ω(还原糖)=——×100%
m1
C2V2
ω(总糖)=——×0.9×100%
m2
附：相关仪器使用
1、移液管的使用
2、移液器的使用
3、离心机的使用
注意配平，对称放
4、V-1100可见分光光度计的使用
比色皿
V-1100可见分光光度计
开机预热30min
 测吸光度
选择波长（540nm）
MODE键切换到T，将黑体放入光路中
合上盖，0键校零
MODE键切换到A，参比液放入到光路中
合上盖，100键调零
将待测液依次放入到光路中，即可得出
待测液的吸光度。
 比色皿的使用