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2010.9 实验一、生物化学实验技术简介 1 生化实验目的 • 掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、 纯化和测定技术的原理及方法； • 掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实验 技能； • 培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学作 风、创新能力等综合素质。 2 通过生物化学实验应该做到 • 学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的 基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地 安排实验步骤和时间。 • 训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物 化学实验仪器。 • 学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提 高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所 有的实验。 • 掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术， 为今后参加科研工作打下坚实的基础。 3 生物化学实验技术发展简史 该学科的发展与实验技术的发展密切相关，每一 种新的生化物质的发现与研究都离不开实验技 术，实验技术每一次新的发明都大大推动了生物 化学研究的进展，因而对于每一位现代生物科学 工作者，尤其是生物化学工作者，学习并掌握各 种生物化学实验技术就是极为重要的。 • 生物化学的发展大体可分为3个阶段 • 静态的描述性阶段、动态生化阶段、生物大分子 结构功能研究阶段 4 实验准备 4.1预习实验 • 熟悉本次实验的目的、原理、操作步骤，懂得每 一操作步骤的意义和了解所用仪器的使用方法， 否则不能开始实验。每次实验前需写好预习报 告。 4.2 仪器的清洗 （P281） 玻璃仪器→用洗洁精或洗衣粉（有时需用废 乙醇等有机溶剂）洗→用自来水冲洗→用 少量蒸馏水荡洗→自然风干或放入低温干 燥 比色皿→用自来水冲洗（必要时放入洗洁精 等）→用蒸馏水冲洗→放入有酒精的烧杯 中泡一宿（去除有机物）→用清水冲干净 →蒸馏水荡洗→倒扣在纸上晾干备用 5 玻璃仪器的使用 •6 离心机 6.1 离心事故 • 离心机转头损坏的原因 （操作或使用不当所造成 的） 过速 不平衡 腐蚀 金属疲劳 6.2 离心设备 • 依转速大小分为：小于6000rpm的低速离心 机、小于25000rpm的高速离心机、超过 30000rpm的超速离心机等。 • 依用途分为：分析离心机、制备离心机 • 依用途还可分为：冷冻离心机、非冷冻离心机 6.3 离心机相关基本概念 • 原理：利用转头旋转产生的离心惯性力， 把物理性质（如质量、浮力、沉降系数等） 不同的悬浮液内微粒进行分离。 • 转速RPM 转/分 –离心机的最高转速 –转头的最高转速 –转头的最高允许转速 –转头的允许转速 离心力和相对离心力 • 离心力=粒子质量×离心加速度 （F离心力=m×r ω 2） ω指角速度（弧度/秒，rad/s） 相对离心力RCF= F离心力/F重力= r ω 2/g –g≈980 cm/s2 • 低速离心机常以n转速表示，高速离心机常以RCF 表示。RCF与转速之间的互换常以列线计算图 （RCF n r）来求出。有的离心机上同时显示n 和 RCF • 沉降系数S：单位离以力作用下颗粒的沉 降速度。 • 沉降速度ν：在离心作用下单位时间内 运动的距离。 • 分离时间t：待分离颗粒在悬浮液中形成 沉淀所需要的时间。最高转速下t=K/S –非最高转速下t=K*(最高离心速度/所需离 心速度）^2/S –K为K因子，离心机在最高转速时每个转头 的离心效力，与最大最小直径为关。 6.4 离心机的操作规程（安亭） • • • • • • • • • • • 插上电源，待机指示灯亮，打开电源开关，同时可开启盖门，超过5秒钟，电子门锁又 自动锁门，若要开启盖门，必须按面板上的电源开关的关键，再按开键，5秒钟内用手 开启盖门，调速与定时系统的数码管显示的闪烁数字为机器工作转速的出厂设定，温 控系统的数码管显示此时离心腔的温度 将样品等量放置在试管内,并将其对称放入转头 拧紧转轴螺母,盖好盖门 设定温度：按功能键 ，显示离心机上限工作温度出厂设定，此时可用◀键和▲或▼ 键相结合调整该参数至需要的值，按功能键 ，显示离心机下限工作温度出厂设 定，此时可用◀键和▲或▼键相结合调整该参数至需要的值，再按一次功能键，数码管 即显示离心腔的温度，此时若按“T”键，温控仪将按照设定的工作温度自行控制压缩 机的运行 注：设定温度时，上限设定值必须大于下限设定值2℃,否则，温控仪就以2℃作为上下 限温度的实际差值 设定运转速度和运转时间：可按功能键 ，显示CD00，按◀键和▲或▼键使显示为 CD47，再按功能键 ，显示离心机的工作转速的出厂设定，按◀键和▲或▼键，使显 示为所需的转速频率，按 将设定值存储设定完毕,呈现待机状态,再按功能键, 显 示CD00，按◀键和▲或▼键使显示为CD59，再按功能键 ，显示离心机的工作时间的 出厂设定，按◀键和▲或▼键，使显示为所需的运转时间，按 将设定值存储设定完 毕,呈现待机状态 注:转速=频率*60 仪器上显示的是频率 设定时间时,数码管显示0.20表示运转时间为20分钟,显示1.20表示运转时间为1 小时 20 分钟, 离心机一次运行最好不要超过60min 按运转键 启动仪器 运转结束,按控制面板上的停止键,数码管显示dcdt,同时可以打开盖门，如3秒内未把 门打开，必须按面板上的电源开关的关键，再按开键，5秒钟内用手开启盖门,数秒钟 后,显示闪烁转速值,这时机器已准备好下一次工作. 6.5 离心机和转头保养注意事项 • • • • 清洁离心机腔体和转头，并擦干腔内冷凝水 使用完后要打开门，直至腔内恢复常温 离心之前要平衡样品：使用电子天平或托盘天平 根据需要选用tubes/bottles、adapters 以及 spacers，根据要求加样品量 • 必要时预冷转子 • 使用前一定要阅读说明书或操作规程 7 分光光度计 7.1 原理 光线的本质是电磁波的一种，有不同的波长。肉眼可见的 彩色光称为可见光，波长范围在400～750nm：小于400nm 的光线称为紫外光；大于750nm的光线称为红外光。 • 当光线通过透明溶液介质时，其辐射的波长有一部分被吸 收，一部分透过、因此光线射出溶液之后，部分光波减少， 这种光波的吸收和透过可用于某些物质的定性定量分析。 • I0 = Ia + It + I r I0 = Ia + It • 入射光强度为I0，吸收光强度为Ia,透射光强度为 It，反 射光强度为Ir 7.2 概念 • 透光度：透光度为透过光的强度It与入射光 强度I0之比，用T表示： • 即 T= It/I0 • 吸光度: 为透光度倒数的对数，用A表示 • 即 A=lg(1/T)=lg(I0/It)=-lgT • 朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有 吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光 物质浓度、液层厚度乘积成正比，即 • A= κ cl • 式中比例常数κ与吸光物质的本性，入 射光波长及温度等因素有关。c为吸光物质浓 度，l为透光液层厚度。 7.3 紫外可见分光光度计类型 按波长范围划分： 可见分光光度计（400780nm） 紫外可见分光光度计(2001000nm) 按光路划分： 单光束分光光度计 双光束分光光度计 双波长分光光度计 光路 单光束分光 光度计 双波长分光 光度计 双光束分光 光度计 7.4 组 成 结 构 光源 单色器 吸收池 检测器 信号显示系统 1 光源 在紫外可见分光光度计 中，常用的光源有两类：热 辐射光源和气体放电光源 热辐射光源用于可见光 区，如钨灯和卤钨灯；气体 放电光源用于紫外光区，如 氢灯和氘灯。要求：在整个 紫外光区或可见光谱区可以 发射连续光谱， 具有足够的 辐射强度、较好的稳定性、 较长的使用寿命。 紫外---氘灯(185-375 nm) 可见---钨灯(320-1000nm) 2 单色器 聚光镜 单色器的主要组 成：入射狭缝、出 射狭缝、色散元件 和准直镜等部分。 单色器质量的优 劣，主要决定于色 散元件的质量。色 散元件常用棱镜和 光栅。 反射镜 狭缝 聚狭缝 准直镜 光栅 3 吸收池 吸收池又称比色皿或比色杯，按材 料可分为玻璃吸收池和石英吸收池（标Q 和S的都是石英的） ，前者不能用于紫 外区，因其在紫外吸收一些光。吸收池 的种类很多，其光径可在0.1~10cm之间， 其中以1cm光径吸收池最为常用。 注意事项：手执两侧的毛面，盛放 液体高度四分之三。 4 检测器 检测器的作用是检测光信号，并将 光信号转变为电信号。现今使用的分光 光度计大多采用光电管或光电倍增管作 为检测器。 5 信号显示系统 常用的信号显示装置有直读检流计， 电位调节指零装置，以及自动记录和数 字显示装置等。 7.5 波长的选择 • 由于溶液对光的选择性吸收引起的，溶液呈现的是被吸收 物质的互补色。可通过测定溶液的吸收光谱曲线，找到最 大吸收峰及较适合的波长。 7.6 操作规程 • • • • • • • • • • • • • • • • 开启电源：预热30min 用“功能”键设置测试方式：透射比（T）、吸光度（A） 注：如要测浓度（C）或斜率（F）时，测试方式在此调为A 用波长选择旋钮设置您所需的分析波长 注：波长改变需调仪器的0%，调节方法为：将0%T校具（黑体）置入光路中，盖上样品室盖，按 “功能”键，将测试模式转换在T方式下，按“0%T”键，此时显示器显示“000.0”T后取出黑体 将您的参比样品溶液和被测样品溶液分别倒入比色皿中，样品液面高度大于25mm 打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，再盖上样品室盖 注：比色皿透光部分表面不能有指印、溶液痕迹，被测溶液中不能有气泡、悬浮物，否则影响 样品测试的精度 将参比样品推（拉）入光路中，盖上样品室盖，按“OABS/100%T”此时显示器显示由“BLA”到 “100.0%T”或“0.000A”为止，调功能键为所需的T、A、C、F 注：如果测C，需将标准样品推或拉入光路中，按“上升”或“下降”键，将已知样品的浓度值 输入仪器，直至显示器显示您所需的样品浓度值，按“确认”键 如果已知样品的斜率F时，需将标准样品推或拉入光路中，按“上升”或“下降”键，将已知样 品的斜率值输入仪器，直至显示器显示您所需的样品斜率值，按“确认”键，此时指示灯自动 指向C 将被测样品推或拉入光路中，这时，可从显示器上得到被测样品的透射比值或吸光度值或浓度 值 结束后，关闭仪器电源开关，切断电源 性能指标：波长精度：±2.0nm 波长重复性：≤1nm 波长范围：325～1000nm 透射比准确度：±1%T 光度范围 0-100%T -0.097-2.000A 0-1999C 光源：钨卤素灯 6V/10W 7.7 标准曲线的制定 先配制一系列已知不同浓度的测定物溶液，按测 定管同样方法处理显色，分别读取各管吸光度， 以各管吸光度为横座标，各管深夜浓度为纵座标 ，在Excell上作图得标准曲线。 一般认为，标准曲线范围在测定物浓度的一半到 二倍之间，并使吸光度在0.05~1.0范围内为宜。 所作标准曲线仅供短期使用。 标准曲线制定和物质浓度测定应尽量在同一台仪 器上操作，因为即使是同样型号的仪器，因不是 同一台仪器，结果也存在误差。 • 比色皿的校核 • 将两只石英比色皿编号标记，装入蒸馏水，在一 定吸收波长处比较两只比色皿的透光率。以透光 率最大的比色皿为100﹪透光，测定另一只比色 皿的透光率，换算成吸光度作为它的校正值。测 定溶液时，以那只透光率最大的比色皿作空白， 另一只比色皿装待测溶液，测定的吸光度减去其 校正值。 • 下学期要涉及的仪器 电泳装置 • 主要用于分析、鉴定，也可用于制备。电 泳装置由电源和电泳槽两部分组成. 层析装置 • 主要的层析技术有：吸附层析、凝胶排阻 层析、离子交换层析和亲和层析等。 8 本学期实验安排 实验学时数：32学时 1）生物化学实验技术简介 2）鸡蛋清中蛋白质的颜色反应及分别利用双缩脲法、 考马斯亮蓝法测定其蛋白质浓度 3）蛋白质的沉淀反应 4）酵母RNA的提取RNA的定量测定 5）植物组织中总糖和还原性糖含量的测定 6）酵母醇脱氢酶的提纯 7）实验考查（生化实验一） 9 实验记录与实验报告 实验前写好实验预习报告(钢笔和园珠笔)。 实验中应及时准确地记录(事先在记录纸上 设计好各种记录格式和表格）所观察到的现 象和测量的数据。 实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为 “0.050”，而不能记成“0.05”。每个结果 都要尽可能重复观测二次以上，即使观测的 数据相同或偏差很大，也都应如实记录，不 得涂改。 实验报告的格式应为： ⑴ 实验目的； ⑵ 实验原理； ⑶ 仪器、材料和试剂； ⑷ 实验步骤； ⑸ 结果讨论（含数理据处）； ⑹ 注意事项; (7) 思考题 注意：实验结果的讨论要充分，尽可能多查阅一 些有关的文献和教科书，充分运用己学过的知 识和生物化学原理，进行深入的探讨，勇于提 出自己独到的分析和见解，并欢迎对实验提出 改进意见。 10 考核方法 实验过程表现成绩、实验报告成绩，各占50%，占生 化实验（一）总成绩的60%。 • 实验过程表现成绩：包括学习态度是否认真、实 验预习、课堂回答问题情况、实验操作是否正确 规范、实验结果是否正确、是否具有创新意识、 打扫卫生等方面。 • 实验报告成绩：包括实验报告的格式是否正确、 原理是否论述清楚、实验结果分析讨论是否符合 逻辑，报告字迹是否清楚等方面。 实验考查成绩：占总实验成绩40% 11、其它要求 • 按时上课，不能迟到； • 做实验看好自己的仪器设备，不去动其它组的仪器设备， 保持整洁； • 实验时注意安全； • 使用仪器时要注意操作规程，用完需清理仪器并在使用记 录本上登记； • 实验做完，需要老师在原始数据处签字，清洗好仪器，整 理好桌面后方可离开； • 按时交实验报告，周四、周一。 • 值日生：清理用过的仪器，包括天平、分光光度计、离心 机等；清理桌面；清理地面；擦黑板；倒垃圾。 12 实验操作 1)依下表配制溶液 2）在600nm处测定吸收值 3）作标准曲线 4）清理仪器设备 序号 0 1 2 3 标准溶液mL 0 1 3 5 自来水mL 5 4 2 0 浓度mL/L 0 0.8 2.4 4 作业 • • • • 标准曲线 看生化实验书P279-294 写实验报告 预习实验29、30、32 实验二、蛋白质的颜色反应及含量 测定 一、实验目的 • 1.1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要 连接方式。 • 1.2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原 理。 • 1.3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的 方法。 • 1.4、学习考马斯亮蓝法、双缩脲法测定蛋白 质浓度的原理和方法 实验三、蛋白质的沉淀反应 1、实验目的 • 熟悉蛋白质的沉淀反应 • 进一步掌握蛋白质的性质 2、实验难点与重点 • 2.1蛋白质沉淀的方法有哪些 • 2.2蛋白质沉淀反应的原理 3、实验原理 • 蛋白质胶体溶液稳定的因素:水化膜、表面电荷 • 加入适当试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水 化层，或者与某些试剂结合成不解的盐后，蛋白质的 胶体溶液就不稳定，并将产生沉淀。 • 改变蛋白质表面的水化层及电荷的主要途 径有： –改变溶液的离子强度 –改变溶液的pH –改变溶液的介电常数 –改变溶液的温度 • 蛋白质沉淀可逆与不可逆的区别 • 能使蛋白质沉淀的试剂有： 高浓度中性盐 （NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl（中和蛋白质的电荷，可逆） 这种加入盐使蛋白质沉淀析出的现象称为盐析，用于蛋白质分 离制备 有机溶剂 丙酮、乙醇 (破坏蛋白质水膜，用于在提取DNA等时去除蛋 白质，冰浴条件沉淀蛋白质短时间内是可逆的，否则不可逆) 重金属盐 Hg2+、Ag+、Pb+ （与蛋白质中带负电荷时，形成不易溶解的盐, 或改变蛋白质的空间结构） 生物碱试剂沉淀：三氯乙酸，苦味酸，钨酸等（必须在溶液pH 大于pI时，蛋白质带正电荷，可以与生物碱试剂结合） 加热变性沉淀：豆腐 等电点沉淀：Glu的生产 实验四、酵母RNA的提取 1、实验目的 • 1、掌握稀碱法提取RNA的原理和方 法 • 2、学习和了解其它提取RNA的方法 和原理 2、实验重点和难点 • 离心机的使用 • 提取RNA的实验原理 3、实验原理 • 一般的生物细胞中同时含有DNA和RNA，在酵 母中RNA比DNA的含量高得多， RNA（2.67～ 10.0%），DNA则少于2％(O.03％～O.516 ％)，在实验室常用酵母作为RNA提取的材 料。若要制备具有生物活性的RNA，可采用苯 酚法、去污剂法和盐酸胍法等，最常用的是 苯酚法提取RNA；若对生物活性没有要求，则 可使用浓盐法，稀碱法等。工业中用稀碱法 或浓盐法，主要用于制备核苷酸的原料. • 苯酚法：组织匀浆用苯酚处理并离心后， RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和 蛋白质则留在酚层中，向水层加入乙醇后， RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好地 除去DNA和蛋白质。 • 浓盐法：在加热的条件下，利用高浓度的 盐改变细胞膜的透性，使RNA 释放出来， 再利用等电点（pH为2.0～2.5）沉淀。此 法易掌握，产品颜色较好。盐浓度需要控 制，太低，RNA不易从细胞中释放出来，太 高，细胞急剧收缩不利于抽提。一般80～ 120g/L为宜。 • 稀碱法：利用细胞壁在稀碱条件下溶解， 使RNA释放出来，这种方法提取时间短， 但RNA 在稀碱条件下不稳定，容易被碱 分解； • 本实验采用的稀碱，既可加速细胞的破 裂，又可增大 RNA的溶解度。当碱被中 和后，可用乙醇(或者异丙醇）将RNA沉 淀，或用等电点沉淀RNA(应严格控制pH, 缓慢调),此为 RNA的粗品。 实验五、RNA的定量测定 ——苔黑酚法（地衣酚） 1、实验目的 • 掌握苔黑酚法测定RNA含量的方法 2、重点与难点 • 实验原理 • 利用分光光度计测浓度时，对照的选择 3、苔黑酚法原理 • 从化学组成来说，RNA由碱基、磷酸和戊糖组成。在酸性条件 下，戊糖转化成糠醛，其可与苔黑酚生成绿色复合物，反应 如下： • 这种复合物在670 nm波长处有最大光吸收。当RNA的浓度10～ 100ug／ml范围内，其浓度与光密度值成线性关系。样品中少 量脱氧核糖核酸(DNA)存在对测定无干扰，蛋白质、粘多糖在 含量高时会干扰测定。 4、实验操作 4.1．标准曲线的制作 取6支试管，按下表1编号加入试剂。 表l.制作RNA标准曲线时各试剂用量 RNA标准液(m1) 蒸馏水(m1) 苔黑酚试剂(m1) 浓度（ug/mL） A670nm 0 1 2 3 4 5 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 0 20 40 60 80 100 试剂加完后，摇匀，置沸水浴中煮45min。冷却后， 在670 nm波长处测各管光密度值。以A670为横坐标， 每管标准液浓度为纵坐标，绘制标准曲线。 4.2．样品中RNA的测定 取1支试管，加入2.Oml样品液，再加2.0ml苔黑酚 试剂，按标准曲线制作方法，测得吸光度值后，折算 成浓度。 注：样品液即上次实验提取的酵母RNA。 5、本方法的干扰物及其去除方法 (1)戊糖或含戊糖的物质对本法有干扰；某些己糖 也对本法有干扰（糖经浓无机酸脱水产生糠醛或糠醛衍 生物，在浓无机酸作用下，与苯酚生成缩合物）；去除 方法为，低浓度乙醇沉淀法和醋酸钾沉淀法，提高缓冲 液中NaCl浓度也可；在高浓度钠钾盐中，通过苯酚-氯 仿抽提可去除一些多糖（实际是去除糖蛋白）；用LiCl 沉淀RNA，可将部分多糖留在上清液中。 (2)因不同时期酵母RNA含量有所变化，若样品光密 度值均不在标准曲线范围，可减少加样品液量或增加 RNA粗品溶液的浓度。 (3) 样品中蛋白质含量高时,应先用5%三氯乙酸溶 液沉淀蛋白质后再测定. (4) 微量DNA无影响,较多DNA存在时,有干扰作用, 如在试剂中加入适量CuCl2·2H2O可减少DNA的干扰,甚至 某些已糖在持续加热后生成的羟甲基糖醛也能与地衣 酚反应,产生显色复合物.此外,利用RNA和DNA显色复合 物的最大吸收不同,且在不同时间显示最大色度加以区 分,反应2min后,DNA在600nm显示最大吸收,而RNA在反 应15min后,在670nm下呈现最大吸收. （5）苔黑酚-三氯化铁试剂需临用时配制，由于试 剂中有浓盐酸，反应时 需加盖保险膜，防止盐酸挥 发。 6、原始数据 管号 A670nm 0 1 2 3 4 5 样液 （上次实验 保存样品） 7、数据处理 • 7.1、标准曲线 • 7.2、样液的浓度 • 7.3、 样品浓度 样液体积106 粗品中RNA含量 100% 0.1 • 7.4、 粗品中RNA含量 粗品重量 酵母中RNA含量 100% 5 8、问题 • 利用本法测定RNA的灵敏度高，但特异性差， 有哪些干扰因素？如何排除？ • 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱 和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水 解，从水解液中可以测出上述组分的 存在。 核酸 水 核苷酸 解 磷酸 核苷 戊糖 碱基 • （1）嘌呤碱与硝酸银作用产生白色的嘌 呤银化合物沉淀。 • （2）磷酸与钼酸铵试剂作用产生黄色的 磷钼酸铵沉淀[(NH4)3PO4·12MoO3↓],有还 原剂存在时，形成蓝色钼蓝。 • (NH4)MoO4+H2SO4 H2MoO4+(NH4) 2SO4 • H3PO4+12H2MoO4 H3P(Mo3O10) 4+12H2O • H3P(Mo3O10) Vit • C 4 Mo2O3 • MoO3（钼蓝） • 还原产物钼蓝在波长660nm测定吸光值，当 无机磷含量在1—25μg 范围内，光吸收和 含磷量成正比。 • RNA的含磷量为9.5%，即1μg RNA磷 相当于10.5 μg RNA。DNA的含磷量平均为 9.9%。 • （3）地衣酚(苔黑酚）显色法：RNA与酸共 热时降解，形成戊糖，继而形成糠醛（α呋喃甲醛），糠醛与地衣酚（3，5-二羟基 甲苯）反应，形成鲜绿色复合物，可用比 色法测定。当 核糖核酸浓度在 10～ 100μg/ml 范围内，其浓度与吸光度成线 性关系需要FeCl3或Cu2+作催化剂。 4、实验操作 (一)RNA的提取 （1）称5g干酵母粉于锥形瓶中，加25ml O.2％的 NaOH，沸水 浴中搅拌提取20 min。冷却后滴加乙酸使其略偏酸性，pH约5-6， 目的是去除蛋白质。 （2）离心(4000r／min，15 min)，取上清液冰浴，向上清液中 加入两倍体积（约20 ml ）95％乙醇，稍搅拌后冰浴静置约 10min，目的是沉淀RNA。 （3）离心(4000r／min，15 min) ，弃去上清液。沉淀用95％ 乙醇洗2次（如沉淀浮起需再次离心），每次约5mL；用乙醚洗1 次，约5mL。目的是去除脂溶性物质和水，乙醚的沸点比乙醇的 低，所以最后加乙醚有利于沉淀的干燥。 （4）取0.1g沉淀，用蒸馏水溶解定容至100ml，用于下次RNA的 定量测定； 其余沉淀，加10ml 10％H2SO4→沸水浴中加热5-10min水解，用 于以下RNA的性质鉴定。 (二)RNA的性质鉴定 （5）嘌呤碱 取水解液2mL加入2mL浓氨水，然后加入约1mL 5% 硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。（慢慢加入嘌 呤碱时，沉淀上浮，摇匀，沉淀下沉）。 （6）核糖 取1支试管加入水解液0.5mL、1mL苔黑酚三氯化铁 浓盐酸溶液。放沸水浴中2分钟。注意溶液是否变成绿色，说明 核糖的存在。时间久了会有黑色沉淀，是浓度高，产物结晶出 来了。 5、注意事项 • 避开磷酸二酯酶和磷酸单酯酶作用的温度范围 20～70℃，防止RNA 降解。在90～100℃条件下加 热可使蛋白质变性，破坏磷酸二酯酶和磷酸单酯 酶，有利于RNA 的提取。 • 在调pH 值时，一定要缓慢小心，且要在低温下进 行。 • 在洗涤时，要用乙醇洗涤，且不可用水洗，否则 将导致RNA 部分溶解而造成损失，降低RNA 提取 率。 • 提取 RNA 时必须用沸水浴，并经常搅拌，NaOH 必 须实现预热。 • 用乙酸调 pH5～6 必须有，目的可以除去一些杂质。 • 最后过滤前必须将乙醇沥干，不能带水，否则 RNA 会粘在滤纸上， 无法取下。也可以采用离心的方 法。 • 所得 RNA 粗品应是浅黄色粉末状。 6、原始数据 • 记录实验过程中的现象 7、讨论 • 7.1、用稀碱法提取酵母RNA的过程中需注 意什么？ • 7.2、鉴定RNA的原理？ 需要先加蛋白质溶液，再加饱和 硫酸铵，否则清蛋白与球蛋 白会同时析出 4、实验步骤 蛋白质溶液5 ml 微微摇动，静置数分钟 加入 观察沉淀产生为球蛋白 加入5 ml 饱和硫酸铵溶液 沉淀是否溶解？ 过 滤 除去球蛋白 操作注意点： 如加入硫酸铵 粉沫过量，会 有硫酸铵晶体 出现，要与蛋 白质沉淀区分 开来。 析出清蛋白，加水 滤液中加硫酸铵粉末 蛋白质溶液1ml 混匀 加入 观察沉淀产生 NaCl晶体少许，溶解，95%乙醇2ml 加多变成盐析，作 用中和电荷， 加速沉淀 加 水 沉淀是否溶解？ pH大于pI 加水 蛋白质溶液2 ml 加入 沉淀是否溶解？ 加入1%醋酸铅，至有沉淀出现 加水 蛋白质溶液2 ml 加入 沉淀是否溶解？ 加入1%硫酸酮，至有沉淀出现 蛋白质溶液2 ml 加入 沉淀是否溶解？ 沉淀？ 加入1%醋酸4-5滴，加入5%鞣酸数滴 蛋白质溶液2 ml 加入 加水 混匀 加水 混匀 沉淀？ 加入1%醋酸4-5滴，加入饱和苦味酸数滴 pH小于pI时带 正电荷 沉淀是否溶解？ 5、原始数据 管号 是否产生 沉淀 沉淀是否 能溶解 1 2 3 4 5 6 6、问题 • 6.1、蛋白质发生沉淀的主要原因是什么？ 何谓可逆沉淀和不可逆沉淀？蛋白质变性 一定沉淀？沉淀蛋白质一定是变性的吗？ 为什么？ • 6.2、蛋白质的沉淀反应有何用途？ 二、实验重点难点 • 2.1、双缩脲反应及茚三酮反应的实验原理 • 2.2、对于双缩脲反应中碱和硫酸铜的添加 顺序 • 2.3、茚三酮反应中颜色变化过程 • 2.4、测定蛋白质含量的实验原理、标准曲 线制定 三、实验原理 • 3.1、概括 • 蛋白质(Protein)是由 许多不同的氨基酸，按 照一定的顺序，通过肽 H2N 键连接而成的一条或多 条肽链构成的生物大分 子。 • 氨基酸的基本结构为： • 蛋白质的主要连接方式 为： COOH C R 不变部分 H 可变部分 3.2 蛋白质与氨基酸的颜色反应总结 反应名称 反应基团 反应操作 反应产物及现 象 用途 双缩脲反应 肽键 NaOH及CuSO4 1ml样 +2ml0%NaOH+2d CuSO4 Cu –Cu—双缩 脲络合物（兰 紫色） 测蛋白质含量 鉴定蛋白质水解 是否完全 茚三酮反应 α-氨基酸 0.5ml茚三酮试剂+1ml 样 兰紫色 测AA含量检验AA 及蛋白质 黄色反应 苯环、Trp、 Tyr 1ml样+3~4d浓HNO3 观 察再加NaOH，再观察 黄色硝醌酸生 成 鉴定Trp、Tyr 坂口反应 胍基 样 1ml+5d15%NaOH+2d1% α-萘酚+6d次溴酸钠 玫瑰红色产物 生成 鉴定Arg 测定 Arg含量 乙醛酸反应 吲哚环 样1ml+2ml冰乙酸+浓 HSO4 (沿壁且不能混 匀)微热 中间生成兰紫 色环 鉴定Trp 偶氮反应 咪唑基 样1ml+偶氮试剂 与 20%NaOH1ml 有橙色和鲜红 色产物 生成 鉴定His、Tyr 醋酸铅反应 巯基、CyS CySH 0.5%Pb(AC)2+10%NaOH +1ml样+加热后再加 HCl闻其味 黑色PbS生成 臭鸡蛋味 鉴定含硫AA CyS、 CySH 3.3、双缩脲反应 双缩脲能够与碱性硫酸铜作用，产生兰色 的铜-双缩脲络合物，称为双缩脲反应。 在一定浓度范围内，反应后颜色深浅与蛋 白质含量呈线性关系。蛋白质浓度越高， 体系的颜色越深。反应产物在540nm处有 最大光吸收。 NH2 NH2 ¼ÓÈÈ O=C + C=O O=C NH2 NH NH2 + NH3 O=C NH2 ÄòËØ 含有两个以上肽键的多肽，具有与双缩脲 相似的结构特点，也能发生双缩脲反应， 生成紫红色或蓝紫色络合物。 Ë«Ëõëå OH NH O=C +CuSO4 NH2 Cu NaOH O=C O=C NH NH O=C NH2 OH NH2 NH2 O=C 这是多肽定量测定的重要反应。但有双缩 脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。 含有一个肽键和一个—CS—NH2，—CH2— NH2，—CRH—NH2，—CH2—NH2—CHNH2— CH2OH或—CHOHCH2NH2等基团的物质也有此 反应。NH3干扰此反应，因为NH3与Cu2+可生 成暗蓝色的络离子Cu（NH3）42+。 NH2 Na H2N O=C Na OH Í- -ÄÆ -Ë«ËõëåÂçºÏ Îï NH2 OH • 双缩脲法测蛋白质浓度操作简便、迅速， 蛋白质浓度与光密度的线性关系好，是蛋 白质浓度分析的常用方法之一，但本法缺 点是灵敏度低，蛋白质量须在1-20mg/mL测 定结果较准确。在需要快速、但准确性要 求不高的测定中常用此法。 3.4、茚三酮反应 茚三酮反应，即：所有氨基酸及具有游离α-氨基的肽与茚三酮反应都产生蓝 紫色物质，只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质。在570nm波长 下进行比色就可测定样品中氨基酸的含量，也可以在分离氨基酸时作为显色 剂对氨基酸进行定性或定量分析。在多肽合成中常用来检验有无自由氨基的 肽类存在.β-丙氨酸、氨、许多一级胺呈正反应。 在法医学上，使用茚三酮反应可采集嫌疑犯在犯罪现场留下来的指纹。因为 手汗中含有多种氨基酸，遇茚三酮后起显色反应。 O O C 茚三酮 C O C H2O C H2O C C O C C C HCOOH R 水合茚三酮 C C O 茚三酮 水合茚三酮 O H + RCHO + NH3 + C O 2 OH C C O 还原茚三酮 - HO O + 2NH3 + H + O NH4 O O O C OH O O OH C + H2 N OH C O OH C C C C C C O 还原茚三酮 N + 2H2O C C C O O 篮紫色化合物 3.5、米伦氏反应（Millon反应） 苯酚及某些二羟苯衍生物中加入米伦试剂(硝酸、亚 硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物)后产生白色沉淀， 可能是羟苯之亚硝基衍生物，经变位作用变成颜色更 深的邻醌肟，最终得具有稳定红色的产物。含有酚基 的化合物都有这个反应，故酪氨酸及含有酪氨酸的蛋 白质都能与米伦试剂反应。（溶液中不能含有大量无 机盐、H2O2 、醇或碱，因它们能使汞变成沉淀，中和 碱时不能用HCl） OH OH + HO-N+O + H2O O=N ÑÇ Ïõ »ùÑÜ ÉúÎï ±½·Ó (Z) ¹¯ ÑÎ OH ºì É« O(E) N=O ÑÇ Ïõ »ùÑÜ ÉúÎï (Z) N-OH ÁÚ õ«ë ¿ 3.6、黄色反应 • 含有苯环结构的氨基酸，如酪 氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可 被硝化成黄色物质，该化合物 在碱性溶液中进一步形成橘黄 色的硝醌酸钠。多数蛋白质分 子含有带苯环的氨基酸，所以 有黄色反应，苯丙氨酸不易硝 化，需加入少量浓硫酸才有黄 色反应。 • 例如皮肤、指甲、毛发等遇浓 硝酸变黄。 OH OH + H2O + HNO3 NO2 »Æ É« OH OH (Z) + NaOH (Z) (E) NO2 NOH O Ïõ õ«Ëá 3.7 常用测定蛋白质浓度的方法 • 凯氏定氮法：样品与浓硫酸共热，含氮有机物即分解产生氨（消化），氨与 硫酸作用，变成硫酸铵。经强碱碱化使硫酸铵分解出氨，借蒸汽将氨蒸至酸 液中，根据酸液被中和的程度计算含氮量。*6.25得蛋白质量 • 双缩脲法：具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，因此蛋白质 在碱性溶液中，也能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正 比，故可以用来测定蛋白质的浓度。 • Folin-酚试剂法（lowry法）（福林-酚试剂法）：Tyr和Try能与福林—酚试 剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比 • 紫外吸收法： Tyr和Try在280nm处有最大吸收峰 • BCA法：在碱性溶液中，蛋白质将Cu2+还原成Cu+，Cu+与测定试剂中BCA（二 喹啉甲酸）作用形成紫红色的复合物，在562nm处具有最大吸收峰。 • 考马斯亮蓝法：当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大吸收峰在595nm。考马 斯亮蓝能与蛋白质的疏水区结合，这种结合具有高敏感性。 • 甲醛滴定法：水溶液中氨基酸为两性离子，不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。 用甲醛处理氨基酸，甲醛与氨基结合，形成-NH-CH2OH –N(CH2-OH)2等羟甲 基衍生物，NH3+上的H+游离出来，这样就可用碱滴定NH3+放出的H+，测出氨 基氮，从而算氨基酸的含量。缺点：不能滴定多种氨基酸的混合物、不能滴 定pro、phe.优点：可确定蛋白质的水解程度，随着水解程度的增加，滴定 值增加。 3.8、考马斯亮蓝法 • 考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250） 染料，在游离状态下（G-250的磷酸溶液）溶液呈棕红色， 最大吸收峰在465nm处。 – 考马斯亮蓝G-250溶于醇和热水，微溶于冷水；考马斯亮蓝又称弱 酸性艳蓝6B，酸性条件下为红色，配成的贮备液是绿色，但调整 溶液的酸度就会成为红色。一般R250用于染蛋白，G250一般测蛋 白浓度，也可染胶，敏感性更高，但较慢脱色， R250较敏感，染 色后为红蓝色 • 当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大吸收峰在595nm。考 马斯亮蓝能与蛋白质的疏水区结合，这种结合具有高敏感 性。 • 蛋白质含量在0-100μg范围内，蛋白质-色素结合物符 合比尔定律，在595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比， 故可用比色法进行定量分析。 • 考马斯亮蓝G-250法（Bradford法）是比色法与色素法 相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好， 是一种较好的蛋白质常用分析方法。 O CH 2CH 3 Coomassie G-250 NH PROTEIN + CH 3 + CH 3CH 2 N CH 2 C CH 3 N CH 2CH 3 CH 2 SO3- BLUE Amax = 595nm Protein - Dye Complex SO3Na Acid 使氨放尽 4、实验步骤 尿素结晶 约1g 试管壁有白色 沉淀时停止加 热，冷却 加热 加10%氢氧化钠溶液 约1ml 形成双缩脲， 酒精灯 用试纸试显 蓝色 摇匀 再振荡 观察出现的颜色（粉红） 产生 Cu(OH)2 卵清蛋白 10滴 加10%氢氧化钠溶液 约1ml 摇匀 再加1%硫酸铜 溶液2滴 再加1%硫酸铜 溶液2滴 再振荡 观察出现的颜色 （紫玫瑰色带蓝） 5滴1% 硫酸铜 观察出现的颜色 （紫玫瑰色） 注：1、摇匀；2、：硫酸铜不能多加，否则将产生蓝色的Cu(OH)2。此外在碱溶液中氨或铵盐 与铜盐作用生成深蓝色的络离子Cu(NH3)42+，妨碍此颜色反应的观察；3、需先加NaOH，再 加CuSO4，否则将产生蓝色的Cu(OH)2 卵清蛋白 10滴 观察出现的颜色 （紫玫瑰色带蓝） 摇匀 加1%硫酸铜溶液2滴 5滴1% 硫酸铜 再加10%氢氧化 钠溶液约1ml 再振荡 观察出现的颜色 （较深的蓝紫色） • 茚三酮反应：取1支试管加入卵清蛋白10滴，再加10滴 0.1%茚三酮水溶液，混匀，在酒精灯上加热，观察颜色由 透明到乳白色、红色，再到紫红色，再变蓝。注：此反应 需在pH:5-7时进行 • 黄色反应：取1支试管加入卵清蛋白10滴，再加3-4滴浓硝 酸，混匀，在酒精灯上加热，黄色，冷却后加4-5ml 10% NaOH，观察颜色变为橘黄色。 考马斯亮蓝法测蛋白质标准曲线制作 取7支试管，按下表操作。 试管编号 标准蛋白溶液1 (mL) 0.9%NaCl溶液（mL） 考马斯亮蓝试剂(mL) 蛋白质浓度(g/mL) A595nm 0 0 1.0 4 0 1 0.1 0.9 4 10 2 0.2 0.8 4 20 3 0.3 0.7 4 30 4 0.4 0.6 4 40 5 0.5 0.5 4 50 6 样液1 1mL 0 4 ？ 7 卵清蛋白1ml 0 4 ？ 摇匀，1 h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色 OD595nm 以OD595nm为横坐标，标准蛋白含量为纵坐标，在Excel上绘制 标准曲线。 根据所测样品提取液吸光值，在标准曲线上查得相应的蛋白质含 量（μg），按下式计算： 样品蛋白质含量( g/g鲜重) 查得的蛋白质含量( g/ml) 提取液总体积(ml) 样品鲜重( g ) 双缩脲法测蛋白质标准曲线制作 取14支试管，分两组按下表平行操作。 试管编号 标准蛋白溶液2 (mL) 3ml 蒸馏水（mL） 双缩脲试剂(mL) 蛋白质浓度(mg/mL) A540nm 0 0 1 0.3 2 0.6 3 0.9 4 1.2 5 1.5 6 样液2 3mL 7 卵清蛋白 3.0 2 0 2.7 2 0.2 2.4 2 0.4 2.1 2 0.5 1.8 2 0.8 1.5 2 1.0 0 2 ？ 0 2 ？ 充分混匀后，显色后30min内测定A540，否则会有CuO2形成。 6、讨论 1、反应现象 现象 解释现象 双缩脲反应尿素 双缩脲反应卵清蛋 白 茚三酮反应 黄色反应 2、考马斯亮蓝法与双缩脲法测定蛋白质含量的标准曲线 与样液浓度 3、计算鸡蛋清的蛋白质含量 4、两种测定方法的优缺点 5、其它测定蛋白质含量的方法的原理与优缺点 7、注意事项 （1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5-20 min 内测定光吸收，因为再这段时间内颜色最稳定。 （2）考马斯亮蓝法测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸 附于比色杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。测定完 后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。一些阳离子如K+ 、 Na+ 、Mg2+ 等物质对测定无影响；而大量的去污剂如SDS等 会严重干扰测定；乙醇的存在会使蛋白质沉淀，改变染料 颜色 （3） 双缩脲法：本实验方法测定范围1－10mg/mL蛋白质。 须于显色后30min内比色测定。30min后，可有雾状沉淀发 生。各管由显色到比色的时间应尽可能一致。有大量脂肪 性物质同时存在时，会产生浑浊的反应混合物，这时可用 乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液再测定。 8 作业 • 预习实验62酵母RNA的提取 实验六、植物组织中总糖和 还原性糖含量的测定 1、实验目的 • 掌握总糖和还原糖含量的测定方法 • 学习总糖和还原糖提取的方法 2、实验重点和难点 • 利用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量的 实验原理 • 多糖在酸性加热条件下会降解为还原糖 3、实验原理 3.1、还原糖的概念 • 指含有游离的半缩醛（酮）基糖。单糖都是还原 糖；某些二糖是还原糖（如麦芽糖、乳糖等）； 多糖多为非还原糖。 • 葡萄糖分子中含有游离醛基，果糖分子中含有游 离酮基，乳糖和麦芽糖分子中含有游离的醛基， 故它们都是还原糖。 3.2、3,5-二硝基水杨酸比色法 • 总糖的提取及双、多糖的酸水解。利用糖的溶解 度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分 别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用 酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定， 再分别求出样品中还原糖和总糖的含量。 • 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产 物，3,5-二硝基水杨酸(黄色）则被还原为棕红色 的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖 的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用 分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对 标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖 的含量。 • 由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加 入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。 3.3、糖含量测定方法 物理法 相对密度法 折光法 旋光法 直接滴定法 还原糖法 (改良的兰—爱农法） 高锰酸钾法 萨氏法 化学法 碘量法 3，5—二硝基水杨酸 酚—硫酸法 比色法 蒽酮法 半胱氨酸—咔唑法 纸色谱 薄层色谱 色谱法 GC HPLC β—半乳糖脱氢酶测半乳糖、乳糖 酶法 葡萄糖氧化酶测葡萄糖 发酵法 ——测不可发酵糖 重量法——测果胶、纤维素、膳食纤维素 4、操作步骤 4.1、制定标准曲线 管号 0 1 2 3 4 5 标准葡萄糖溶液/mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水/mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 DNS试剂/mL 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 沸水浴中准确煮沸5min，取出，用自来水冷却至室温 蒸馏水/mL 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 葡萄糖浓度/mg/mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 A540 4.2、植物组织中总糖与还原糖溶液的获取 (1)还原糖： 1g土豆 取滤液作为还 原糖提取液 3mL水 混匀,过滤 (2)总糖： 1g土豆 3mL水 30mL水冲研 钵2-3次 研成匀浆 三角瓶中 冷却定到 100mL 50℃水浴0.5h 12mL水冲研 钵2-3次 研成匀浆 三角瓶中 10mL6MHCl 取滤液作为 总糖提取液 混匀,过滤 冷却,用 I2-KI检测 沸水浴0.5h NaOH中和, 加水定容 到100mL 4.3、用3,5-二硝基水杨酸法测还原糖、 总糖含量 管号 空白对照 还原糖 样液管 样液/mL 0 1.0 1.0 水 1.0 0 0 DNS试剂/mL 2.0 2.0 2.0 总糖样液管 沸水浴中准确煮沸5min，取出，用自来水冷却至室温 蒸馏水/mL A540 9.0 9.0 9.0 5、数据处理与问题 • 5.1、计算浓度 还原糖浓度100103 还原糖含量 100% 1 总糖浓度100103 0.9 总糖含量 100% 1 • 5.2、本实验的注意事项？ 3,5-二硝基水杨酸法标准曲线 1.8 y = 1.6159x - 0.0121 2 R = 0.9989 1.6 浓度（mg/ml） 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 A540 葡萄糖标准曲线（DNS法） 0.8 1 1.2 实验七 酵母醇脱氢酶的提纯 1、实验目的 • 学习和掌握目的物质的提纯 • 掌握酵母醇脱氢酶的提纯方法和原理 • 掌握酵母醇脱氢酶活力测定的方法 2、实验重点和难点 • 2.1 实验原理 • 2.1 酶活力测定 3、实验原理 • 酶是一类由活细胞产生的，对其特异底物 具有高效催化作用的蛋白质。 蛋白质部分：酶蛋白 (apoenzyme) 全酶 (holoenzyme) 小分子有机化合物 辅助因子 (cofactor) 金属离子 酶蛋白决定反应的特异性 辅助因子决定反应的种类与性质 • 金属离子的作用 –稳定酶的构象； –参与催化反应，传递电子； –在酶与底物间起桥梁作用； –中和阴离子，降低反应中的静电斥力等。 • 小分子有机化合物的作用 –在反应中起运载体的作用，传递电子、质子或 其它基团。 •NAD+尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸,辅酶I 当底物浓度高达一定程度 反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反 应。 酶活力(Enzyme Activity)也称酶活性，是指酶 催化一定化学反应的能力。酶活性是研究酶的特性、 分离纯化以及酶制剂生产和应用时的一项不可缺少的 指标。酶活力是用在一定条件下，它所催化某一反应 的反应初速度来表示。酶反应速度(指初速度)可用单 位时间内单位体积中底物的减少量或产物的增加量来 表示。 比活力(性)(Specific Activity)是酶纯 度的量度，即指：单位重量的蛋白质中所具 有酶的活力单位数，一般用IU/mg蛋白质来表 示。一般来说，酶的比活力越高，酶越纯. •抽提 由于大多数酶蛋白属于球蛋白，因此，一般可用稀 盐、稀酸或稀碱的水溶液抽提酶。 抽提液的具体组成和抽提条件的选择，取决于酶的 溶解性、稳定性以及有利于切断酶与其他物质的连结。 •pH 首先考虑酶的稳定性。选用pH不应超过酶的pH稳定 范围。其次，从抽提效果出发，最好远离待抽提酶的等 电点。也就是说，酸性蛋白宜用碱性溶液抽提；碱性蛋 白宜用酸性溶液抽提。第三，在某些情况下，抽提还兼 有切断酶与细胞内其它成分间可能有的联系，从这点出 发，选用pH 4-6为佳。 •盐 大多数蛋白质在低浓度的盐溶液中有较大的溶解 度。所以，抽提液一般采用等渗溶液。最普通的为 0.020-0.050mol/L的磷酸缓冲液, 0.15mol/L NaCl等。 焦磷酸钠和柠檬酸钠的缓冲液有助于切断酶和其他物 质的联系,也常用.据报道，少数情况下用水抽提亦佳, 这可能与低渗破坏细胞结构有关. •温度 通常控制在0-4℃左右.如果酶比较稳定时，可以 例外。 •抽提液用量 常采用原料量的1-5倍。有时，为了抽提效果好些 需要反复抽提。 •浓缩 提取液或发酵液的酶蛋白浓度一般很低，如发酵 液中酶蛋白浓度一般为0.1％-1％。因此，在分离纯化 过程中，酶溶液往往需要浓缩。浓缩的方法很多，如： 盐析或溶剂沉淀法、超过滤法、离子交换树脂法等。 这些方法既是浓缩的方法，又是分离纯化的手段。再 如真空浓缩、冷冻浓缩法、蒸发法、凝胶吸水法、聚 乙二醇吸水法等。 •酶和杂蛋白的性质差异大体上可有以下几个方面，根 据这些差异.其分离方法可有： (1)根据分子大小轻重设计的方法。如离心分离法、 筛膜分离法、凝胶过滤法等。 (2)根据溶解度大小分离的方法、如盐析法、有机溶 剂沉淀法、共沉淀法、选择性沉淀法、等电点沉淀法 等。 (3)按分子所带正负电荷多少分离的方法，如离子交 换分离法、电泳分离法、聚焦层析法等。 (4)按稳定性差异建立的分离方法，如选择性热变性 法表面变性法等。 (5)按亲和作用的差异建立的分离方法，如亲和层析 法等. • 结晶是指分子通过氢键、离子键或分子间力 按规则并且周期性排列的一种固体形式，由 于各种分子间形成结晶的条件不同，也由于 变性蛋白质和酶不能形成结晶，因此，结晶 既是一种酶是否纯净的标志，又是一种酶和 杂蛋白分离的方法。 • 盐冰浴的降温原理与溶液的凝固点下降有关。当 食盐和冰均匀地混合在一起时，冰因吸收环境热 量稍有融化变成水，食盐遇水而溶解，使表面水 形成了浓盐溶液。由于浓盐溶液的冰点较纯水低， 而此时体系中为浓盐溶液和冰共存，因此体系的 温度必须下降才能维持这一共存状态（浓盐溶液 和冰的共存温度应该比纯水的冰点更低）。这将 导致更多的冰融化变成水来稀释浓盐溶液，在融 化过程中因大量吸热而使体系温度降低。 • 低温冰盐浴配方：(碎冰用量100克) 浴温(℃) -4.0 -9.0 -21.5 -40.3 -54.9 -21.3 -17.7 -30.0 -30.6 -30.2 -34.1 -37.4 -40 盐类及用量(克) CaCl2•6H2O(20g) CaCl2•6H2O(41g) CaCl2•6H2O(81g) CaCl2•6H2O(124g) CaCl2•6H2O(143g) NaCl(33g) NaNO3(50g) NH4Cl(20g)+NaCl(40g) NH4NO3(32g)+ NH4CNS(59g) NH4Cl(13g)+ NaNO3(37.5g) KNO3(2g)+ KCNS(112g) NH4CNS(39.5g)+NaNO3(54.4g) NH4NO3(42g)+NaCl(42g) 酵母醇脱氢酶 • 醇脱氢酶的辅酶NAD，能催化乙醇脱氢变成 乙醛，脱下的氢则使NAD+还原。 • 当有过量醇存在时，NAD+被还原的速度与酶 活力成正比，酶活力越高，单位时间产生 的NADH越多。NADH对340nm紫外线有强吸收， NAD+无此能力，因此可以测定A340nm的方法 测得反应体系中NADH含量，从而得知酶活 力的大小。 4、操作步骤 • 1）粗提：20g酵母干粉中加入80mL 0.066M Na2HPO4溶液中37℃水浴2h，室温放置3h，4000rpm 冷冻离心20min;（目的是活化酵母，使其分泌酵母 醇脱氢酶，并提取醇脱氢酶到溶液中） • 2) 热变性沉淀杂蛋白：每组取上清液20ml，留取 2mL到试管①中（冰浴），其余的放置于55℃水浴 20min，迅速冷却；4000rpm冷冻离心20min；（目 的是去除热敏感性蛋白质） • 3）有机溶剂沉淀杂蛋白：取上清液，留取2mL到试 管②中（冰浴），其余的量体积后，在盐冰浴条件 下加入0.5倍体积的冰丙酮，混匀，静止5min， 4000rpm冷冻离心20min；（目的去除杂蛋白） • 4）有机溶剂沉淀酵母醇脱氢酶：取上清液，留取 2mL到试管③中（冰浴），其余的量体积后，在 盐冰浴条件下逐滴加入0.55倍体积的冰丙酮，沉 淀完全后，4000rpm冷冻离心20min；（目的是沉 淀酵母醇脱氢酶） • 5）弃上清，加入5ml水溶解沉淀，置于试管④中 （冰浴）； • 6）将每一步获得的溶液进行适当稀释，测定酶活 （利用催化醇脱氢的方法）和蛋白质浓度（利用 考马斯亮蓝法）；目的是确定每一步的纯化效果。 • 测定蛋白质浓度：从试管①②③④中分别取0.2ml， 用0.9%NaCl定容至20ml，置于试管①’②’③’④’ 中。 试管 0 ①’ ②’ ③’ ④’ 样液 （ml） 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 4 4 4 4 4 0.9%NaCl （ml） 考马斯亮蓝 （ml） •测定酶活力： 将试管①②③④按以下比例稀释： ①1ml＋4ml K2HPO4 ②0.5ml ＋4.5ml K2HPO4 ③ 0.5ml ＋4.5ml K2HPO4 ④ 0.5ml ＋4.5ml K2HPO4 向比色皿中依次加入0.06M焦磷酸钠 0.5ml，3M乙醇 0.1ml，0.0015M NAD 0.1ml，蒸馏水 2.2ml，稀释的样 液 1ml（对照液中加蒸馏水）。 每隔15s测一次A340，直至不变。 以每分钟A340增加0.001为1个酶活力单位。 5、作业 • 原始数据：记录每次纯化所得溶液体积， 测定蛋白质浓度的OD值，测定酶活力的OD 值变化情况。 • 实验报告：画书上P.238的表62并填写 提纯步骤 蛋白质 蛋白质 浓度 总量 总体积 /(mg/ml) /mg /ml B C A 1.粗提 2.热变性去除杂 蛋白 3.有机溶剂沉淀 杂蛋白 4.有机溶剂沉淀 酶蛋白 C=A×B，E＝A×D，F＝D/B 酶活力 /U D 回收率（%） 总活力 比活力 /U /(U/mg) 蛋白质 酶活力 E F G H 100 100