Transcript 离心技术 - 上海交通大学医学院医学检验系

离心技术
上海交通大学医学院
倪培华 副教授
离心技术（centrifugal technique）
是根据颗粒在匀速圆周运动时受到一
个外向的离心力的行为发展起来的一种分离
分析技术。
离心技术的应用
1. 工业生产
化工、制药、食品等
转速<5000r/min
2. 生物、医学、化学
转速从每分钟几千到几万转以上
目的在于分离和纯化样品，以及对纯
化的样品有关性能进行研究。
一.基本原理
1.离心力 Centrifugal force
F=ma=mω2r
ω:旋转角速度
r：旋转体离旋转轴的距离
2πn
ω=
(rad/sec)
60
(F)
2.相对离心力 Relative centrifugal
force
(RCF)
RCF 就是实际离心力转化为重力加速度
的倍数
RCF=F离心力/F重力
=mω2r/mg=ω2r/g
g为重力加速度（980.7cm/sec2)
若用
2πn
ω=
(rad/sec)
60
(2πn/60)2
RCF=
x
r
980.7
=1.118×10-5 n2 r
n：转子每分钟的转数(rpm)
Dole&Cotzias制作了转子速度和半径相
对应的离心力列线图。
3.沉降系数 Sedimentation coefficient (S)
样品沉降率
样品颗粒的大小
形状
密度
溶剂的粘度、密度
离心加速度
在一般情况下，样品的沉降特征可以用
沉降系数来表示:
S是指单位离心场中粒子移动的速度。
沉降速度
dx/dt
S=
=
单位离心力
ω2 x
1
S=
dx
.
ω2dt
x
1
Sdt=
dx
.
ω2
∫
t2
S
x
1
dt=
t1
ω2
∫
x2
dx
x1
x
1
S(t2-t1)=
(lnX2-lnX1)
ω2
lnX2--lnX1
S=
(t2-t1) ω2
logX2-logX1
=2.303
ω2 (t2-t1)
若ω用2πn/60表示则：
2.1×102logX2/X1
S=
n2 (t2-t1)
X1: 离心前粒子离旋转轴的距离
X2: 离心后粒子离旋转轴的距离
S在实际应用时常在10-13秒左右，故把
沉降系数10-13秒称为一个Svedberg单位，简
写S，量纲为秒。
4.沉降速度 Sedimentation velocity
(1)定义：
指在强大离心作用下，单位时间内物
质运动的距离。
dx
V=
=
dt
=
2r2 (ρp-ρm)
9 η
d2 (ρp-ρm)
18η
r： 球形粒子的半径
d：球形粒子的直径
η：流体介质的粘度数
ρp：粒子的密度
ρm：介质的密度
. ω2 X
. ω2 X
ρp-ρm=0 即ρp=ρm V=0 S=0
粒子平衡
ρp-ρm>0 即ρp>ρm V>0 S>0
粒子达到某一位置后就达到平衡
ρp-ρm<0 即ρp<ρm1 V<0 S<0
粒子逆着离心方向上浮
5.沉降时间(Sedimentation Time, Ts)
dx/dt
S=
2X
1
dx
dt=
2S
X
1
lnX2/X1
积分得 t2-t1= ·
S
2
X2为离心转轴中心至离心管底内壁的距离;
X1为离心转轴至样品溶液弯月面之间的距离,
样品粒子完全沉降到底管内壁的时间(t2-t1)
用Ts表示则式可改为
1
lnXmax-lnXmin
Ts=
·
S
2
Ts以小时为单位,S以Svedberg为单位。
二. 离心设备
离心机
转子
离心管
附件
（一）.离心机(Centrifugel)
1.低速离心机
转子
电动机
转子带有放置离心管的孔
转子的中央位于离心机的驱动轴上
离心机的转速和温度控制不够准确
一般最高转速在6,000rpm以下
实验室中常用于分离制备。
2.高速离心机
制冷设备温度控制在0-4℃范围内
制动器
实际速度和温度可通过仪表显示
配有一定类型及规格的转子
最高转速在25,000rpm以下
常用于生物大分子的分离制备
3.超速离心机
驱动和速度控制
温度控制
真空系统
转子
常用于分离亚细胞器、病毒粒子、DNA、
RNA和蛋白质分子。
在分离时无须加入可能引起被分离物质结
构改变的物质。
（二）.转子(Rotor)
固定角式转子(fixed-angle rotor)
水平转子(swing-out rotor)
垂直转子(vertical rotor)
带状转子(zonal rotor)
连续转子(continuous rotor)
转子的材质：
铝质
较轻,耐受强度较弱,适合在较低
的转速下使用;
不锈钢
耐受强度最好,但材质本身太重；
钛合金
耐受强度不错,重量也比不锈钢轻。
1.固定角式转子
离心管在离心机中放置的位置与旋转
轴心形成一个固定的角度,角度变化在1440°之间。
常见的角度
20°
28°
34°
40
固定角式转子
角式转子的特点：
（1）重心低,转速可较高
（2）样品粒子穿过溶剂层的距离略大于
离心管 的直径;
（3）“管壁效应” ：
有一定的角度, 在离心过程中撞到
离心管外壁的粒子沿着管壁滑到管底形
成沉淀, 此效应使最后在管底聚成的沉
淀较紧密。
在离心管的不同部位距旋转中心轴的距
离也不同,那么在一定的转速下其RCF值也各
不相同
 设40000rpm时


R1
R2
R3





R1最小、 3.8cm
R2平均、 5.9cm
R3最大、 8.1cm
RCF值分别
67,910g
105,400g
144,700g
2.水平转子
（1）转子静止时,处在转子中的离心管中
心线与旋转轴平行,
（2）转子旋转加速时,离心管中心线由
行位置逐渐过渡到垂直位置,即与旋
转轴成90°角,
（3）粒子的沉淀方向同旋转半径方向基本
一致有少量的“管壁效应”
水平转子的特点：
（1）转子的重心位置较高
（2）样品粒子沉降穿过溶剂层的距离大于
直径
（3）对于多种成分样品分离特别有效
（4）常用于速率区带离心和等密度离心
3.垂直转子
离心管垂直插入转子孔内,在离心过程
中始终与旋转轴平行,而离心时液层发生
90°角的变化,从开始的水平方向改成垂直
方向,当转子降速时,垂直分布的液层又逐渐
趋向水平,待旋转停止后,液面又完全恢复成
水平方向。
三.离心分离方法
根据离心原理,按照实际工作的需
要，目前已有可设计出各种离心方法综
合起来大致可分三类
离心分离法
差速离心法
沉降速度法
速率区带离心法
等密度离心法
沉降平衡法
经典式沉降法
1.平衡离心法
根据粒子大小、形状不同进行分离。
差速离心法(differential velocity
centrifugation)
速率区带离心法(rate zonal centrifugation)。
2.等密度离心法(isopynic centrifugation)
又称等比重离心法,依粒子密度差进行分
离,等密度离心法和上述速率区带离心法合称
为密度梯度离心法。
3.经典式沉降平衡离心法
用于对生物大分子分子量的测定、纯
度估计、构象变化。
(一).差速离心法
1、原理
利用不同的粒子在离心力场中沉降的差
别,在同一离心条件下,沉降速度不同,通过
不断增加相对离心力,使一个非均匀混合液
内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。
操作过程中一般是在离心后倾倒的办法
把上清液与沉淀分开,然后将上清液加高转
速离心,分离出第二部分沉淀,如此往复加高
转速,逐级分离出所需要的物质。
差速离心的分辨率不高,沉淀系数在
同一个数量级内的各种粒子不容易分开,
常用于其他分离手段之前的粗制品提取。
2.注意点：
可用角式、水平式转头
可用刹车
难以获得高纯度
例用差速离心法分离已破碎的细胞各组份
已破碎的细胞
500g,10分钟
沉淀
(细胞核）
上清液
10,000g,10分钟
沉淀
(细胞膜碎片,线粒体,)
溶酶体
上清液
100,000g,3小时
沉淀
(核糖核蛋白体）
上清液
(可溶性成份)
(二).速率区带离心法
1.原理
离心前离心管内先装入密度梯度介质,
待分离的样品铺在梯度液的顶部、离心管底
部或梯度层中间,同梯度液一起离心。离心
后在近旋转轴处(X1)的介质密度最小,离旋
转轴最远处(X2)介质的密度最大,但最大介
质密度必须小于样品中粒子的最小密度,即
ρp>ρm。这种方法是根据分离的粒子其在
梯度液中沉降速度的不同,使具有不同沉降
速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一
系列区带,达到彼此分离的目的。
◎梯度液：起支持介质和稳定剂的作用。
◎ρp>ρm则S>0, 离心时间要严格控制。
◎应用于物质大小相异而密度相同的情况。
2.注意点：
严格控制离心时间
ρp>ρm
事先配成较平缓的连续密度的梯度溶液
不能用角式转头、只能用水平式转头
不能用刹车
(三).等密度离心法
1原理
预先配制介质的密度梯度（包含了被
分离样品中所有粒子的密度），样品铺在
梯度液顶上或混合,离心开始后, 梯度液受
离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密
度梯度,与此同时原来分布均匀的样品粒子
也发生重新分布。最后粒子进入到ρp=ρm,
此时dx/dt为零粒子不再移动，粒子形成纯
组分的区带。
特点：
（1）与样品粒子的密度有关
（2）与样品粒子的大小和其他参数无关
（3）转速、温度不变,则延长离心时间也
不能改变这些粒子的成带位置。
2.注意点：
离心时间要长
可用角式转头或水平式转头
粒子密度相近或相等时不宜用
密度梯度溶液中要包含所有粒子密度
不能用刹车
四. 梯度溶液的制备
(一).梯度材料的选择原则:
1、与被分离的生物材料不发生反应。
2、可达到要求的密度范围,且在所要求的密
度范围内,粘度低,渗透压低,离子强度和
pH变化较小。
3、不会对离心设备发生腐蚀作用。
4、容易纯化,价格便宜或容易回收。
5、浓度便于测定,如具有折光率。
6、对于分析超速离心工作来说,它的物理性
质,热力学性质应该是已知的。
常用的梯度材料：
1.糖类: 蔗糖、甘油、聚蔗糖(Ficoll)、右
旋糖酐、糖原
2.无机盐类:CsCl(氯化铯)、RbCl(氯化铷)、
NaCl、KBr等
3.有机碘化物:三碘苯甲酰匍萄糖胺等
4.硅溶胶: 如Percoll。
5.蛋白质:如牛血清白蛋白
6.重水
7.非水溶性有机物:如氟代碳等
(二).梯度材料的应用范围
1.蔗糖:
水溶性大
性质稳定
渗透压较高
最高密度可达1.33g/ml,
价格低
容易制备,
常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料
有较大的渗透压,不宜用于细胞的分离。
2.聚蔗糖:
商品名Ficoll,
渗透压低
粘度却特别高,为此常与泛影葡胺混合使用
以降低粘度
用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细
胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞
3.氯化铯:
离子性介质
水溶性大
最高密度可达1.91g/ml
重金属盐类,在离心时形成的梯度有较
好的分辨率
被广泛地用于DNA、质粒、病毒和脂蛋
白的分离
价格较贵
4.卤化盐类:
KBr和NaCl可用于脂蛋白分离
KI和NaI可用于RNA分离,其分辨率高于铯盐
NaCl梯度 可用于分离脂蛋白
NaI梯度可分离天然或变性的DNA。
5.Percoll:
SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮
渗透压低
对生物材料的影响小
颗粒稳定
在冷却和冻融情况下还是稳定的
粘度高
在酸性pH和高离子强度下不稳定
用于细胞、细胞器和病毒的分离
五.分析性超速离心
为了研究生物大分子的沉降特性和结构,
而不是专门收集某一特定组分。
它使用了特殊的转子和检测手段,以便
连续地监视物质在一个离心场中的沉降过程。
(一).分析性超速离心的工作原理
椭圆形的转子
一套真空系统
一套光学系统
转子通过一个柔性的轴联接成一个高速
的驱动装置,这轴可使转子在旋转时形成自
己的轴。
转子容纳二个小室:
分析室
配衡室 ：经过精密加工的金属块,作为分析
室的平衡用。
分析室：容量为1ml,呈扇形排列在转子中。
其有上下二个平面的石英窗,离心机中装有的
光学系统可保证在整个离心期间都能观察小
室中正在沉降的物质, 通过对紫外光的吸收
或折射率的不同对沉降物进行监视。
折射率原理:
当光线通过一个具有不同密度区的透
明液时,在这些区带的界面上产生光的折
射。
在分析室中物质沉降时重粒子和轻粒
子之间形成的界面就象一个折射的透镜,
结果在检测系统的照相底板上产生一
“峰”。由于沉降不断进行,界面向前推
进,故“峰”也在移动,从峰移动的速度可
以得到物质沉降速度的指标。
(二).分析性超速离心的应用
1.测定生物大分子的相对分子重量
沉降速度
沉降平衡
接近沉降平衡
沉降速度：超速离心在高速中进行, 使得任
意分布的粒子通过溶剂从旋转的中心辐射地
向外移动,在清除了粒子的那部分溶剂和尚含
有沉降物的那部分溶剂之间形成一个明显的
界面,该界面随时间移动而移动,这就是粒子
沉降速度的一个指标,然后用照像记录,即可
求出粒子的沉降系数。
dx/dt
S =
2X
RTS
M =
D(1-)
M--该分子不含水的相对分子重量;
R--气体常数;
T--绝对温度;
S--分子的沉降系数;
--分子的微分比容(当一克溶质加到一个大体积的溶
液中所占有的体积;
--溶剂的密度。
2.生物大分子的纯度估计
3.分析生物大分子中的构象变化