Transcript 细胞融合与红细胞膜渗透性观察

细胞融合与红细胞膜渗透性观察
细胞融合
一、实验原理
细胞融合（cell fusion）又称细胞杂交（cell
hybridization），是指两个或两个以上的细胞融合成一个
细胞的现象。细胞融合术是细胞遗传学、细胞免疫学、病
毒学、肿瘤学等研究的一重要手段，也是制备单克隆细胞
株的重要技术。
在诱导物（如仙台病毒，聚乙二醇）作用下，相互融合的
细胞发生凝集，随后在质膜接触处发生质膜成份的一系列
变化，主要是某些化学键的断裂与重排，最后打通两质膜，
形成双核或多核细胞。
病毒诱导融合
病毒是最早采用的融合剂。常用于诱导动物细胞融合的病毒有
仙台病毒、新城鸡瘟病毒、疱疹病毒等，其中仙台病毒最常用。
用作融合剂的病毒必须事先用紫外线或β-丙内酯灭活，使病
毒的感染活性丧失而保留病毒的融合活性。
优点：融合率较高，对各种动物细胞都适宜，且仙台病毒能在
鸡胚中大量繁殖，容易培养；
缺点：仙台病毒不稳定，在保存过程中融合活性会降低，并且
制备过程比较烦琐。此外，病毒引进细胞后，可能会对细胞的
生命活动产生干扰。
聚乙二醇PEG诱导融合
在不同种类的动物细胞混合液中加入聚乙二醇，
就会发生细胞凝集作用；聚乙二醇诱导细胞融
合的机理，目前还不太清楚。聚乙二醇是化学
试剂，使用起来很方便，诱导细胞融合的频率
比较高，但是它有一定毒性，对有些细胞(如
卵细胞)不适用。
电融合
20世纪80年代建立起来的电融合技术，是将两种细
胞的混合液置于低压交流电场中，使细胞聚集成串
珠状，然后施加高压电脉冲，以促使细胞融合。紧
密排列的细胞，当受到电击时，细胞部分区域就会
被击穿，产生脂双层膜孔，导致细胞之间的细胞质
连通，进而发生细胞融合。电融合技术有许多优点，
如诱导细胞融合的频率高，对细胞无毒害作用，操
作简便，可重复性好。
电融合仪
二、实验器材与试剂
1. 器具: 显微镜 离心机 天平 离心管 细滴管 载片、
盖片
2. 试剂: 50%聚乙二醇(PEG)：称取一定量的
PEG(MW=4000)放入刻度试管，在酒精灯火或沸水中加
热溶化。待冷至50℃时，加入等体积并预热至50℃的
GKN液混匀。
Alsver液：葡萄糖2.05g 柠檬酸钠0.8g NaCl 0.42g，
加重蒸水至100ml。
GKN 液：NaCl 8g，KCl 0.4g，Na2HPO4.2H2O 1.77g，
NaH2PO4.2H2O 0.69g，葡萄糖2g，酚红0.01g，溶于
1000ml重蒸水中。
0.85%NaCl液
三、实验内容及方法
1.用注射器取2ml Alsver液，再从翼下静脉取鸭血2ml，注入
管内，再加6ml Alsver液，混匀后置4℃冰箱中可备作3-4用。
2. 实验时取“1”液1ml于离心管中，加入4ml 0.85%的NaCl
液，混匀平衡后以1200rpm离心5min。
3. 去上清液。再重复“2”两次，最后一次离心10min。
4. 在沉降血球中加入1mlGKN液，混匀使之成为细胞悬液。
5. 在“4”液中加入6—8滴（约0.5ml）50%的PEG液，迅速混
匀，常温下2-3min滴片镜检。
四、结果观察
在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸭血细
胞膜融合在一起，形成一个异核体细胞。要注意辨别
融合细胞与重叠的鸭血细胞。
五、融合率的计算
在高倍镜下随机计数200个细胞(包括融合的与未
融合的细胞)，以融合细胞(含两个或两个以上的细胞
核的细胞)的细胞核数除以总细胞核数(包括融合与未
融合的细胞核)即得出融合率。
作业：描述显微镜下细胞融合的变化，计算融合率。
红细胞膜渗透性观察
一、实验原理
细胞膜是细胞与外界环境进行物质交换的结构，它可选
择性地让某些物质进出细胞。而对于不同性质的物质，
细胞膜的通透性有所不同。当细胞与所处的环境存在渗
透压差别时，水分子可从渗透压低的一侧向高的一侧扩
散，以至于在高渗环境中，细胞会失水而皱缩；而在低
渗环境中，细胞会吸水膨胀直至破裂。
二、实验内容
兔红细胞渗透压的观察
1.取一小烧杯，用肝素液（1mg/ml生理盐水）湿润，
然后加入兔血，以10倍生理盐水稀释，制成兔血细
胞悬浮液.
2.取5支试管，编码后依次向各试管加入1.5%NaCl液
5,3,2,1,0 ml,然后分别加入蒸馏水，使每管总体积
达到5ml，配成一浓度梯度的NaCl液。
3.向每一试管加入0.5ml兔红细胞悬浮液，混匀。
试管编号
1
2
3
4
5
1.5% NaCl（ml）
5
3
2
1
0
蒸馏水（ml）
0
2
3
4
5
NaCl浓度（%）
1.5
0.9
0.6
0.3
0
实验项目
细胞形态及溶血情况
作业：记录分析兔红细胞渗透压变化引起的细胞形态变化及
溶血情况