Transcript 原生质体培养与融合
植物原生质体培养和细胞融合 概念及研究进展 原生质体的分离与培养 原生质体融合 原生质体(protoplast)： 脱去细胞壁、裸露的细胞。又称原生质球 原生质体是为质膜所包围的裸露细胞。 亚原生质体(subprotoplast) 在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的 断裂而形成的一些较小的原生质体。它可以具有细 胞核，也可不具有细胞核。 核质体(nuclearplast) 由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生 质体。也称为微小原生质体。 胞质体(cytoplast) 不含细胞核，而仅含有细胞质的原生质体。 应 用 Regenerative ability Cell differentiation Ontogenic processes Organogenesis Somatic genetics Protoplast system Cell physiology Cell fusion Organelle, DNA uptake Cell cloning 意 义 植物细胞育种中的核质替换 细胞质杂种的获得 远缘杂交创造新物种细胞 细胞器的互作研究 植物原生质体的分离和培养 Flash 材料预处理 原生质体分离的方法 原生质体纯化 原生质体活力测定 影响原生质体数量和活力的因素 原生质体培养方法 影响原生质体培养的因素 原生质体再生过程 用于分离原生质体的材料 材料预处理 用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法， 可提高某些材料原生质体的产量和活力。 ☆ 龙胆试管苗的叶片用4oC处理较好。 ☆ 甘蔗植株必须先在黑暗下培养12h后分离的 原生质体才能分裂。 ☆ 马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48h后分 离原生质体，才能获得高产量。 原生质体分离的方法 机械分离法 酶解分离法 机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液中 预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质 体收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从 伤口处可释放出完整的原生质体。 缺点：获得完整的原生质体的数量比较少， 能够用此法产生原生质体的植物种类受到 限制。 优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的 破坏作用。 酶解分离法： 指将材料放入能降解细胞壁 的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的 作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活 力的原生质体的方法。 常用的酶种类：纤维素酶类（纤维素酶、半 纤维素酶、崩溃酶[Driselase]）、果胶酶类 （果胶酶和离析酶[Macerozyme]）、蜗牛酶 和胼胝质酶。 酶 来源 生产厂家 纤维素酶类 Onozuka R-10 绿色木霉 Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan Cellulysin 绿色木霉 Calbiochem.,San Diego,CA 92037, USA Driselase Irpex lutens Kayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo,Japan 酶 来源 生产厂家 Macerozyme R-10 根霉 Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan Pectinase 黑曲霉 Sigma Chemical Co. Pectolyase Y-23 黑曲霉 Seishin Pharm. Co. 果胶酶类 Ltd., Tokyo, Japan 半纤维素酶 RhozymeHP-150 黑曲霉 Rohm and Hass Co., Rhiladelphia, UAS 酶解法的优缺点 优点：获得量大，适用广泛。 缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、 过氧化物酶以及酚类物质。 会影响所获原生质体的活力。 原生质体纯化的方法 漂浮法 沉降法 不连续梯度法 采用比原生质体密度大的高渗溶 液（蔗糖、Percoll、Ficoll）， 使原生质体漂浮在液体表层的纯 化方法。 优点： 可以避免分离的原生质体因震 荡被组织碎片撞击而破损。 所用药品简单，成本低。 缺点及补救措施： 对离心力要求比较严格，掌握不 好，原生质体则不易漂浮。可采 用不同浓度和不同离心速度分次 漂浮的方法。 Protoplast 飘浮法 沉 降 法 利用比重原理，在具有一定渗透压的溶 液中，先进行过滤然后低速离心，使纯 净完整的原生质体沉积于试管底部。 优缺点： 纯化原生质体比较简单。 由于原生质体沉积于试管底部，造成相互 挤压，常引起原生质体的破碎。 又称界面法，采用两 种密度不同的溶液形 成不连续梯度，通过 离心使原生质体与破 损细胞分别处于不同 液相中，从而纯化原 生质体的方法。 优点：可以收集到数 量较大的纯净原生质 体，同时避免收集过 程中原生质体因相互 挤压而破碎。 12mL 0.45M 甘露醇 碎片带 0.6mL 0.45M蔗糖 含原生 质体带 不连续梯度法 原 生 质 体 鉴 定 低渗爆破法 荧光增白剂法(calcoflower white 0.1%) 原 生 质 体 活 力 测 定 形态识别 形态完整、富含 细胞质、颜色新 鲜的正常球形， 放入低渗溶液中， 可正常膨大。 原 生 质 体 活 力 测 定 荧光显微镜识别(FDA法) FDA (fluorescein diacetate) 本身不发荧光也不具有 极性，能自由穿过细胞 质膜。活细胞内FDA可 以被酯酶裂解，将能发 荧光的极性部分释放出 来。荧光素则不能自由 穿越质膜，在完整的活 细胞内积累。 使用浓度：0.01% 原 生 质 体 活 力 测 定 酚藏花红染色法（0.1%) 酚藏花红能使无活力的原 生质体染成红色，有活力 的原生质体不着色。 伊凡蓝(Evan’s blue)染色法(0.025%) 有活力但受损伤的细胞和死细胞能 够摄取这种染料，活细胞不摄取。 氧电极法 影响原生质体数量和活力的因素 供试材料及预处理方法 酶解条件： 酶质量、组合、浓度、pH、光照和温度 渗透压稳定剂 质膜稳定剂 分离条件： 离心次数、离心速度、纯化方法、分离纯化持续 时间。 分离用具 酶的种类、组合、浓度 几种草本植物原生质体分离使用的酶种类及浓度(%) 材料 烟草叶片 半纤 崩 纤维 维素 溃 素酶 酶 酶 1.0 禾谷类叶片 2.0 油菜花粉 1.0 1.0 离析 酶 蜗 牛 酶 Uchimiya 0.5 Scott 李仕琼 戴朝曦 0.5 0.5 研究者 0.1~0.2 1.0 马铃薯子叶 1.0 马铃薯花粉 果 胶 酶 1.0 王蒂 几种木本植物原生质体分离使用的酶种类及浓度(%) 枸杞愈伤组织 0.5 半纤 崩溃 果胶酶 维素 酶 酶 0.2 檀香幼叶 0.5 材料 纤维 素酶 2.0 檀香愈伤组织 1.0 榆幼叶 0.1~0.2 山毛榉幼叶 1.0 胡杨悬浮细胞 0.5 0.5 0.5 Lakshmi 0.5 Lakshmi 0.05 0.01~0.03 0.5 离 研究者 析 酶 0.2 孙勇如等 Dorin 0.1 0.5 Ahuja 1.0 0.5 诸葛强 pH 分离原生质体时，酶液的pH值是值得注意的 问题。因为降解酶的活力和细胞活力最适pH 值是不一致的。 如制备菜豆叶片原生质体时： 低pH（<4.5），酶的活力强，原生质体分离 速度快，但细胞活力差，被破坏的细胞较多; pH值偏高（7.0） ，酶活力差，原生质体分 离速度慢，完整的原生质体数目较多。 光照和温度 制备原生质体时，在细胞中加入酶液、渗透 压稳定剂、质膜稳定剂后，还需在一定时间 内保持一定的温度，原生质体方能释放。 脱壁的原生质体对光非常敏感，分离原生质 体一般是在黑暗条件下进行的。 在28℃条件下，每分钟40转的旋转式转床上 培养4h后，叶片组织可完全分离 。 悬浮细胞需在25℃～33℃条件下酶解24h 。 渗透压稳定剂 原生质体由于细胞壁的解除和壁压的消失将 引起细胞破碎。因而在酶液、原生质体洗涤 液、培养液中必须调整渗透压，维持细胞内 外渗透压平衡，防止细胞涨破或过分收缩而 破坏内部结构。 常用的渗透压稳定剂：甘露醇、山梨醇、葡 萄糖、蔗糖等，浓度约在0.40M~0.80M。渗 透压稳定剂还可促进分离的原生质体再生细 胞壁并继续分裂 。 质膜稳定剂 目的：增加完整原生质体的数量，防止质膜 破坏，促进原生质体细胞壁再生和细胞分裂 形成细胞团。 常用的质膜稳定剂 葡聚糖硫酸钾、2-（N-吗啉）-乙烷磺酸、氯 化钙、磷酸二氢钾。 原生质体培养方法 液体浅层培养法 优点： 原生质体在液体环境中有较强的吸收营养 物质的能力，表现出较强的细胞分裂能力。 操作简单，对原生质体的损伤小，且易于 添加新鲜培养基和转移培养物。 缺点： 原生质体分布不均匀，常常发生原生质体 之间的粘连现象而影响其进一步的生长和 发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的 发育情况。 双层培养法——液体-固体双层培养法 优点： 固体培养基中的营养物质可以缓慢放到液体 培养基中，如果在下层固体培养基中添加一 定量的活性炭，则还可能吸附培养物产生的 一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞 团的形成。 缺点： 不易观察细胞的发育过程。 固体薄层培养法 优点： 使原生质体处于固定位置，避免了原生质 体的漂浮游动，有利于对单个原生质体的 细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定 点观察。 缺点： 培养基温度对薄层质量和原生质体分布有 一定影响；另外，固体中单细胞生活能力 弱，通气状况不良，第一次细胞分裂时间 会推迟2d左右。 琼脂糖珠培养 将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管 以大约50ml一滴的量滴于直径6cm的培养皿， 待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于 摇床上低速旋转培养。 培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压 来调节培养物的渗透压以利于其进一步的生 长和发育，这种方法由于改善了培养物的通 气和营养环境，从而促进了原生质体的分裂 和细胞团的形成。 影响原生质体培养的因素 原生质体的活力 原生质体的起始密度 适宜密度在104~105个／ml左右。在烟草叶原生 质体培养中，密度低于103个／ml时，细胞只能 分裂一、二次，密度在104个／ml以上，植板率 常显著提高。 渗透压稳定剂 培养基营养 原生质体培养经常使用的KM-P培养基就是 以B5培养基为基础；N6培养基则以MS培 养基为基础 改进的。 影响原生质体培养的因素 培养条件 温度，光照 植物材料和基因型 柑桔，葡萄，桃 供体细胞的生长同步性 原生质体再生过程 原生质体再生过程是指分离、纯化的原生质 体在适当的培养方法和良好的培养条件下， 很快恢复细胞壁，再生细胞持续分裂形成细 胞团，最后或通过愈伤组织或通过胚状体分 化出完整植株的过程。 细胞壁再生 细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成 植株再生 细胞壁再生是细胞分裂的先决条件 再生所需时间与植物种类和起源细胞的分化 程度及生理状态有关。 再生过程：先是质膜合成细胞壁主要成分微 纤维，然后在质膜表面进行聚合作用，形成 多片层的结构，以后在质膜和片层结构之间 或在膜上产生小纤维丝，逐渐形成不定向的 纤维团，最后形成完整的细胞壁。 检测新壁合成的方法 荧光增白剂法(calcoflower white 0.1%)和电镜 技术 细胞分裂 愈伤组织或胚状体形成 植株再生 几种不同类型的原生质体分裂和发育速度比较 第一次分 植板 原生质体类 裂 率 型 时间 % (%) 烟草叶片 4d 胡萝卜培养 6d 细胞 矮牵牛愈伤 4d 组织 2~ 油菜叶片 3d 2周—20个细胞 60 60 组成的细胞团 8~10d形成细胞 10~ 5~30 团，4周后形成 20 胚状体 2周后形成20~25 个细胞的细胞团 10 马铃薯子叶 48h 46.1 马铃薯花粉 2h 细胞分裂情况 15d形成细胞团 28d愈伤组织 9~10d形成16个 细胞的细胞团 15d形成细胞团 愈伤组 织分化 速度 原生质 体到再 生植株 1m形 成芽 3m 胚状体 3周后 4m 成苗 8~10周 3m 出芽 10d分 3m 化出芽 2m 原生质体融合 原生质体融合方法 原生质体融合类型 原生质体融合（protoplast fusion) 两种异源（种、属间）原生质体，在人工控 制条件下，相互接触从而发生膜融合，胞质 融合和核融合并形成杂种细胞的过程。 Flash 体细胞杂种： 杂种细胞可进一 步发育成杂种植 物体。由融合细 胞培养成的植株 称为体细胞杂种 植株。 诱导原生质体融合的方法 化学融合(chemical fusion) 定义：利用化学融合剂，促使原生质体相互靠近、 粘连融合的方法。 主要种类： 盐类融合法（NaNO3融合） 高pH-高浓度钙离子融合法 PEG融合法 电融合(electrofusion) 利用改变电场来诱导原生质体彼此连接成串，再 施以瞬间强脉冲使质膜发生可逆性电击穿而使原 生质体融合的方法。 NaNO3融合法 机理： NaNO3能诱导原生质体融合的原因是钠离 子能中和原生质体表面的负电荷，使凝聚 的原生质体质膜紧密接触，促进细胞融合 原生质体表面带有负电荷(-10～-30mV)， 同性质电荷彼此凝聚的原生质体质膜无法 靠近到足以融合的程度。 融合率 0.1%~4%。 例子：Power（1970），玉米与燕麦原生质 体融合 高pH-高浓度钙离子融合法 Keller和Melchers(1972，1974)首先发现高 pH-高浓度钙离子的诱发融合效应。 机理： 钙离子浓度决定着细胞膜的稳定性和可塑性，影 响原生质体膜的结合； 高pH又能改变质膜的表面电荷，有利于细胞融合 钙离子浓度和pH范围因植物种类不同而异。 （例：烟草原生质体融合－－pH10.5，0.05 mM CaCl2） PEG融合法 诱导融合的机理 PEG具有分子桥的作用 原生质体－水、蛋白质和碳水化合物－ （氢键） PEG（氢键） －原生质体 打破电荷平衡 再经高浓度Ca2＋和高pH溶液处理并用培养 液清洗，可能使一种原生质体上的带正电荷 的基团连到另一种原生质体的带负电荷的基 团上，导致原生质体融合。 PEG融合技术的要点 融合液配置 A液：CaCl2 2~8mM KH2PO4 0.5~0.7mM 甘露醇或山梨醇 0.1~0.2mM PEG（分子量6000） 25%~30% pH 5.8 B液：CaCl2 KH2PO4 甘露醇或山梨醇 pH 2~8mM 0.5~0.7mM 0.1~0.2mM 7.0~10.0 PEG融合技术的要点 融合原生质体的密度和比例 密度：1×105 个/毫升 比例：1:1 融合 融合原生质体溶液 0.1~0.5ml，静置3～5min 融合液A 0.1~0.5ml，保持15~20min，25℃ 融合液B 0.1~0.5ml，保持10~20min，25℃ 培养液洗涤（3～4次），离心（100×g，5min） 电融合 基本原理： 在直流电脉冲的诱导下，原生质体质膜表 面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异 种原生质体黏合并发生质膜瞬间破裂，进 而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形 成融合体。 电融合 将制备好的亲本原生质体均匀混合放入融合小室 微电极型 两个电极的端部同时与两 个靠近的原生质体膜表面 接触，原生质体由于脉冲 电流间断刺激，两层膜间 产生小孔，连接成桥，经 点连接到面连接，最后形 成融合体。 平行多电极 平行多电极通过1MHz交 流电场发生双向电脉冲， 原生质体在电场力作用 下，极化产生偶极子， 原生质体紧密排开成串 珠状。此时，加入 直流电脉冲，质膜被击 穿，进一步形成融合体 电融合 与PEG融合比较起来，电融合的优点： 不存在对细胞的毒害问题 融合效率高 融合技术操作简便 电融合参数 （例：马铃薯，融合率>40%） 交变电场的振幅频率 交变电场处理时间 支流高频电压 脉冲宽度 脉冲次数 100 V/cm 20s 1100V/cm 60us 1 融 合 类 型 Flash 自发融合 诱发融合 对称融合 非对称融合 核失活 细胞质失活 影响原生质体融合的因素 原生质体质量至关重要，高质量的原生质体 是细胞融合的首要条件。 融合方法 融合参数，包括各种融合液都应选择适当。 融 合 体 类 型 异核体(heterokaryon)或异核细胞 – 基因型不同的原生质体融合成杂交细胞 同核体(homokaryon) – 基因型相同的原生质体融合成的杂交细胞 非对称杂种或细胞质杂种 细胞质工程 (cytoplasmic engineering) 细胞质工程 又称细胞拆合工程 是通过物理或化学方法将细胞质与细胞核 分开，再进行不同细胞间核质的重新组合， 重建成新细胞。 可用于研究细胞核与细胞质的关系的基础研 究和育种工作。 细胞质工程 细胞质杂种 应用细胞融合技术，使两种来源不同的核 外遗传物质与一个特定的核基因组结合在 一起 细胞质杂种获得途径（4条）： 一个正常原生质体与一个去核原生质体融合； Lorz等（1981）用密度梯度离心（5％ ~50% Percoll，20000~40000g， 40~90min）获得高纯度的去核原生质体。 细胞质工程 细胞质杂种获得途径 一个正常原生质体和一个核失活原生质体融合 使核失活的方法：X射线，碘乙酰胺，罗丹明 异核体形成后，两个核中有一个消失； 较晚时期，染色体选择性消失。 体细胞杂种产生的其它途径 细胞器移植 叶绿体移植 叶绿体的来源 叶片－－－机械法－低速离心 原生质体－低渗涨破－低速离心 叶绿体的纯化 Percoll或蔗糖密度梯度离心 叶绿体的转移 夹层离心法和PEG诱导融合 应用PEG诱导胡萝卜原生质体摄入藻类叶绿体 利用叶绿体的转移使低光效作物的原生质体通过 摄取高光效作物的叶绿体而提高其光合效率。 体细胞杂种产生的其它途径 细胞器移植 细胞核移植 细胞核的来源 植物组织－机械法（加Triton X-100）－过滤离心 原生质体－低渗涨破(加Triton X-100)－过滤离心 细胞核的纯化 Percoll或蔗糖密度梯度离心 细胞核的转移 夹层离心法：原生质体－核－原生质体－核∙∙∙ PEG诱导 电场诱导和微注射 体细胞杂种产生的其它途径 微生物移植 内吞作用 摄入固氮根瘤菌 外源染色体和DNA的摄入 染色体分离 细胞－同步化处理－原生质体－涨破－差速离 心（200 g,10 min；1000g，20 min） 转移方法 PEG诱导，显微注射 农杆菌介导，基因抢，电穿孔，超声波，激光穿孔 体细胞杂种选择及杂种植株鉴定 根据可见标记性状 的机械选择法 体细胞杂种选择及杂种植株鉴定 •。 • FITC(异硫氰酸 荧光素)在荧光显 徽镜下呈绿色 • RITC (异硫氰酸 罗丹明) RITC在荧 光显徽镜下呈红色 体细胞杂种选择及杂种植株鉴定 根据其遗传和生理生化特性的互补选择 法 互补选择法 互补选择法是指利用两个亲本具有不同遗传 和生理特性,在特定培养条件下,只有发生互补 作用的杂种细胞才能生长的选择方法。 抗性互补选择法 营养代谢互补选择法 生长互补选择法 矮牵牛+爬山虎融合体的选择 爬山虎冠瘿 矮牵牛 混合体 融合处理 原生质体 NT培养基 矮牵牛+爬山虎 （异核体） 细胞团 MS 培养基 MS 培养基 (有激素) (无激素) 愈伤组织 死亡 原生质体 NT培养基 NT培养基 细胞团 死亡 MS 培养基 (无激素) 细胞团 MS培养基 (无激素) 愈伤组织 愈伤组织 体细胞杂种选择及杂种植株鉴定 细胞学鉴定 利用染色体显带技术，以亲本染色体为对 照，对细胞杂种的染色体数目、形态和带 型进行观察。 体细胞杂种选择及杂种植株鉴定 同功酶鉴定 根据亲本和杂种同 功酶谱的差异来鉴 别杂种。有的呈双 亲谱带的总和、有 的出现新谱带或丢 失部分亲本谱带。 常用的鉴定酶为： 乙醇脱氢酶、乳酸 脱氢酶、过氧化物 酶、酯酶等。 体细胞杂种选择及杂种植株鉴定 DNA分子标记鉴定 是在DNA水平上对 亲本和杂种植株遗 传差异进行鉴定的 一种技术。 依据DNA的多态性 （polymorphism） Random Amplified Polymorphic DNA 体细胞杂种选择及杂种植株鉴定 小结 原生质体是植物除去细胞壁的裸露细胞，是 进行各种细胞操作的理想系统。 原生质体的分离和纯化是对其操作和培养的 前提。 分离的原生质体活性受供体材料和分离条件 的影响。 原生质体培养是细胞工程精细技术，培养技 术成熟程度直接影响体系的应用。 小结 原生质体融合是获得胞质杂种的理想途径。 体细胞杂交在远缘育种和新物种、新资源创 造中具有深远意义。 原生质体融合技术主要有PEG融合及电融合 提高融合效率和融合细胞培养重复性是该技 术研究的重点 思考题 1．原生质体、亚原生质体、微小原生质体和原 生质球的概念。 2．为什么原生质体要培养在等渗培养基中？ 3．影响原生质体培养的主要因素。 4．原生质体的培养方法有哪些？各有何优缺点 5．为什么说原生质体培养系统是现代生物技术 的载体？ 思考题 6．植物体细胞杂交的概念和类型。 7. 什么是细胞质工程？ 8．对称融合和非对称融合的概念及非对称融 合的作用。 9．PEG融合与电融合的原理及影响因素。 10．杂种细胞的获得和选择方法。