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膜蛋白的结构研究 • • • • 蛋白的膜拓扑学研究 蛋白质的晶体学研究: 3D; 2D 蛋白质的单颗粒研究: EM; AFM 蛋白质结构的波谱技术 生物电子显微学 电子显微学研究生物大分子结构的 主要方法 研究尺度 研究对象 研究方法 生物大分子 二维晶体 纤维或管状晶体 电子晶体学 生物大分子复 合体 单颗粒生物大分子 及复合体、病毒等 单颗粒技术 亚细胞水平 超分子复合体，细 胞器，亚细胞结构 （周期排列） （全同粒子） 电子断层成像术 （单一结构） 三维重构梗概中心截面 定理与三维重构示意图。 (A)：在X射线晶体学中 通过对整个三维晶体的 X射线衍射直接获得 Fourier倒易空间的衍 射信息，其与时空间的 三维晶体是对应关系。 (B)：在电子晶体学中， 通过不同方向的投影及 数字Fourier变换，获 得的是其Fourier倒易 空间不同中心截面的衍 射信息，将所有不同方 向投影的中心截面整合 到一起，可以获得物体 在整个三维Fourier倒 易空间的衍射信息，通 过逆变换同样可以获得 该物体在实空间的图象。 三维重构的基本原理(中心截面定理) 将电子显微图像(实空间)进行傅里叶变换(倒 易空间)，一张显微图像的傅里叶变换相应于成 像物体在三维傅里叶变换(倒易空间)的一个通 过中心的截面。通过改变生物样品在电镜下的 倾斜角度，就可以得到相当于傅里叶变换(倒易 空间)的其它通过中心的截面。收集在不同倾斜 角度下样品的显微图像，经过傅里叶变换就可 以获得一套完整的三维倒易空间数据。对样品 的三维倒易空间数据进行傅里叶逆变换运算就 可以获得该样品在实空间的三维结构图像。 电子晶体学（Electron Crystallography） 蛋白二维晶体样品 电子显微镜 电子显微照片 Fourier 变换 倒易空间衍射谱 清除噪音 倒易空间信号信息 反Fourier 变换 实空间蛋白质结构信息 电子晶体学的优势： 1.可以直接得到膜蛋白的结构信息以及与膜相 关蛋白在膜上的结构信息。 2.可以获得高分辨率的结构，尤其适用于难于 三维结晶的膜蛋白。 Bacteriohodopsin, Henderson et al.,1990; Plant light-harvesting complex, Kuhlbrandt, Wang, 1994; Aquaporin, Murata et al., 2000. 单颗粒技术（Single Particle Technique） 近年来迅速发展起来的单颗粒方法 （Single Particle Technique）是生物电子显微学的新方法,它克 服了晶体学的限制。 顾名思义，单颗粒方法是对分离的，非有序排列的， 但是相同的颗粒进行结构解析。其所采用的基本原理是通 过对相同的生物大分子某方向的投影显微像在实空间中经 过调整后进行叠加平均，从而提高信噪比，使粒子中共同 部分的结构信息得到加强，最后对各种不同投影方向的单 颗粒显微像在三维空间中进行重构，从而获得单颗粒大分 子的三维结构信息。 由于它处理的是同一大分子随机散布的电镜照片，所 以没有形成晶体的要求。另外，单颗粒方法处理的生物大 分子没有质量上限，而且分子越大，结果越好。 单颗粒技术（Single Particle Technique） 锥形采集法模型示意 单颗粒技术（Single Particle Technique） 蛋白质颗粒 电子显微镜 电子显微照片 Particle picking 单颗粒图像 Alignment 调整后的颗粒图像 Classification & Average 实空间蛋白质结构信息 单颗粒技术的优势： 1.不需要二维晶体； 2.适于解决生物大分子复合体系的结构 应用举例： 用单颗粒技术研究核糖体(ribosome)的结 构及其功能机制。 电子断层成像术（Electron Tomography) 细胞样品 样品制备（固定，染色) 电镜观测 一系列各角度的投影像 Backprojection 实空间的结构 Segmentation & model 建立模型 电子断层成像术（Electron Tomography) The three-dimensional reconstruction of an object from a serious of projections Electron Tomography 的优势： 1.适于解决不具备周期性或全同性的 生物大分子复合体系的结构； 2.适于揭示亚细胞层次的复杂结构。 Docking Technique 低分辨率结构 高分辨率结构 （来于电子显微术） （来于X射线晶体学或NMR） Docking (manual docking or computational docking） maximize the correlation coefficient Docking 优化 复合体的高分辨结构 采取一系列的判断标准 保证docking的准确性 Docking Technique： 把X射线晶体学的原子分辨率结构与电子显 微术的分子分辨率结构结合起来构筑细胞 基本结构体系！ The era of docking is coming ! 膜蛋白的结构研究 • • • • 蛋白的膜拓扑学研究 蛋白质的晶体学研究: 3D; 2D 蛋白质的单颗粒研究: EM; AFM 蛋白质结构的波谱技术 生物大分子的单颗粒观测 生物大分子单颗粒的原子力显微镜 (AFM)研究 原子力显微镜（Atomic Force Microscopy, AFM） 已经成为一种对细胞及生物大分子形态结构进行观测 的有力工具。其主要原因有两个，1. 原子力显微镜作 为扫描探针显微镜的一种，构建了一种在中等量级 （亚微米）上对于生物系统的一般形态结构进行研究 的工具；2. 利用AFM，可以使得细胞及生物大分子在 生理溶液的条件下成象。 因此，AFM对于生物系统的成象分析比光学显微 镜具有更高的分辨率(大约可以达到1nm)，比电子显 微镜观测所需要的样品处理更接近于生理条件，并且 比光谱学技术（通常需要从大量光谱信号中间接推导 出结构信息）更直观。而相对于晶体学方法来说， AFM分析不需要依靠于晶体样品，这非常有利于研究 天然状态下的生物样品。 AFM实验装置(a)带有尖端的悬臂在样品表面正上方进行扫描， 通过包括激光二级管和光电二极管的光学系统记录其反射。 (b)AFM尖端与柔软表面(例如生物膜)间相互作用的放大图。 与双分子脂膜结合的毒素的AFM观测。 霍乱毒素B亚基 (B5)与DAPC-25/GM1 (4:1)组成的双分子脂膜的结合。低 分辨的AFM观测(a)和高分辨下呈现的结构(b)。 AFM作为测量表面力的装置 近来一些研究小组的研究证明了AFM可以测量单个受体 －配体对的黏着（非价键）力。人们已经清楚地认识到了这 种应用的潜力。 在这些实验中往往使用一种简单的、或者经过修饰的 AFM探针，使其从远处与底物相接触，既而又迅速离开。分 别记录下接近与撤退过程中的力－距离曲线。如果在此过程 中形成了特异性的结合，那么撤退曲线将落后于接近曲线 （滞后现象），同时还可以看到一些跳跃的、不连续的点。 亲和素化的AFM尖端悬臂的表面以及生物素化的琼脂珠表面的 示意图(A)，注意琼脂珠表面的生物素有些已被亲和素占据。(B) 为AFM悬臂在琼脂珠表面的扫描电镜照片。(引自E.-L.Florin et al., Science 264:415-417, 1994) 膜蛋白的结构研究 • • • • 蛋白的膜拓扑学研究 蛋白质的晶体学研究: 3D; 2D 蛋白质的单颗粒研究: EM; AFM 蛋白质结构的波谱技术 荧光技术 分子各种能级示意图。基态用G表示，第一电子激发态用S*表示(单 线激发态，singlet excited state)，第二电子激发态用S**表示。T*表示第 一电子三重激发态(三重态，triplet state)。基态和激发态都含有几个不同 的振动能级，图中用V=0, 1, 2, 3表示。 当光子打到分子上时，大约在10-15秒内被吸收， 同时电子就跃迁到比较高的电子激发态S*或S**等。 这种跃迁的能量相应于分子的紫外-可见吸收光谱。 跃迁之后，能量较大的激发态分子通过内转换 方式(无辐射跃迁)把部分能量转移给周围的分子(如 溶剂分子)，自己回到最低电子激发态的最低振动能 级。处于最低电子激发态的最低振动能级的分子的 平均寿命大约为10-8秒左右。 如果这时分子不通过内转换的方式来消耗能量 而是通过光辐射的方式释放能量，那么分子从激发 态回到基态的各个不同振动能级时的光辐射就是荧 光。 关于“磷光” 光辐射除了荧光外还有一种磷光。磷光现象涉及分子能 量状态从电子激发态S*至T*之间的转换。这里T*是第一电 子三重激发态。当电子处于激发态时，如果其自旋方向发 生改变，这种电子激发态为三重电子激发态(triplet state， T) 。 电子从基态直接跃迁至三重激发态是不允许的(禁戒跃 迁)，即电子不能从基态发生自旋方向的改变而直接跃至三 重激发态。但电子处于激发态S*之后，处于激发态的电子 可能发生自旋方向的变化，即通过无辐射跃迁的方式降至 一个中间的亚稳态能级－三重态。电子从第一激发态向三 重态的过渡过程叫做系间交叉（intersystem crossing）。此 后电子从三重态再放出光子回到基态各振动能级时，就发 出磷光。 磷光的寿命可为10-41秒，所以，除去激发光源后，荧 光立即熄灭(其寿命约为10-8秒)，但磷光还可以持续一段时 间。 荧光光谱的一些特征 任一物质的荧光光谱及其峰位的波长总是比它的吸收光谱 及峰位波长要长。这个现象叫做光谱红移或Stokes位移。这 是因为荧光总是发自于最低激发态的最低振动能级。而激发 往往使分子处于较高的激发态或较高的振动能级，它们需要 通过内转换释放多余的能量，回到最低激发态能级才能发射 荧光，因此，荧光的能量总是比吸收的能量低。 如果我们通过其吸收光谱和荧光光谱的交叉点画一条垂直 X轴的直线，可以看到这两个光谱是镜像对称的。 荧光的第三个特征是任何物质荧光光谱的峰位与激发光波 长无关，但是荧光强度是与激发光波长有关的。 叶绿素a与叶绿素 b的吸收光谱和荧光光谱 荧光共振能量转移(FRET)的原理 共振能量转移是激发态向基态越迁时的另一种 能量释放方式。这个过程就是供体分子将能量转移 给与其相互作用的受体分子，从而供体分子回到基 态，而接受能量的受体分子被激发的过程。 表现为当用供体的特征激发波长激发时，样品 发射的荧光是受体的特征荧光。 在此过程当中，两个分子很接近但并不产生碰 撞，因此有别于因碰撞而产生的能量转移。另外共 振能量转移过程也并不是因为供体分子发光导致受 体分子的重吸收，而仅仅是由于两个振动子的振动 频率相同而发生的共振能量转移，就象一个振动的 音叉能引起附近具有相同频率的另一音叉振动一样。 共振能量转移的发生需要满足以下三个条件 一是能量供体与能量受体分子间的距离要在5～10nm 之间； 二是能量供体必须能够发荧光； 三是供体的荧光必须与受体的吸收光谱有重叠，重叠 越大转移效率越高。 两个荧光基团之间发生共振能量转移时荧光光谱示意图。图中 实线表示吸收光谱(或激发光谱)，虚线表示发射光谱。1为荧光团I 的激发谱，2为荧光团I的发射谱，3为荧光团II的激发谱，4为荧 光团II的发射谱。A，样品为荧光团I；B，样品为荧光团II；C，样品 为荧光团I与荧光团II混合。 Förster于1959年得到共振能量转移的表达式: 6 R0 E 6 6 r R0 其中，E为能量转移效率(E=1-T/0, T和0分别表示存在 和不存在共振能量转移时供体的量子产率)；R0为分子间 临界距离, 定义为能量转移效率为50%时的供体和受体间 的距离；r为两个生色团间距离. Förster公式的一个重要特征就是分子间距与能量 转移效率的6次方相关。这也意味着能量转移效率随分 子间距的增加而迅速下降。 Stryer于1967年把这种通过荧光共振能量 转移进行分子内或分子间测距的方法称为“光 谱尺”技术。 L. Stryer, R.P.Hauhland, Proc. Natl. Acad. Sci., 58 (1967) 719 Stryer 在已知长度的多聚-L-脯氨酸(n=1到12)的羧基端上加一个萘酚作为给体，在氨基端上加一个dansyl作为受体。用-萘酚的吸收波 长激发，发现dansyl的荧光是脯氨酸残基数目的函数。计算转移效率与 多聚-L-脯氨酸的链长度的函数关系，发现它服从1/R6的规律 荧光共振能量转移研究细胞内蛋白- 蛋白相互作用 根据荧光转移效率和分子间临界距离R0可以计算得到距离 值。因此荧光共振能量转移常被用于测定分子间或分子内两个 荧光位点之间的距离。 但从上世纪九十年代开始，随着结构生物学的发展，使用 X射线晶体学、电子晶体学或NMR得到生物大分子高分辨结 构正在变得越来越容易，而使用光谱学方法由于只能得到粗略 的结构信息其意义正在逐渐消退。 不过最近新技术的发展使荧光能量转移方法再次吸引了众 多研究者的注意，这种技术即在体系中引入绿色荧光蛋白 （GFP），使我们有可能通过荧光变化对活细胞内蛋白－蛋白 之间的相互作用以及蛋白的构象变化进行实时监测。 GFP是一类生物体内的荧光蛋白，它的一系列特点 使其极其适合用于活体成像观察。 首先，GFP能在许多细胞内表达，且一旦表达即能 自发发射荧光而不需要其它辅助因子的加入； 其次，通过基因工程可将GFP序列加到所要研究蛋 白序列之后，表达形成融合蛋白，实验证明这一般不影 响原有蛋白的生理功能； 第三，通过加入合适的信号肽，可将融合蛋白定位 到特殊的细胞器内，如细胞核、内质网等； 最后一点是，目前已经发现了许多GFP蛋白的变种， 这些变种可以发射不同波长的荧光（事实上很多变种都 不是发射绿色荧光，我们仍然称它们为绿色荧光蛋白家 族），这使我们能够很方便地选取荧光供体和受体。 利用荧光共振能量转移测定分子内位点间距离变化。距离 变化可导致共振能量转移现象的增强或减弱。 CFP和YFP分别 是GFP突变体，二者构成给体-受体对。 利用共振能量转移测定生物大分子的结合 荧光淬灭 通常荧光物质的量子产率会由于溶液中的各种竞争过程而减 少，人们把这一现象称作荧光淬灭。荧光淬灭有以下几种： 1．浓度淬灭：在浓度很小时，e-cl 1-e-cl，荧光强度与荧光 物质的浓度成正比。实际上，荧光强度与浓度的依赖关系在 浓度增大时荧光强度会出现下降，即产生了浓度淬灭。产生 浓度淬灭的主要原因是由于发射荧光的分子在样品池中的不 均匀分布导致样品分子光子吸收的不均匀所造成的。 2．温度淬灭：当溶液的温度升高时溶质环境的粘度下降， 溶剂与溶质分子的动能增大，运动速度加快导致荧光量子产 率减少，即产生了温度淬灭。 3．杂质淬灭：由于荧光分子与其他分子相互作用而使荧光 量子产率减少的现象称为杂质淬灭。产生杂质淬灭的机制有 多种，比如与荧光分子三重态相关的机制，与荧光化合物分 子结合产生新的化合物而影响荧光量子产率的机制等等。 杂质淬灭现象常被用于进行生物大分子结构及蛋白分子与磷 脂膜相互作用的研究 荧光淬灭法测量蛋白质的插膜深度 生物膜上经常嵌有蛋白质等其它大分子，蛋白 在膜内插入深度的是问题对于我们理解这些分子 的功能机理是很重要的。 利用荧光淬灭的原理可以测量蛋白质（或其它 生物大分子）的插膜深度。其基本原理是在磷脂 尾链的不同部位标记上淬灭基团，根据基团对蛋 白荧光的淬灭效率与基团在尾链上的标记部位来 确定蛋白荧光基团插入膜内的深度。 荧光淬灭法测量蛋白插膜深度的原理示意图 Doxyl标记的磷脂是一种常用的淬灭磷脂。其淬灭原理是其分子中的 Doxyl 基团与蛋白分子中发色团之间的电子轨道发生偶极-偶极作用。由于 Doxyl的淬灭半径很小 (对蛋白内源性荧光的有效淬灭半径约为0.5nm)，只 有在淬灭基团与发色团之间的距离很小时才能发挥作用，因此Doxyl是一类 很好的探测蛋白插膜深度的荧光淬灭探针。 图中大星为蛋白荧光基团，三个小五星为Doxyl基团，根据不同部位 Doxyl的淬灭效率来判断蛋白的插膜深度。 膜分子生物学 游击队 登顶成功，可惜神仙都被一脸幸 福地俺们吓跑了。 Thank You !