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仪器分析 第八讲 主讲教师：刘忠英 学时：32 第十一章 光致发光 荧光分析法 某些物质经光照射时，除吸收某些波长的光 之外，还能放射出能量较低（亦即波长较长）的光，这种 现象称为光致发光。 荧光 物质分子接受光子能量激发后，由激发态的最 低振动能级下降到基态时发射出的光为荧光。 荧光分析法 某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光， 根据 荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的 方法，称为荧光分析法。 种类：分子荧光，原子荧光。(紫外荧光和可见荧光，还有红 外荧光、X射线荧光等)。 特点： （1）荧光光谱第一个主要优点是灵敏度高、选择性好： 由于荧光辐射的波长比激发光波长长，因此测量到的荧光频率 与入射光的频率不同。另外，由于荧光光谱是发射光谱，可以 在与入射光成直角的方向上检测，这样，荧光不受来自激发光 的本底的干扰，灵敏度大大高于紫外-可见吸收光谱，测量用 的样品量很少，检测限低10-10 ~ 10-12g/mL。 （2）荧光光谱第二个主要优点是信息量大： 荧光光谱能提供较多的信息，例如激发光谱、发射光谱、峰位、 峰强度、荧光寿命等。在生化分析中的应用较广泛。 一、荧光分析法的基本原理 二、荧光定量分析方法 三、 荧光分光光度计 第一节 荧光分析法的基本原理 一、分子荧光 （一）分子荧光的产生 1. 分子的电子能级与激发过 程 当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较 高的轨道上，电子 自旋方向不改变，为激发单 重态； 以、S0 、 S1* 、 S2*表示. 如果电子在跃迁过程中，伴随 着自旋方向的改变，这时便 具有两个自旋不配对的电子， 这种受激态称为激发三重态； 以T1* 表示.三重态的能量较低。 2.荧光的产生 分子在室温时基本上处于电子能级的基态，当吸 收了紫外－可见光后，基态分子中的电子跃迁到 激发单重态的各个不同振动－转动能级，（不能 直接跃迁到激发三重态的各个振动能级）。 处于激发态的分子是不稳定的，以辐射跃迁和非 辐射跃迁的方式释放能量，返回基态。 非辐射能量传递过程 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子 间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分 子，回到同一电子激发态的最低振动能级的过程。 内转换：当激发态S2*的较低振动能级与S1* 的较高振动能 级的能量相当或重叠时，分子有可能从S2*的振动能级以无 辐射方式过渡到S1*的能量相等的振动能级上的过程。 外 转 换： 激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能 量的非辐射跃迁；从S1*、 T1* 最低振动能级回到基态。 外转换使荧光或磷光减弱或“淬灭”。 体系间跨跃: 当电子激发单重态的最低振动能级与电子三重激发态的 较高振动能级相重叠时，发生电子自旋状态改变的 S1*— T1* 跃迁，这一过程称为 “体系间跨跃” 。 荧光发射 无论分子最初处于哪一个激发单重态， 通过内转换及振动弛豫，均可返回到第一激发单重态 的最低振动能级，然后再以辐射形式发射光量子而返 回至基态的任一振动能级上，这时发射的光量子称为 荧光。 磷光发射 经过体系间跨越的分子再通过振动驰 豫降至激发三重态的最低振动能级，分子在激发三重 态的最低振动能级可以存活一段时间，然后返回至基 态的各个振动能级，而发出光辐射，这种光辐射称为 磷光。 S0 : S1 * , S2 * : 基态 激发单 重态 T1 * : 激发三 重态 λ1 , λ2 : 激发 光 分子吸收和发射过程的能级图 λ3 : λ4 : 荧光 磷光 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐 射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量； 传递途径 辐射跃迁 荧光 磷光 无辐射跃迁 系间跨越 内转移 外转移 振动弛豫 荧光：10-7～10 -9 s, 第一激发单重态的最低振动能级→基态各振动能级； 磷光：10-4～10s, 第一激发三重态的最低振动能级→基态各振动能级； （二）荧光的激发光谱和发射光谱 任何荧光化合物都具有两种特征光谱 物质吸收了一定频率的光，称为激发光； 物质受激后所发射的光，称为发射光或荧光。 激发光谱（excitation spectrum） : 如果将激发光的光源用单色器分光，连续测定不同波长激发光照 射下，荧光强度的变化所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱。 实际上荧光物质的激发光谱和它的吸收光谱极为相似。 荧光光谱（fluorescence spectrum） : 固定激发波长和强度（一般在激发光谱中最大激发波长处），检 测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧 光发射光谱，简称荧光光谱。 激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据 硫酸奎宁的激发光谱和荧光光谱 荧光光谱的特点： ① 与激发光谱相比，荧光光谱的波长总是出现在更长的波 长处； ② 荧光光谱与激发波长无关。电子跃迁到不同激发态能级， 吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激 发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定 的荧光。 ③ 吸收光谱与发射光谱大致成镜像对称。 仪器分析 第 九讲 主讲教师：刘忠英 学时：32 二、荧光与分子结构 一种物质分子能否发射出荧光，取决于它的结构特征 ①物质必须具有能吸收一定频率紫外光的特定结构； ②物质分子在吸收了一定频率的紫外光之后，必须具 有较高的荧光效率。 荧光物质的重要发光参数荧光寿命和荧光效率。 荧光寿命：除去激发光源后，荧光强度降低到最大荧光强 度的1/e所需的时间. 利用分子荧光寿命的差别，可以进行荧光物质混合物的分 析。 荧光效率：荧光量子产率 发荧光的分子数目与基态分子吸收激发光的光子数的 比值即 荧光效率 发射荧光的光子数 吸收激发光的光子数 (二)荧光与分子结构的关系 1.碳原子骨架----具有共轭双键体系的分子。能够吸收紫外 可见光，易发生π→π*或n→π*跃迁， π电子的共轭程度 越大，越易被激发而产生荧光，荧光强度越大，荧光波长也 长移。 ─(CH=CH)2─ φ=0.28 ─(CH=CH)3─ φ=0.68 2. 分子的几何排布--分子的刚性平面结构有利于荧光的产生。 刚性平面结构可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用， 故具有很强的荧光。 如荧光素和酚酞有 相似结构，荧光素 有很强的荧光，酚 酞却没有。 3. 取代基 给电子，增加共轭程度 －NH2、－OH、－OCH3 荧光效率提高，长移 吸电子，减弱共轭程度 －COOH、－Cl 荧光效率减弱，短移 对共轭作用小，－R ，对荧光影响不明显 （三）荧光试剂 提高灵敏度和选择性 1. 荧光胺－与脂肪族、芳香族伯胺形成衍生物 275nm、390nm，480nm 2. 邻苯二甲醛－伯胺340nm，455nm 3. 丹酰氯－伯仲胺及酚基的生物碱 4. 无机离子－有机物 形成配合物 －－荧光 （还有一些干扰物荧光减弱或熄灭） Fura-2是一种荧光指示剂可与胞内的游离钙离子 特异结合，其游离（未结合）形式的Fura-2比与 钙结合形式的Fura-2在更长的波长上被激发， 即： 结合形式的Fura-2激发波长为340nm，游离形式的 Fura-2激发波长为380nm。 因此通过检测两个激发波长上荧光强度的比率， 就可以确定 结合钙的Fura-2与未结合的Fura-2的 比例，进而可求游离Ca 2+的浓度。 三、影响荧光强度的外部因素 （1）温度：荧光强度一般随温度降低而提高， 有些荧光仪的液槽配有低温装置，使荧光强度增大， 以提高测定的灵敏度。在高级的荧光仪中，液槽四周 有冷凝水并附有恒温装置，以便使溶液的温度在测定 过程中尽可能保持恒定。 （2）溶剂：溶剂能影响荧光效率、荧光强度； 溶剂极性增强，荧光强度增强； 溶剂极性粘度降低，荧光强度减弱； 因此，在测定时必须用同一溶剂。 （3）酸度：荧光光谱和荧光效率常与溶液的酸度有关， NH2 NH3 OH H pH<2 无荧光 NH OH H 7-12 蓝色荧光 >13 无荧光 表明产生荧光的是苯胺分子 因此，须通过条件试验，确定最适宜的pH值范围。 （4）荧光熄灭剂 荧光淬灭：荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子之 间所发生的导致荧光强度下降、消失,或荧光强度与 浓度不呈现线形关系的现象。 引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂。 定量：荧光强度的减弱—正比—荧光熄灭剂 （5）散射光 光子与物质分子 方向改变，波长不变－－－瑞利散射 方向改变，波长改变－－－拉曼散射 选择适当溶剂、适当的波长 干扰荧光 第二节 荧光定量分析方法 由于荧光物质是在吸收光能而被激发之后才发射 荧光的，因此溶液的荧光强度与该溶液中荧光物质 吸收光能的程度以及荧光效率有关。 一、荧光强度与物质浓度的关系 F = φIa 其中 Ia = I0- It I0 ——入射光强度； It ——透射光强度； φ ——荧光效率（荧光量子产率） I0 It F 根据朗伯-比尔定律 A lg I 1 lg o b c T It It I 0 e 2.303bc Ia=I0-It=I0(1- e-2.303εbc) = 2.303 I0 εbc ∵ F = I aφ = 2.303 φ I0 εbc ∴ F = KC (K = 2.303φI0εb) 当I0一定并且浓度C很 小时(A＜0.05),溶液 的荧光强度与该溶液 中荧光物质的浓度成 正比，即 F = K·C 上式为荧光定量分析 的基本关系式。 F c 一般当εb c 0.05 时, F 与c呈线性关系； 荧光分析测定的是弱背景上的荧光强度，其灵敏度 取决于检测器的灵敏度，经过光电倍增管和放大器， 可以检测微弱的荧光信号。 定量测定 荧光分析法的定量测定方法较多，常用的有以下两种。 （1）标准曲线法：将已知含量的标准品经过和样品同样处理 后，配成一系列标准溶液，测定其荧光强度，以荧光强度对 荧光物质含量绘制标准曲线。再测定样品溶液的荧光强度， 由标准曲线便可求出样品中待测荧光物质的含量。 F F=KC Fx cx 标准工作曲线图 C （2）比例法（直接比较法）：配制已知对照品溶液的浓 度Cs，测定其荧光强度Fs，然后在同样条件下测定试样溶液的 荧光强度Fx ,便可求得试样中荧光物质的含量Cx 。 如果空白溶液的荧光强度调不到零，则必须从Fs和Fx值中扣除 空白溶液的荧光强度F0，然后进行计算。 F s F0 F x __F 0 = Cs Cx 求出 Cx （3）联立方程法：多组分混合物的荧光分析 定性分析 在分光光度法中，被测物质只有 一种特征的吸收光谱。 荧光物质的光谱包括激发光谱和 荧光光谱两种。因此，鉴定物质 的可靠性较强。 当然，必须在标准品对照下进行 定性。 第三节 荧光分光光度计 由光源、单色器、样品池、检测器和记录系统五部分组成。 单色器 I0 It 样品池 IF 光源 单色器 显示器 检测器 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角 光源 一般由氙灯提供。在200nm—700nm能发射连续光谱， 且强度大,为荧光物质的激发提供光能。 氙灯结构示意图 单色器(两个) 滤光片荧光计：激发滤光片让激发光通过；发射滤光片 用截至滤光片，只用于定量分析。 滤光片-单色器荧光计：用光栅代替发射滤光片，可测荧 光光谱。 荧光分光光度计：激发滤光片和发射滤光片都由光栅代 替，可绘制激发光谱和荧光光谱。 3．样品池 用来盛放待测溶液。比色杯由石英材料制成， 比色杯以方形为主,四壁透光。 4．检测器 检测待测物质所发射的荧光信号。将光信号转 变为电信号，进而以数字形式输出。 荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点： a.荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响； b.荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较好的激发 光并消除其它杂散光干扰。 荧光检测法（fluorescence detector, FLD）应用 是一种选择性检测方法，只能用于具有荧光活性的化合物 （如含有芳香基团的化合物）的检测，灵敏度可比UV检测器 高2-3个数量级，检测限可达pg量级或更低。 对无荧光活性的物质，可在样品或高效液相色谱系统中加 入荧光试剂进行柱前或柱后衍生化，以实现高灵敏度检测。 在芳烃、甾族化合物、氨基酸、维生素、酶和蛋白质及体 内药物分析中，荧光检测法是较为理想的高效液相色谱检测 方法，其主要缺点是样品适用范围有限。 生物化学分析，生理医学研究，临床检测. 直接测定能产生荧光的物质. 带苯环的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸. 测定能与荧光试剂反应生成荧光化合物的物质. 荧光生色团标记蛋白质，研究蛋白质的结构； 致癌物同核酸结合常引起显著的荧光； 无机离子（Mg2+、Al3+、Zn2+、Be+等）可同试剂形成荧 光络合物。 其它荧光技术 激光荧光分析：以激光为光源，单色性好，强度大。 时间分辩荧光分析：物质的荧光寿命时间差。 同步荧光分析： Δ λ ＝ λmaxEX－λminEM 尖而窄的同步荧光峰