Transcript 4：核酸化学
核酸化学 概 述 核酸(nucleic acid) 以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携 带和传递遗传信息。 DNA（Deoxyribonucleic acid)脱氧核糖核酸 RNA（Ribonucleic acid) 核糖核酸 核酸化学 一、核酸的发现和研究工作进展 • 1868年 Fridrich Miescher从脓细胞中提取“核素” • 1944年 Avery等人证实DNA是遗传物质 • 1953年 Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构 • 1968年 Nirenberg发现遗传密码 • 1975年 Temin和Baltimore发现逆转录酶 • 1981年 Gilbert和Sanger建立DNA 测序方法 • 1985年 Mullis发明PCR 技术 • 1990年 美国启动人类基因组计划(HGP) • 1994年 中国人类基因组计划启动 • 2001年 美、英等国完成人类基因组计划基本框架 核酸化学 二、核酸的分类及分布、功能 脱氧核糖核酸 (deoxyribonucleic acid, DNA) 90%以上分布于细胞核，其余分布于 核外如线粒体，叶绿体，质粒等。 携带遗传信息，决定细胞和个 体的基因型(genotype)。 核糖核酸 分布于胞液、胞核。 (ribonucleic acid, RNA) 参与细胞内DNA遗传信息的表 达。某些病毒RNA也可作为遗 传信息的载体。 核酸化学 第一节 核酸的分子组成 核酸化学 一、元素组成 主要元素组成： C、H、O、N、P(9~11%) 与蛋白质比较，核酸一般不含S，而P的含量较 为稳定，占9-11%。 二、基本构成单位：核苷酸(nucleotide) 核苷酸由戊糖、磷酸和含氮碱三部分构成 核酸化学 戊 糖 碱 基 核酸化学 核酸化学 胺 式 亚 胺 式 互 变 异 构 核酸化学 酮 式 烯 醇 式 互 变 异 构 核酸化学 碱基的结构特征 嘌呤碱和嘧 啶碱分子中 都含有共轭 双键体系， 在紫外区有 吸 收 （ 260 nm左右）。 核酸化学 核酸化学 核苷 nucleoside 糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键。 OH NH2 N N N N HOCH2 N O H H H OH N H2N N N HOCH2 O H H H OH ÏÙàÑßʺËÜÕ H H OH OH NH2 OH Äñ àÑßʺËÜÕ N N HO HOCH2 HOCH2 O H H OH °ûà×ऺËÜÕ 核糖核苷：AR, GR, UR, CR 脱氧核苷：dAR, dGR, dTR, dCR N O H H H OH HO N H H H OH OH Äòà×ऺËÜÕ 核酸化学 核苷酸(ribonucleotide)的结构与命名 核 苷 和 磷 酸 以 磷 酸 酯 键 连 接 核酸化学 稀有核苷酸 修饰成分 核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。 稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱 基的甲基化产物。 核酸化学 核酸化学 核酸化学 1、核苷酸的组成：含氮碱基、戊糖和磷酸。 2、稀有核苷酸：稀有碱基/核苷/核苷酸 3、核苷酸的其他形式 多磷酸核苷（NDP、NTP) 环化核苷酸（cAMP、cGMP等） 辅酶或辅基（NAD、NADP、FAD、CoA等， 均含有AMP） 活性代谢物（UDPG、CDP-胆碱，等） 某些细菌中有ppGpp和pppGpp，参与rRNA 合成的调控 核酸化学 核酸化学 • ATP 分子的最显著特点是含有 两个高能磷酸键。ATP水解时, 可以释放出大量自由能。 • ATP 是生物体内最重要的能量 转换中间体。ATP 水解释放出 来的能量用于推动生物体内各 种需能的生化反应。 • ATP 也是一种很好的磷酰化剂。 磷酰化反应的底物可以是普通 的有机分子，也可以是酶。磷 酰化的底物分子具有较高的能 量（活化分子），是许多生物 化学反应的激活步骤。 ATP的性质 核酸化学 cAMP和cGMP • cAMP(3’,5’- 环 化 腺 苷酸)和cGMP(3’,5’环化鸟苷酸)的主要 功能是作为细胞的 第二信使。 • cAMP 和 cGMP 的 环 状 磷酯键是一个高能 键。在pH7.4, cAMP 和 cGMP 的 水 解 能 约 为43.9 KJ/mol，比 ATP水解能高得多。 核酸化学 核酸化学 核酸化学 第二节 核酸的分子结构 核酸化学 一、一级结构（primary structure） 一级结构是指核酸分子中核苷酸的排列顺序及 连接方式。核苷酸的排列顺序代表了遗传信息。 1、核苷酸的连接方式： 3, 5磷酸二酯键 2、核酸的基本结构形式：多核苷酸链 信息量：4n 末端： 5 端、 3端 多核苷酸链的方向： 5ˊ端→3ˊ端(由左至右) 3、表示方法：结构式、线条式、文字缩写 核酸化学 核酸化学 真核生物和原核生物的区别 真核生物:有核膜,有细胞核(本质区别)；有多种细胞器；细胞 壁由纤维素和果胶组成；DNA和蛋白质结合构成染色体等。 包含生物:动物、植物、真菌、原生生物等。 原核生物:无成形的细胞核，有拟核；只有核糖体；细胞壁由 多糖和蛋白质组成；DNA不和蛋白质结合，没有染色体等。 包含生物:细菌、支原体、衣原体、放线菌、蓝藻等。 核酸化学 真核生物和原核生物DNA序列（基因组）的特征 （一）真核生物DNA序列（基因组）的特征 1、存在大量重复序列，长度可长可短，短的仅含两个核苷酸，长的 多达数百、乃至上千，重复频率也不尽相同。 高度重复序列重复频率可达106次，包括卫星DNA、较复杂的重复 单位组成的重复序列； 中度重复序列可达103～104次，如为数众多的Alu家族序列，KpnI 家族，Hinf家族序列，以及一些编码区序列如rRNA基因、tRNA基因、 组蛋白基因等； 单拷贝或低度重复序列，指在整个基因组中只出现一次或很少几次 的核苷酸序列，主要是编码蛋白质的结构基因，在人基因组中占约 60～65%，因此所含信息量最大。 核酸化学 2、反向重复序列(inverted repeats)，又称回文序列(palindrome)，双 链DNA分子中存在的以相反方向排列的完全相同的序列。回文结构常作 为一种特别信号，如内切酶及调节蛋白的识别位点，转录终止信号等 如： 5'-g a a t t c-3' 3'-c t t a a g-5' 3、真核细胞基因转录产物为单顺反子(monocistron)，即一个结构基因 转录、翻译成一个mRNA分子，一条多肽链。 4、基因组中不编码的区域多于编码区域。 5、基因是不连续的，在真核生物结构基因的内部存在许多不编码蛋白质 的间隔序列(intervening sequences)，称为内含子(intron)，编码区则称 为外显子(exon)。内含子与外显子相间排列，转录时一起被转录下来，然 后RNA中的内含子被切掉，外显子连接在一起成为成熟的mRNA，作为 指导蛋白质合成的模板。 hnRNA 6、基因组远大于原核生物的基因组，具有许多复制起点，而每个复制子 的长度较小。 核酸化学 （二）原核生物DNA序列（基因组）的特征 1、基因组较小，没有核膜包裹，且形式多样，如病毒基因组可能是 DNA，也可能是RNA，可能是单链的，也可能是双链的，可能是闭环分 子，也可能是线性分子；细菌染色体基因组则常为环状双链DNA分子。 2、功能相关的结构基因常常串连在一起，并转录在同一个mRNA分子中， 称为多顺反子mRNA(polycistronic mRNA)，然后再加工成蛋白质的模 板mRNA。 3、DNA分子绝大部分用于编码蛋白质，不编码部分(又称间隔区)通常包 含控制基因表达的顺序。例如，噬菌体ψX 174中只有5%是非编码区。 4、基因重叠是病毒基因组的结构特点，即同一段DNA片段能够编码 两种甚至三种蛋白质分子。 5、除真核细胞病毒外，基因是连续的，即不含内含子序列。 核酸化学 二、DNA的空间结构 DNA双螺旋结构的研究背景 DNA纤维的X-线衍射图谱分析 碱基的理化数据分析：A-T、G-C 以氢键配对较合理 碱基组成分析——Chargaff 规则： [A] = [T]；[G] [C] 核酸化学 （一）DNA的二级结构（secondary structure） 1、碱基组成规则(Chargaff规则) [A]=[T]，[G]=[C]； [A]+[G]=[T]+[C](嘌呤与嘧啶的总数相等) 有种属特异性（碱基组成比例） 无组织、器官特异性 不受年龄、营养、性别及其他环境等影响 核酸化学 不同生物来源的DNA四种碱基比例关系 DNA来源 腺嘌呤（A）胸腺嘧啶（T）鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）（A+T）/（G+C） 大肠杆菌 26.0 23.9 24.9 25.2 1.04 小麦 27.3 27.1 22.7 22.8 1.00 鼠 28.6 28.4 21.4 21.4 1.00 人：肝 30.3 30.3 20.5 20.5 0.99 人：胸腺 30.9 29.4 19.9 19.8 1.03 酵母 31.3 32.9 18.7 17.5 1.079 核酸化学 double helix model DNA双螺旋结构的特点 • DNA 分 子 由 两 条 DNA 单 链组成。 • DNA的双螺旋结构是分 子中两条DNA单链之间 基团相互识别和作用 的结果。 • 双螺旋结构是DNA二级 结构的最基本形式。 核酸化学 DNA双螺旋结构的要点 （1）DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链(简 称DNA单链)组成。两条链沿着同一根轴平行盘 绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方 向相反，即其中一条链的方向为5′端→3′端， 而另一条链的方向为3′端→5′端。 核酸化学 （2）嘌呤和嘧 啶碱基位于 螺旋的内侧， 磷酸和脱氧 核糖基位于 螺旋外侧。 碱基环平面 与螺旋轴垂 直，糖基环 平面与碱基 环 平 面 成 90°角。 核酸化学 （3）螺旋横截面的 直径约为2nm，每 条链相邻两个碱 基平面之间的距 离为0.34 nm，每 10个核苷酸形成 一个螺旋，其螺 矩（即螺旋旋转 一圈的高度）为 3.4 nm。 核酸化学 （4）维持两条DNA链相 互结合的力是链间碱基 对形成的氢键。碱基结 合具有严格的配对规 律:A与T结合，G与C结 合，这种配对关系，称 为碱基互补。A和T之间 形成两个氢键，G与C之 间形成三个氢键。 • 在DNA分子中，嘌呤碱 基的总数与嘧啶碱基的 总数相等。 核酸化学 核酸化学 （5）螺旋表面形成大沟 (major groove)及小沟 (minor groove)，彼此相间 排列。小沟较浅；大沟较深， 是蛋白质识别DNA碱基序列 的基础。 （6）氢键维持双链横向稳定 性；碱基堆积力维持双链纵 向稳定性（芳香族碱基间的 π电子间相互作用）。 核酸化学 （二）二级结构： 双螺旋结构模型(double helix model) 1、Watson-Crick双螺旋结构模型(B-DNA) （1）反平行双链：脱氧核糖-磷酸骨架位于外侧， 碱基对位于内侧 （2）碱基互补配对：AT配对（两个氢键）， GC配对（三个氢键）；碱基对平面垂直纵轴 （3）右手双螺旋：螺距为3.4 nm，直径为2.0 nm，10bp/圈 核酸化学 （4）表面功能区：小沟较浅；大沟较深，是蛋 白质识别DNA碱基序列的基础 3、其他螺旋形式 Z-DNA（左手双螺旋） A-DNA 核酸化学 DNA double helix类型 helix type bp/turn rotation/bp vertical rise/bp helical d A 11 +34.7 0.26nm 2.3nm B 10.4 +34.6 0.34nm 1.9nm Z 12 -30.0 -0.38nm 1.8nm 核酸化学 核酸化学 核酸化学 核酸化学 DNA双螺旋的稳定性 • DNA双螺旋结构在生理条件下很稳定。 • 维持这种稳定性的因素包括：两条DNA链之间形 成的氢键，碱基堆积力。 • 双螺旋结构内部形成的疏水区，消除了介质中 水分子对碱基之间氢键的影响； • 介质中的阳离子（如Na+、K+和Mg2+）中和了磷酸 基团的负电荷，降低了DNA链之间的排斥力等。 • 改变介质条件和环境温度，将影响双螺旋的稳 定性。 核酸化学 天然存在的DNA分子最显 著的特点是很长，分子质量很 大，一般在106～1010。 大肠杆菌染色体由400万碱基 对(basepair，bp)组成的双螺 旋DNA单分子。其长度为 1.4×106nm，相当于1.4mm， 而直径为20nm，相当原子的 大小。 黑腹果蝇最大染色体由 6.2×107bp组成，长2.1cm 多瘤病毒的DNA由5100bp组 成 ，长1.7μm 核酸化学 （二）DNA的三级结构 双螺旋进一步扭曲,形成一种比双螺旋更高层 次的空间构象。包括：线状DNA形成的纽结、 超螺旋和多重螺旋、环状DNA形成的结、超螺 旋和连环等 核酸化学 大多数原核生物 ： 1）共价封闭的环状 双螺旋分子 2）超螺旋结构：双 螺旋基础上的螺旋化 正超螺旋(positive supercoil):盘绕方向与 双螺旋方同相同 负超螺旋(negative supercoil):盘绕方向与 双螺旋方向相反 核酸化学 核酸化学 （三）DNA在真核生物细胞核内的组装 真核生物中，DNA与组蛋白形成核小体结构时， 存在着负超螺旋。核小体是构成染色质的基本 结构单位，每个核小体单位包括200bp左右的 DNA和一个组蛋白八聚体以及一个分子的组蛋 白H1 核酸化学 核小体(nucleosome)： 由DNA和组蛋白构成。 组蛋白(histones)是一种碱性蛋白 质，等电点在10.0以上，富含 (赖氨 酸和精氨酸)，根据这两种氨基酸在 蛋白质分子中的相对比例，将组蛋白 分为五种类型：H1,H2B,H2A,H3,H4 组蛋白核心：H2B,H2A,H3,H4 DNA：以负超螺旋缠绕在组 蛋白上 H1组蛋白在核小体之间 核酸化学 核酸化学 DNA的存在形式 核酸化学 核酸化学 （三）DNA的功能 DNA的基本功能是以基因的形式荷载遗 传信息，并作为基因复制和转录的模板。它 是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动 的信息基础。 基因从结构上定义，是指DNA分子中的 特定区段，其中的核苷酸排列顺序决定了基 因的功能。 核酸化学 三、RNA的分子结构 DNA是遗传信息的载体，遗传信息的作用通常 由蛋白质的功能来实现，但DNA并非蛋白质合 成的直接模板，合成蛋白质的模板是RNA。正 常细胞遗传信息的流向是： 三、RNA的分子结构 注：原核细胞不含后三种RNA 核酸化学 核酸化学 RNA的结构特点 • RNA是单链分子，在RNA分子中，嘌呤的总数不一 定等于嘧啶的总数。 • RNA分子中，部分区域也能形成双螺旋结构，不能 形成双螺旋的部分，则形成单链突环。这种结构 称为“发夹型”结构。 • 在RNA的双螺旋结构中，碱基的配对情况不象DNA 中严格。其碱基组成特点是含有尿嘧啶(U)而不含 胸腺嘧啶，G 除了可以和C 配对外，也可以和U 配对。G-U 配对形成的氢键较弱。不同类型的RNA, 其二级结构有明显的差异。 • tRNA中除了常见的碱基外，还存在一些稀有碱基， 这类碱基大部分位于突环部分. 核酸化学 核酸化学 （一）信使RNA的结构与功能 * 真核生物mRNA的结构特点 1. 大多数真核mRNA的5´端均在转录后加上一个7-甲基 鸟苷，并以核糖的5´焦磷酸与相邻的核苷酸相连， 形成5´ － PPP－ 5´，同时相连的核苷酸的C´2也是甲 基化（Nm)，形成帽子结构：m7GpppNm。 2. 大多数真核mRNA的3´末端有一个多聚腺苷酸(polyA) 结构，称为多聚A尾。 核酸化学 帽子结构和多聚A尾的功能 Poly(A)作用： mRNA核内向胞质的转位 mRNA的稳定性维系,3’-末端避免核酸酶降解 增加mRNA翻译的效率 帽子结构作用：抗核酸酶水解；蛋白质合成起始 核酸化学 * 真核生物mRNA成熟过程 内含子 (intron) 外显 子 (exon) hnRNA mRNA 核酸化学 * mRNA的功能 把DNA所携带的遗传信息，按碱基互 补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以 决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。 真核细胞 原核细胞 细胞质 外显子 DNA 细胞核 内含子 DNA 转录 转录 hnRNA mRNA 转录后剪接 转运 翻译 蛋白 mRNA 翻译 蛋白 核酸化学 （二）tRNA的结构与功能 * tRNA的一级结构特点 含 10~20% 稀有碱基， 如 DHU 3´末端为 - CCA-OH 5´末端大多数为G 具有 TC 次黄嘌呤(I) O H H H H NH NH O 双氢尿嘧啶(DHU) 假尿嘧啶() 核酸化学 * tRNA的二级结构 ——三叶草形 氨基酸臂 氨基酸臂 DHU环 反密码环 额外环 额外环 TΨC环 核酸化学 核酸化学 * tRNA的功能：活化、搬运氨基酸到核糖体， 参与蛋白质的翻译。 核酸化学 小结 1、分子较小，含较多的稀有碱基和非标准碱基配对 2、5’端一般为鸟嘌呤核苷酸，3’端为CCA-OH3’。 3、二级结构为“三叶草”型（cloverleaf pattern） 反密码环：反密码环中部的三个碱基可以与 mRNA的三联体密码形成碱基互补配对，解读遗 传密码，称为反密码子（anticodon）。次黄嘌 呤核苷酸（肌苷酸，I）常出现于反密码子中 核酸化学 氨基酸臂：3`末端的CCA-OH3`单链 用于连接该tRNA转运的氨基酸。 5’ ACC 二氢尿嘧啶环（DHU）：识别氨 酰-tRNA合成酶 TΨC环：识别核蛋白体（核糖体） DHU环 T环 额外环 反密码环 核酸化学 4、“倒L”型三级结构 图 tRNA的二级与酵母苯丙氨酸tRNA A.二级结构(a示反密码环及反密码) B.三级结构(数字示可能的非常见核苷酸对相互作用) 核酸化学 （三）rRNA的结构与功能 * rRNA的功能:组成核蛋白体，作为蛋白质合成的场所。 核蛋白体的组成 原核生物（以大肠杆菌为例） 真核生物（以小鼠肝为例） 小亚基 30S 40S rRNA 16S 1542个核苷酸 18S 1874个核苷酸 蛋白质 21种 占总重量的40% 33种 占总重量的50% 大亚基 50S 60S rRNA 23S 5S 2940个核苷酸 120个核苷酸 28S 5.85S 5S 4718个核苷酸 160个核苷酸 120个核苷酸 蛋白质 31种 占总重量的30% 49种 占总重量的35% 核酸化学 图 原核生物与真核生物核蛋白体的结构比较 核酸化学 图 大肠杆菌16SrRNA的结构 核酸化学 （四）其他小分子RNA及RNA组学 除了上述三种RNA外，细胞的不同部位存在 的许多其他种类的小分子RNA，统称为非mRNA 小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs),或 非编码蛋白质的RNA(non-coding RNA, ncRNA) 。 种类：核内小RNA（snRNA)；核仁小RNA （snoRNA) ；胞 质小RNA （scRNA) ；催化性小RNA；小片段干涉RNA 功能：参与hnRNA和rRNA的加工和转运。ncRNA在基因 表达以及应激信号传导等方面起着重要的调节作用。因此， 有人也将其称为调节RNA（regulatory RNA）。 核酸化学 小片段干扰RNA （siRNA；又称“引导RNAs”， guide RNAs）：一些小的双链RNA可以高效、特异 的阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，诱使细 胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNA interference，RNAi，也译作RNA干预或干涉）。 它是体内抵御外在感染的一种重要保护机制。 核酸化学 RNAi的作用机制：包括起始阶段和效应阶段。（1） 在起始步骤，生物宿主将外源基因表达的双链RNA 进行切割，产生具有特定长度（19-21nt）和序列 的小片段RNA； （2）在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复 合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RISC）。 激活RISC需要一个ATP依赖的将siRNA解双链的过程。 激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上， 并在距离siRNA3'端12个碱基的位置切割mRNA。 核酸化学 RNA组学: RNA组学研究细胞中snmRNAs的种类、 结构和功能。同一生物体内不同种类的细胞、 同一细胞在不同时间、不同状态下snmRNAs 的表达具有时间和空间特异性。 核酸化学 第三节 核酸的理化性质 核酸化学 一、酸性化合物 两性解离，但酸性强 电泳行为——泳向正极（pH7-8） 二、高分子性质 沉淀行为——加盐（中和电荷）；乙醇 粘度 DNA>RNA 刚性（双螺旋结构），易受剪切力作用 易降解，易受溶液中DNA酶的作用 超离心沉降 凝胶过滤 分子大小单位：分子量（道尔顿，D）、碱基对数 目（bp）、离心沉降常数（S） 核酸化学 紫外吸收 核酸化学 OD260的应用 1. DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA（或RNA） 20μg/ml寡核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 核酸化学 三、紫外吸收 最大吸收波长：260nm 核酸定量分析 核酸定性分析 四、变性、复性、分子杂交 1、DNA变性（DNA denaturation）：DNA变性 是指在理化因素作用下，DNA分子中的氢键断裂， 碱基堆积力遭到破坏，双螺旋结构解体，双链分开 形成单链的过程。 核酸化学 DNA的变性(denaturation) 方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰 胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。 DNA变性的本质是双链间氢键的断裂 变性后其它理化性质变化：OD260增高；粘度下 降；比旋度下降；浮力密度升高；酸碱滴定曲 线改变；生物活性丧失。 核酸化学 DNA变性 核酸化学 增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。 核酸化学 实验室常用的方法——热变性 • 当DNA的稀盐溶液加热到80-100℃时，双螺旋结构 即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。 OD260（254） ③ 100% ② 50% ① 80 Tm90 100 ℃ 变性温度范围 融解温度（melting temperature,Tm）：DNA热变 性过程中，紫外吸收达到最大值的一半时溶液的温 度称为融解温度（Tm）或解链温度、变性温度。 核酸化学 影响Tm值的因素 (1)溶液的性质 大肠杆菌DNA在不同浓度KCl溶液下的 熔融温度曲线 (2)DNA的性质和组成 核酸化学 GC含量越高，Tm越大 核酸化学 （1）变性后理化性质改变 DNA溶液的粘度降低 浮力密度增加 旋光偏振光改变 紫外吸收增加（增色效应） 高色效应（hyperochromic effect）：DNA变 性后，在260nm处的紫外吸收增高，称为高色效 应或增色效应。 （2）变性后的DNA一级结构没有改变。 核酸化学 （3）融解温度（melting temperature,Tm）： DNA热变性过程中，紫外吸收达到最大值的一半 时溶液的温度称为融解温度（Tm） GC含量越高，Tm越大 DNA越长，Tm越大 溶液离子强度增高，Tm值增加 DNA越纯，相变范围越小 核酸化学 2、DNA复性 DNA复性(renaturation)的定义:在适当条件下， 变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象， 这一现象称为复性。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过 程称为退火(annealing) 。 减色效应（hypochromic 其溶液OD260降低。 effect ）:DNA复性时， 核酸化学 DNA复性 核酸化学 核酸分子杂交(hybridization) 在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类 的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要 两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系， 在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不 同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。 这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形 成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA 分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。 核酸化学 核 酸 的 杂 交 核酸化学 核酸化学 变性 不同来源的 DNA分子 核酸分子杂交的应用: 研究基因的位置 确定两种核酸序列的相似性 检测样品中的特异序列 基因芯片技术的基础 复性 DNA-DNA 杂交双链分子 核酸化学 核酸探针（nucleic acid probe）:能特异性的探测带某一 特定序列的DNA或RNA分子的标记核酸分子。 核酸化学 3、核酸分子杂交(hybridization) 由不同来源的核酸单链形成杂化双链的过程 分子杂交技术的应用：基因克隆筛选、酶切图 谱制作、特定基因序列的定量和定性、突变分 析、疾病诊断等 核酸化学 4、核酸的分离 DNA的分离：DNA以核蛋白体DNP形式存在，DNP 不溶于低盐溶液而从细胞匀浆中分离，DNP的蛋白部分 可用SDS及氯仿－异戊醇抽提，冷冻离心，以除去蛋白， DNA溶于上层水相中，加入等体积冷乙醇，DNA以丝状 沉淀下来。 RNA的分离：酸性胍盐/苯酚/氯仿抽提。 注意事项：防止过酸过碱、剧烈搅拌、核酸酶作用等。 RNA分离的操作要求更加严格。 核酸化学 核酸的核苷酸序列测定 DNA的一级结构决定了基因的功能，欲想解释基因的生物 学含义，首先必须知道其DNA顺序。DNA序列分析是分子 遗传学中一项既重要又基本的课题。 人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）是人类生命科 学史上最伟大的工程之一，是人类第一次系统、全面地解读和研究人 类遗传物质DNA的全球性合作计划。 人类基因组是指合成有功能的人体各类细胞中蛋白质及（或）多肽链 和RNA所必须的全部DNA顺序和结构，包括人类的23对染色体上全 部的DNA所携带的遗传信息的总和，即30亿个碱基对的序列，估计含 约10万个基因。 核酸化学 HGP的基本任务可用4张图谱来概括，即遗传图谱，物理图谱，序列图谱和 基因图谱。 终极目标：阐明人类基因组全部DNA序列；识别基因；建立储存这些信息 的数据库；开发数据分析工具；研究HGP实施所带来的伦理、法律和社会 问题。 中国的HGP始于1994年，是在吴旻，强伯勤，陈竺，杨焕明等人的倡导下 启动的。最初由国家自然科学基金委员会和“863”高科技计划的支持下， 先后启动了“中华民族基因组中若干位点基因结构的研究”和“重大基因相 关基因的定位、克隆、结构与功能研究”。 1998年3月由陈竺院士挂帅成立上海中心，10月改名为中国南方基因中心。 1998年由杨焕明和余军教授组织中国科学院遗传所相关力量，在北京成立 了中国科学院北京人类基因组中心；1999年由强伯勤院士挑头在北京成立 了北方人类基因组中心。 核酸化学 一、化学裂解法：标、切、分、染、读 具体操作如下： (1)先将DNA的末端之一进行标记（常为放射性同位素32P） ； (2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰； (3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链； (4)聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开； (5)根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列。 核酸化学 核酸化学 二、合成终止法（双脱氧DNA链合成终止法） ： 标、合、分、染、读 DNA的合成总是从5′端向3′端进行的。DNA的合成需要模板以及相应的引导 核酸链。在合成的DNA链的3′末端，依据碱基配对的原则，通过生成新的3′， 5′－磷酸二酯键，使DNA链合成终止，产生短的DNA链。 具体操作如下： 平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，相同的引物以及四种脱 氧核苷酸； 在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入 DNA链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的 DNA链。 四组DNA链经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影 显示区带，就可以直接读出被测DNA的核苷酸序列。 核酸化学 核酸化学 核酸化学 核酸化学 重要内容： 1、重要名词：anticodon；DNA denaturation；melting temperature （Tm）；hyperochromic effect；renaturation；annealing；hybridization；2、 结构层次 元素组成：C、H、O、N、P(9~11%) 结构单位：核苷酸（DNA和RNA组分的异同；核苷酸的功能） 一级结构：3, 5磷酸二酯键；5ˊ端→3ˊ端；RNA类型及结构和功能特点 二级结构：DNA双螺旋；tRNA“三叶草” 三级结构特点：DNA超螺旋结构；tRNA“倒L”结构 3、重要性质：紫外吸收；变性、分子杂交