Transcript 第二章 DNA的结构

第二章 DNA的结构

第一节 遗传物质的本质

第二节 核酸的化学组成

第三节 DNA的二级结构

第四节 DNA的物理化学性质

第五节 超螺旋和拓扑异构
第一节 遗传物质的本质
一、DNA携带两类不同的遗传信息
DNA的特征
1、 遗传物质必须具有的特性
a、贮存并表达遗传信息
各异的碱基序列储存大量的
遗传信息
1kb DNA序列
b、能把信息传递给子代
41000 种遗传信息
DNA的复制是其表达和传
递遗传信息的基础
c、物理和化学性质稳定
生理状态下物理、化学性质
稳定
d、具有遗传变化的能力
有突变和修复能力，可稳定遗
传是生物进化的基础
2、 DNA携带两种遗传信息
a 、 编 码 蛋 白 质 和 RNA 的 信 息 ( 编 码
tRNA、 rRNA)
64个三联体密码子
3个终止密码子
编码氨基酸的61个密码子有简并性、通用
性
b、编码基因选择性表达的信息
基因选择性表达表现在：
细胞周期的不同时相中
个体发育不同阶段
不同的器官和组织
不同的外界环境下基因的表达与否以及量
的差异
*
原核生物的结构基因占Genome的比例很大
Φx174phage
5386bp
结构基因用去5169bp
比例达96％
*
真核生物的结构基因占Genome的比例很小
哺乳动物中结构基因只占10％～15％
其余80％以上的DNA起什么作用目前还无
法精确解释，但可以肯定其中大部分DNA
序列是编码基因选择性表达的遗传信息
所以又称－－调控序列
二、 RNA也可作为遗传物质
* RNA病毒
传染媒介是病毒颗粒（病毒基因组RNA、蛋白质外壳）
如: 烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus ，TMV)
* 类病毒（viroid）: 使高等植物产生疾病的传染性因子
只由RNA组成, 无蛋白质外壳保护, 游离的共价闭合环
状单链RNA分子
三、 是否存在核酸以外的遗传物质
Prion (proteinaccous infections
particle) 朊病毒－－－蛋白质样的感染
因子
羊搔痒病 (scripie)
人类库鲁（ kuru） 病
牛海绵状脑炎(疯牛病)…
均由传染性病原蛋白颗粒引起
统称Prion (朊病毒)
Prion 复制? 转录? 翻译?
人类朊病毒疾病、症状及发病机理
疾病
症状
发病机理
发现病例
库 鲁 病
（Kuru）
共济失调、继发痴
呆
痴呆，共济失调
通过同类相食（人）
传染
约2600例
通过朊病毒污染的HGH，
或通过角膜移植
约80例
家族性克
雅氏病
同上
PrP基因种系突变
约100个家族
零星发生克
雅氏病
同上
每年发生率约百万
分之一
克雅氏病新
突变体vCJD
GS 综 合 症
（GSS）
共济失调，常伴有
痴呆
体 细 胞 突 变 PrPc 自 发
转变为PrPsc？
牛朊病毒传染？
PrP基因种系突变
约50个家族
PrP 基 因 种 系 突 变
（D178N和M129）
9个家族
医源性克雅
氏病(iCJD）
共济失调，常伴有
痴呆
致死性家族
睡眠隔离，接着失
失眠症（FFI） 眠，痴呆
46例
致死性中枢神经
系统的慢性退化
病理表现：大
脑皮层的神经
原细胞退化、
空泡变性、死
亡、消失，最
终被星状细胞
取代，因而造
成海棉状态
朊病毒带来了诺贝尔生理/医学奖
1997
Stanley B.Prusiner
发现朊病毒是作
为老年性痴呆症
等疾病的病原并
能在寄主细胞中
繁殖传播
第二节 核酸的化学组成
一、 碱基、核苷、核苷酸
☉ 碱基
Nitrogenous bases
嘧啶
Pyrimidines
嘌呤
Purines
Uracil (U)
☉ 核苷（nucleotide）
嘧啶的1位N原子、嘌呤的9位N原子
糖苷键
Glycosidic bond
核糖是戊糖
RNA－核糖核苷
DNA－脱氧核糖核苷
☉ 核苷酸（nucleotide acid）
9
核苷的磷酸酯
苷酸
脱氧核糖核
核糖核苷酸
1’
其中α和β、β和γ之间是高
能磷酸键
γ
β
α
dNTP
核糖核苷三磷酸缩写为NTP
碱基＋戊糖＝核苷
核苷＋磷酸＝核苷酸
二、DNA分子的一级结构
(DNA sequence)
1、 多聚核苷酸链
主链是核糖和磷酸
侧链为碱基
由3’,5’磷酸二酯键连接
2、 链的方向：同一个磷酸
基的3’酯键到5’酯键的方向
(5’→3’)
5’-UCAGGCUA-3’
= UCAGGCUA
默认书写顺序5‘→3’
3’
5’
第二节 DNA的二级结构
一、 DNA双螺旋模型的提出（double helix model）
* 1953.
Watson & Crick
右手 B- DNA Double helix Model
*
双螺旋的主链
•
每一单链具有
5‘
3’极性
两条单链极性
相反,反向平行
• 两条单链间以氢
键连接
• 以中心为轴，向
右 盘 旋 （直径2nm）
•
双
存 在
螺 旋 中
大，小 沟
磷酸二酯链
(Phosphodiester
Backbone)
碱基互补
C-G
T-A
*
双螺旋模型参数
· 直径20Å
· 螺距为34Å（任一条链
绕轴一周所升降的距离）
· 每圈有10个核苷酸
·
（碱基）
两个碱基之间的垂直
距离是3.4Å。螺旋转
角是36度
· 有大沟和小沟
配对碱基并不充满双
螺旋空间，且碱基对
占据的空间不对称
二、 影响双螺旋结构稳定性的因素
*
l
维持稳定性的因素
氢键 (Hydrogen bond 4~6 kc / mol)
弱键, 可加热解链
氢键堆积, 有序排列(线性, 方向)
磷酸酯键 (phosphoester bond 80~90 kc /
mol)
强键, 需酶促解链
l
l
0.2 mol / L Na+ 生理盐条件
消除DNA单链上磷酸基团间的静电斥力
l 碱基堆积力 (非特异性结合力)
☆ 范德华力（Van de waals force）
(1.7A°/ 嘌呤环与嘧啶环 作用半径)
3.4A°
(0.34 nm/碱基对间距)
( 1 kc / mol —0.6kc / mol )
×n
☆ 疏水作用力 (Hydrophobic interaction)
(磷酸骨架, 氨基, 酮基周围水分子间的有序排列 )
不溶于水的非极性分子在水中相互联合, 成串结合的趋势力.
*
不稳定因素
l 磷酸基团间的静电斥力
l 碱基内能增加(温度), 使氢键因碱基排列有序状态的破坏
而减弱
三、双螺旋结构的基本形式
· B-DNA
资料来自相对湿度为92％所得到的DNA钠盐纤维
· 此外人们还发现了A、C、D、E等右手双螺旋和左手双螺旋
Z构象等形式
DNA结构的多态性：几种不同的DNA双螺旋结构以及同
一种双螺旋结构内参数存在差异的现象
原因：多核苷酸链的骨架含有许多可转动的单键
磷酸二酯键的两个P-O键、糖苷键、戊糖环各个键
A
B
Base Inclination Handedness
Z
A
B
Z
四、一些DNA序列的不寻常结构
1、反向重复序列与二级结构
反 向 重 复 序 列 （ inverted
repeatitive
sequence
or
inverted
repeats
IR）
又称回文序列（廻文）：指两段同样的核苷酸序列同时存
在于一个分子中,有时也有不完全相同的情况
RNA和DNA中都可能存在
此外还可有directed
正向重复序列
repeatitive
sequence ---
C
反向重复序列间间隔较短或无间隔
反向重复序列间间隔较长
*
较短的回文序列可能是作为一种信号
如：限制性内切酶的识别位点
一些调控蛋白的识别位点
例如限制性内切酶 EcoRⅠ的识别位点
5‘－－GAATTC－－3’
3‘－－CTTAAG－－5’
2、三螺旋DNA (Trible Helix DNA, T.S DNA)
（1）
形成条件
一股为嘌呤，另一股为嘧啶的核苷酸双链能够形成三链
如： polyA/polyU
polydA/polydT
polyd (AG)/polyd(CT)
可能与基因调控区域的功能和染色体重组有关
（2）
组成形式
D.S. DNA + D.S.DNA
T.S. DNA + S.S. DNA
PolyT/A TTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTT
AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
PolyT/A TTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTT
AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
l第三条链位于B-DNA的
Major groove中
3、 四股螺旋DNA ( tetraplex DNA, Tetrable Helix DNA )
形成条件－－串联重复的鸟苷酸
• Poly (G)
• 染色体端粒高度重复的 DNA序列
5’---TTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’
均有形成
四股螺旋DNA
的可能
3’---AATCCCAATCCC-5’
 已有实验结果表明－－真核细胞端粒中存在四链结构
可能的功能
A、 稳定真核生物染色体结构
5’-----TTAGGGTTAGGGTTAGGGT T
A
3’-----AATCCCAATCCC
GGG
Hoogsteen Bonding
B、 保证DNA末端准确复制
C、 与DNA分子的组装有关
D、 与染色体的 meiosis & mitosis 有关
第四节 DNA的物理、化学性质
DNA双股链的互补
是其结构和功能上的一个基本特征
也是DNA研究中一些实验技术的基础
一、DNA分子的变性
变性（denaturation
或融解 melting）：DNA双螺旋区的
氢键断裂，使双螺旋的两条链完全分开变成单链，这
一双链分离的过程叫做变性
1、条件：加热, 极端pH,有机溶剂（ 尿素、 酰胺 )，低盐浓度等
2、变性过程的表现
¤ 是一个爆发式的协同过程，变性作用发生在一个很
窄的温度范围
¤
导致一些理化性质发生剧烈变化
表现为：
※
熔液黏度降低
※
沉降速度加大
※
浮力密度上升
※
此外吸收值升高（A260nm），即增色效应
指在DNA变性的过程中，他在260nm的吸收值先是缓慢
上升，达到某一温度时及骤然上升
天然DNA和变性DNA的吸收值相差可达34％
当浓度为 50μg/ml时：
dNTPs
A260 = 1.60
S.S DNA
A260 = 1.37
D.S DNA
A260 = 1.0
3、熔解曲线与融解温度(Tm值)
缓慢而均匀地增加DNA
溶液的温度（现可做到
0.1 ℃／分）可根据各
点的A260值绘制成DNA
的熔解曲线
OD
1.37
1.185
1.0
Tm = OD增加值的中点温度(一般为8595℃)
或DNA双螺旋结构失去一半时的温度
这也是一般PCR实验技术中把变性温度定为94 ℃的原因
℃
1、
影响 Tm值的因素
（1） 在 A, T, C, G 随机分布的情况下 ，决定于GC含量
GC%愈高
→ Tm值愈大
GC%愈低
→ Tm 值愈小
（2）GC%含量相同的情况下
AT形成变性核心，变性加快，Tm 值小
碱基排列对Tm值具有明显影响
5` GC 3`
CG n
136.12 ℃
5` TA 3`
AT n
36.7 ℃
＞＞
Tm
＜＜
5` CG 3`
GC n
72.55 ℃
5` AT 3`
TA n
57.02 ℃
※
嘌呤嘧啶的排列顺序对双螺旋结构（稳定性）的影响
即－－氢键数目相同，但相邻碱基的堆积力不同
从嘌呤到嘧啶方向的碱基堆积力作用显
著地大于同样组成的嘧啶到嘌呤方向的碱基堆积作用
Pyrimidine-Purine Steps Have Little Base Stacking
3’
5’ C
T
A
G
5’ CA 3’
3’ GT 5’
5’
3’
Purine-Pyrimidine Steps Have Extensive Base Stacking
3’
5’
A
C
3’
G
T
5’
5’ AC 3’
3’ TG 5’
 生物体内仅UAA为最有效的终止密码子
因 为 ： UAA
AUU
的Tm值是最低的一个，即使
生
理温度下也不稳定
（3） 大片段D.S DNA分子之间比较
片段长短对Tm值的影响较小, 与组成和排列相关
（4） 小于100bp 的 D.S DNA分子比较
片段愈短， 变性愈快，Tm值愈小
（5） 变性液中含有尿素，甲酰胺等
尿素，甲酰胺与碱基间形成氢键
改变碱基对间的氢键
Tm 值可降至40℃左右
（6）
盐浓度的影响
每升0.18mol Na+是常用的标准条件
思考题：室温下蒸馏水中的DNA会如何？
（7）
极端pH条件的影响
pH ~ 12
酮基 →
烯醇基
改变氢键的形成与结合力
pH ~ 2-3
NH2 →
NH2+ (质子化)
一切减弱氢键， 碱基堆积力的因素
均将使Tm 值降低
2、
常用的变性方法
☆ 热变性
应用广泛，特别是用于变性动力学研究
缺点：高温引起磷酸二酯键的断裂，得到长短不一的单链
☆ 碱变性
pH11.3时，全部氢键被淘汰
无热变性的缺点，为制备单链DNA的首选方法
◎ 保存单链DNA的条件
保持pH大于11.3
盐浓度低于0.01mol/L
二、DNA分子的复性 （anneal or renaturation）
概念：变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的链又可以
重新地合成双螺旋结构的过程（退火）
Denaturation ▲
D.S DNA
S.S DNA
▼ Renaturation
复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞
( Depends on the collision of complementary S.S. DNA )
1、 影响DNA复性过程的因素 ：
 阳离子浓度
0.18 ~ 0.2M Na+ 可消除polydNTP 间的静电斥力
 复性反应的温度
低于Tm值 25℃左右 (60-65℃)
 S.S, DNA 的初始浓度 C0
 S.S. DNA分子的长度（片段的大小）
S.S. DNA愈长 → 分子扩散愈慢 → 复性愈慢
S.S. DNA愈短 → 分子扩散愈快 → 复性愈快
 DNA 分子中, 碱基的排列状况 (随机排列, 重复排列)
3’-ATCTATGCTGTCAT-5’
3’-ATCTATGCTGTCAT-5’
5‘-TAGATACGACAGTA-3’
5‘-TAGATACGACAGTA-3’
3’-ATATATATATAT-5’
3’-ATATATATATAT-5’
5‘-TATATATATATA-3’
3’-ATATATATATAT-5’
5‘-TATATATATATA-3’
5‘-TATATATATATA-3’
3’-ATATATATATAT-5’
5‘-TATATATATATA-3’
二、C0t曲线－－复性发生过程的讨论
 单链DNA的随机碰撞 过程（ randomly collision ）
包括两个因素：DNA的浓度（C，mol/L）和时间(s)
反应初始 t = 0
dCt / dt = KC0
2
单链 DNA浓度 = C0
反应达 t 时
单链DNA浓度 = Ct
K＝复性速度常数
dCt / dt = KC02 积分
Ct / C0 = 1 / (1+KC0t )
当
Ct / C0 = 1/2 时
Ct / C0 = 1/2 = 1 / (1+ KC0t(1/2))
K = 1 / Cot(1/2)
Cot(1/2) = 1/K (mol. Sec / L)
常数
Ct/C0是C0t的函数
按此公式作图得C0t曲线
1
Ct/C0
0
C0t(1/2)
C0t
基因组的复杂性(genomic complexity)
基因组的复杂性＝单一序列的长度＋重复序列的长度
复杂性的单位为核苷酸的数目
例如：含单一序列a, b, c, d
复杂性＝a+b+c+d
复杂性＝分子量
含106a, 103b, 10c, d
复杂性＝a+b+c+d
复杂性＜＜分子量
复杂性
1
:10－6
2×105 :0.4
2×109 :4000
* C0t和DNA的复杂性间存在线性关系：
the more complex a DNA, the higher its Cot(1/2)
真核生物的基因组由
高度重复（highly repetitive)序列、
中度重复（moderately repetitive or mid-repetitive) 序列
单一（single copy)序列组成
A "typical" mammalian
C0t curve has three
plateaus
* C0t曲线能解释单一来源的DNA所具有的不同复杂性部分
四、富含A－T序列和DNA双螺旋结构的呼吸作用
● 高等生物染色体的某一区段，A·T含量变化很大
很多有重要调节功能的的DNA区段都富含A·T
（原核、真核－－ 复制起点、 启动子、终止子等区域）
●
DNA 双 螺 旋 结 构 的 呼 吸 作 用 ： DNA 双 螺 旋 结 构 内 部 ，
配对碱基的氢键的迅速断裂和再生的过程
●
DNA内富含A·T区段呼吸作用尤为明显
这对于某些特殊的蛋白质与DNA发生反应并阅读
链内部的信息具有重要作用
第五节 超螺旋和拓扑异构
一、超螺旋（superhelix OR supercoil）
● 最早在SV40和多瘤病毒
中发现
● 超螺旋是所有线性或环
形DNA的共有的重要特征
The supercoils of
the SV40
minichromosome
can be relaxed to
generate a circular
structure, whose
loss of histones then
generates supercoils
1、 超螺旋结构的方向性
B-DNA
紧缠overwinding (右旋)
导致左手超螺旋
以一根绳子做实验：
原来的绳子的两股以
右旋方向缠绕；在绳
子的一端向紧缠方向
捻转，再将绳子的两
端连接起来，则产生
一个左旋的超螺旋以
解除外加捻转的协变
正超螺旋（positive supercoiled ）
B-DNA
松缠unwinding (左旋)
导致右手超螺旋
在绳子的一端向松缠
方向捻转，再将绳子
的两端连接起来，则
产生一个右旋的超螺
旋以解除外加捻转的
协变
负超螺旋（Negative Supercoiled ）
超螺旋的形成总是要向着抵消
初级螺旋改变的方向发展
所有生物的DNA几乎 有5%为
Negative Superhelix
二、超螺旋状态的描述
1、可用数学公式描述
L = T + W (α = β + γ)
Vinograd 方程式
L
连接数（Linking number ）
双链DNA的交叉数， 不发生链断裂时，L为定值
T
盘绕数（Twisting number ）
双链DNA的缠绕数，初级螺旋圈数
W
超盘绕数（Writhing number）
直观上为双螺旋在空间的转动数
W= 负值（negative superhelix）
W = 正值 ( positive superhelix）
* B-DNA是
力学上稳定
的结构
( 10 bp/ helix)
* 螺旋数改
变的结果之
一是产生超
螺旋
或是在
B_DNA中保
留一单链区
域，但须能量的功给
420bp
B-DNA的变化情况：
＊ DNA在水溶液中, 构型偏B型状态
＊ DNA以10.5 bp/helix为最稳定构型
＊ 小于10.5bp/helix 向正超螺旋发展(紧缩态)
＊ 大于10.5bp/helix 向负超螺旋发展(松弛态)
天然的DNA都是负超螺旋
但一些生命活动过程中存在正超螺旋
2、体外可产生正超螺旋
溴化乙锭（Ethidium bromide
EB）
放线菌素D
a、EB的插入只改变盘绕数T－－使其降低
但L值不变
W＝L－T
base
L值不变
T值降低
base
3.4埃
EB
7.0埃
base
W＝正值
产生正超螺旋
base
局部DNA
的紧缩
base
base
EB对超螺旋结构的影响
负 Superhelix
L不变,T减少
正 Superhelix
360o/helix
360o-26o/helix / 0ne of EB inserted
三、拓扑异构酶
l 拓扑异构体：只在连接数上有差别的同种DNA分子称为
这种DNA的拓扑异构体
l 拓扑异构酶（topoisomerase ）：催化DNA由一种拓扑异
构体转变成另一种拓扑异构体的酶类
拓扑异构酶的类别和特性
Ⅰ型
性质
真核生物
原核生物
1
1
2
2
对ATP的需求
否
否
是
是
依赖于DNA的ATP酶
否
否
是
是
产生负超螺旋
否
否
是
否
松弛负超螺旋
是
是
否
是
松弛正超螺旋
否
是
是
是
被切割的DNA链
原核生物
Ⅱ型
真核生物
1、拓扑异构酶Ⅰ
(topoisomerase I)
改变超螺旋的方式
切断一
条链形
成酶和
DNA的
复合体
结合到
一条链
上形成
复合物
L=2
共价连接 Tyrosine-5’P
一条链
穿越
结果：连接数增加一个
增加一个负超
重新
连接
L=3
2、拓扑异构酶Ⅱ
－Top II
旋转酶(gyrase)
TopⅡ 亚 类 之
一
引入负超螺旋
作用于双链
涉及双链的
断裂和连接
－－每次使
DNA的连接数
改变2
3、拓扑异构酶的生物学功能
a、恢复由一些细胞过程产生的超螺旋
如：复制叉前面正超的消除
转录酶前正超的消除，后面负超的产生
b、防止细胞DNA的过度超螺旋
多种拓扑异构酶的作用严格控制体内负超螺旋
维持在5%水平
所以－－
一种拓扑异构酶的单向突变对细胞来说是致命的
因而一般两种拓扑异构酶的突变水平相当
复习题
1、名词解释
反向重复序列
DNA链的呼吸作用
Cot曲线
DNA的熔解温度 DNA复性
2、简答题
＊ DNA是否唯一的遗传物质？
＊ 如何确定DNA一级结构的方向性？
＊ 决定DNA双螺旋结构状态的因素如何？
＊ B-DNA中出现的大沟、小沟有何差别？
＊ DNA结构多态性及其产生的原因。
＊ 室温中蒸馏水中的DNA变化如何？为什么？
＊ Ⅰ、Ⅱ型拓扑异构酶的作用方式和结果的情况
DNA变性