Transcript 第三章遗传物质的分子基础

第三章 遗传的分子基础
普通遗传学
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本章主要内容
 一. DNA是主要的遗传物质
 二. DNA的分子组成与结构
 三. DNA分子的变性
 四. DNA分子的复性
 五. DNA与染色质
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第一节 DNA是主要的遗传物质
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Why is DNA the
genetic material?
(一)细菌的转化：
1928， Griffith，F．
肺炎双球菌感染家鼠试验
(Pneumococcus)
无致病力
转化源
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有致病力
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•1944 Avery O.T. (Canada)
Bachelor
Diplococcum pneumonice
DNA as genetic material
1944年，Avery等从S 菌中提取的DNA与R菌混合后，
R → S，且转化率与DNA纯度呈正相关，若将DNA预先
用DNA酶降解，转化就不发生。
 结论是: S型菌的DNA将其遗传特性传给了R型菌，
DNA是遗传物质。
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(二)噬菌体的侵染与繁殖
 1952，赫尔希 (Hershey, A. D.) 等用32P和35S分别标记 T2
噬菌体的DNA与蛋白质，感染大肠杆菌。
32P
DNA
35
S
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• DNA is a main genetic material
▲ 1928 Griffith
RII
▲ 1944
DNA
SIII
Avery O.T
▲ 1952 Hershey
lambdar phage cycle
• RNA is genetic material also
Tobacco Mosaic Virus (TMV)
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 DNA作为遗传物质的优点 (自然选择的优势)
★ 储存遗传信息量大
1kb DNA序列
★A/T, C/G 互补
41000 种遗传信息
双螺旋结构
复制,转录
遗传稳定
★ 核糖的2’ – OH 脱
氧
★
可以突变
方便修复
在水溶液中的稳定性高于RNA
以求不断进化
以求稳定遗传
 具有自我复制的能力
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第二节 DNA的分子组成与结构
DNA (deoxyribonucleic acid)
Nucleotide (Nt) ——basic unit
Nucleoside (Ns)
Base
Purin (pu)
(py)
(A)
(G)
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Mono-phosphate
(Mp)
Deoxy-ribose ( Ribose )
Pyrimidine
(T)/ (U)
(C)
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L
DNA 与RNA的区别
l Ribose
l Base ：
A、G、C、T/U
l D.S. & S.S. ：
DNA多为双链
l
Numbers & length： DNA链较长
l
Stability ：
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DNA ＞ RNA
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一、DNA分子基本单位——核苷酸
碱基
磷酸
脱氧
核糖
Nucleotide (Nt)
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戊 糖
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碱基
嘌呤（Pu）: A、G
嘧啶（Py）: C、T
Pyrimidines
Purines
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 核苷的构象 ( conformation of nucleoside )
purin
χ = C4-N9-C1’-O4’
0o
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pyimidine
χ = C2-N1-C1’-O4’
0o
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二、DNA的一级结构
 核酸链的简写式
5 ’ pＡＣＴＴＧＡＡＣＧ3’
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三、DNA的二级结构
1、DNA 双螺旋结构模型 (DNA Double Helix Model)
1950. Chargaff
A+G/T+C=1
A+ G = T + C
Rich AT form & rich GC form
1952.
Alexander Todd
3’, 5’ phosphodiester bond
Nt~~Nt ~~Nt~~Nt~~Nt
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phosphodiester bond
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1952. King’s Lab. UK
M. H. F. Wilkins
&
Rosalind
Frankin
X~ray photograph of DNA
with high quality
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DNA的双螺旋结构 （1953～2003）
J.D.Watson F.H.C.Crick
 核酸的分子结构及其在遗传信息传递中的作用
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2、DNA双螺旋的结构特点
1.主链：两条长链反向平行
螺旋而成螺旋直径为2nm
2. 碱基对
3. 螺距：为3.4 nm
4. 大沟、小沟
Right handed B-form DNA Double helix Model
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单链核苷酸链间按A、T、C、G 配对
以氢键方式连接成双链分子
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•
每一单链具有
5‘
•
两条单链间以氢键连接
•
两条单链，极性相反，
反向平行
•
以中心为轴，向右盘旋
(B-form)
•
Right handed B-form DNA
Double helix Model
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3’极性
双
螺 旋 中 存 在
大 沟
小 沟
(2. 2nm)
(1. 2nm)
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小
沟
大
沟
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DNA双螺旋中的大沟与小沟
l 碱基顶部基团裸露在DNA 大沟内
l 蛋白质因子与DNA 的特异结合依赖于
氨基酸与DNA 间的氢键的形成
l 蛋白质因子沿大沟与DNA形成专一性
结合的机率与多样性高于沿小沟的结合
l 大沟的空间更有利于与蛋白质的结合
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3. 影响双螺旋结构稳定性的因素
碱基堆积的棒状实体
l 氢键 (Hydrogen bond 4~6 kc / mol)
弱键, 可加热解链
氢键堆积, 有序排列(线性, 方向)
l 磷酸酯键 (phosphoester bond 80~90 kc /
mol)
强键, 需酶促解链
l 0.2 mol / L Na+ 生理盐条件
消除DNA单链上磷酸基团间的静电斥力
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l 碱基堆积力 (非特异性结合力)
☆ 磷酸骨架, 氨基, 酮基周围水分子间的有序排列
☆ Van de waals force (1.7A°/ 嘌呤环与嘧啶环作用半径)
3.4A°
(0.34 nm/碱基对间距)
☆ 疏水作用力 (Hydrophobic interaction)
不溶于水的非极性分子在水中相互联合, 成
串结合的趋势力即为熵 Entrophy (ΔS)
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l 磷酸基团间的静电斥力
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DNA二级结构的多态性
Z-DNA
Z-DNA
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B-DNA
A-DNA
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B-DNA
右手双股螺旋，细胞内
最稳定、最常见的构象
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A-DNA
右手双股螺旋，存在于脱水
DNA，DNA-RNA杂交分子
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Z-DNA
左手双股螺旋
与基因的表达调控有关
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三链螺旋结构
 B-DNA的大沟处，一条DNA链
与DNA双螺旋结构中的一条链结
合而成；
B-DNA与其自身的一条链结
合形成分子内三链DNA；
B-DNA中与第三链相结合的
这条链必需含有一段连续的嘌呤
核苷酸序列，为核心链。
稳定性较差
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四链DNA
 G－四联体（G-quarter）
为基本单位，即四个鸟嘌呤
在一个正方形平面内以氢键
环形连接而成。
位于染色体末端，可能起
着稳定染色体，参与端粒DNA
的复制等功能。
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DNA的超螺旋结构
某种因素的影响下，正常B-DNA分子双螺旋额外少转或
多转几圈，使每圈的碱基对数目大于或小于10，DNA分子
双螺旋空间改变，分子内产生额外张力。
DNA分子产生扭曲，缓解张力，造成超螺旋结构（supercoil）
负向超螺旋、正向超螺旋
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DNA的超螺旋结构(supercoiling)
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 超螺旋结构的生物学意义
反映DNA结构的多样性，介导DNA结构的 变化，
为其功能发挥提供条件；
DNA复制、重组，以及基因的表达调控；
使DNA形成高度紧密的状态，得以容纳在有效空间。
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第三节 DNA分子变性
( DNA denaturation )
●
DNA变性： 天然的有规则的双链DNA分子，在被加热
或某些试剂的作用下，氢键和碱基间堆积力受到破坏，
逐步变为单链线型状态的过程，又称熔解。
●
S.S. DNA
D.S. DNA
( 加温, 极端pH, 尿素, 酰胺 )
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DNA热变性过程
电子显微镜下的DNA分
子的部分变性
☆变性过程的表现： S.S. DNA粘度降低
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D.S DNA
S.S DNA 粘度降低 ？
溶液粘度取决于分子流动过程中的内摩擦和阻力
高分子溶液
线状分子
>
>
普通溶液
不规则线团
>
球形分子
D.S. DNA 钢性较强，结构较为舒展的 Double helix
S.S. DNA 没有氢键的支撑
由螺旋结构向折叠和线团结构转变
D.S DNA
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S.S DNA 粘度降低
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变性过程的表现
☆ S.S.DNA 沉降速度加快
☆ S.S.DNA分子的A 260 nm UV 值上升
☆增色效应 ( Hyperchromicity ) ：
指由DNA变性而引起的光吸收值的增加。
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• 熔解温度（Tm）：50％的DNA双螺旋结构被破坏
的温度，一般在85－95℃。
●
影响 Tm值的因素
1、 DNA分子的碱基组成
GC%愈高 → Tm值愈大 ，
GC%愈低
→ Tm 值愈小
☆ GC%含量相同的情况下
AT形成变性核心，变性加快，Tm 值小
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2、DNA分子的长度
☆ 大片段D.S. DNA分子之间比较
片段长短对Tm值的影响较小, 与组成和排列相关
☆ 小于100bp 的 D.S DNA分子比较
片段愈短， 变性愈快，Tm值愈小
3、 变性液中含有尿素，酰胺等
尿素，酰胺与碱基间形成氢键
改变碱基对间的氢键
Tm 值 可降至40℃左右
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4、DNA溶液的离子强度（盐浓度的影响）
单链DNA主链的磷酸基团
负电荷的静电斥力
两条单链DNA的分离
Na+在磷酸基团周围形成的电子云
对静电斥力产生屏蔽作用
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减弱静电斥力
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5、pH 值（极端pH条件的影响）
pH ~ 12
酮基 →
烯醇基
改变氢键的形成与结合力
pH ~ 2-3
NH2 →
NH2+ (质子化)
一切减弱氢键、碱基堆积力的因素
均将使Tm 值降低
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第四节 DNA分子的复性 (anneal or renaturation)
 DNA复性： 变性的单链DNA在一定的条件下又恢复
为原天然双链DNA的过程，也叫退火。
Denaturation ▲
D.S DNA
▼ Renaturation
S.S DNA
复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞
( Depends on the collision of complementary S.S. DNA )
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 影响DNA复性过程的因素 ：
1、 阳离子浓度（盐浓度）
0.18 ~ 0.2M Na+ 可消除polydNt 间的静电斥力
2、复性反应的温度 Tm -25℃ ( 60- 65℃)
以消除S.S. DNA 分子内的部分二级结构（氢键）
3、 S.S. DNA分子的长度
S.S. DNA愈长 → 分子扩散愈慢 → 复性愈慢
S.S. DNA愈短 → 分子扩散愈快 → 复性愈快
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 影响DNA复性过程的因素 ：
4、S.S, DNA 的初始浓度 C0
5、DNA 分子中, dNt 的排列状况
(随机排列, 重复排列)
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3’-ATCTATGCTGTCAT-5’
3’-ATCTATGCTGTCAT-5’
5‘-TAGATACGACAGTA-3’
5‘-TAGATACGACAGTA-3’
3’-ATATATATATAT-5’
3’-ATATATATATAT-5’
5‘-TATATATATATA-3’
3’-ATATATATATAT-5’
5‘-TATATATATATA-3’
5‘-TATATATATATA-3’
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3’-ATATATATATAT-5’
5‘-TATATATATATA-3’
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 复性的过程
单链DNA彼此不断随机碰撞，具互补关系的部位进行
碱基配对，产生短的双螺旋区；
双螺旋区沿着两条单链配对延伸形成双链DNA分子；
DNA复性服从化学动力学的二级反应
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六、DNA的分子杂交（hybridization）
 DNA的分子杂交：
不同来源的DNA变性后，混合一起，含有碱基互补
配对的序列，在一定条件下退火形成杂合双链结构的过程。
 杂交方法：Southern 杂交、Northern 杂交、dot bloting
 作用： 基因鉴定
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鉴别
识别亲缘关系远近
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Southern 杂交（
Southern （1975）建立）
将DNA固定在滤膜上，用标记好的同位素DNA探针
与之杂交，通过放射自显影显示与探针互补的区带，识别
特异序列。
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 Northern 分子杂交
与Southern 分子杂交相对应；
将RNA固定在滤膜上 ，用DNA探针与之杂交。
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
斑点杂交（dot bloting）
将DNA样品变性后直接点滴到滤膜上， 烘烤固定，
再与标记好的探针进行杂交。
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DNA芯片、DNA微阵列
DNA chip， DNA microarray
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DNA chip
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第五节 DNA与染色质
Histone
octamer
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DNA
压缩7倍
核小体
压缩6倍
螺线管
压缩40倍
超螺线管
压缩5倍
染色单体
共计压缩8400倍
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DNA
压缩7倍
核小体
压缩6倍
螺线管
histone
chromatin
压缩40倍
超螺线管
压缩5倍
染色单体
DNA double helix
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共计压缩8400倍
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Summary
 DNA是主要的遗传物质
 DNA的基本组成成分
 DNA的一级和二级结构
 DNA在体内稳定存在的因素
 DNA的变性和复性，核酸分子杂交
 DNA双螺旋分子到染色质的组装
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