Transcript 初代培养
初代培养 • 从理论上讲，植物细胞都具有全能性，能够再生新植株， 因此植物体的各个器官、组织、细胞及原生质体都可以作 为外植体。但在实际组织培养过程中，需要对外植体进行 选择，因为不同来源的外植体，在离体条件下对灭菌剂的 敏感性不同；生长潜力不一样；细胞恢复分裂（即脱分化） 的能力或愈伤组织再次分化（即再分化）的能力也有差异。 如果选择不好，就很难获得培养的成功。因此，在进行植 物组织培养时，必须选择合适的外植体，以确保组织培养 工作的顺利进行。 （一）外植体的选取原则 什么是外植体（Explant）？ 外植体（Explant） 是指初次用于培养的植物材料。 包括植物体的各个器官、组织、 细胞和原生质体等。 外植体的选择有什么要求? 外植体的来源 外植体的大小 选材 生理学上的年龄 取材的季节 1．外植体的大小 0.5-1cm， 过大的外植体容易污染， 过小存活率很低。 2．外植体的来源（选取部位） •不同种类的植物以及同一植物的不同器官对诱导条件反应是不 一致的，有的部位诱导分化的成功率高，有的部位却很难脱分 化，或者再分化频率很低。 •在选择植物外植体进行组织培养时，还要求考虑待培养材料的 来源是否有保证，是否容易成苗；同时要考虑到该外植体，特 别是经过脱分化产生的愈伤组织，是否会引起不良变异，丧失 原品种的优良性状。 对于大多数植物来讲，茎尖是最好的部位，由于其形态已 基本建成，生长速度快，遗传性稳定，也是获得无病毒苗 的重要途径，但茎尖往往受到材料来源的限制，而采用茎 段可解决培养材料不足的困难。 常用的外植体种类： ①茎尖（园艺植物组织培养中应用最多，繁殖率高，不易发 生遗传变异，但取材有限） ②茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易） ③叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株， 取材容易，操作方便，但易发生变异）； ④花球和花蕾 ⑤种子、根、块根、块茎、花瓣、胚等。 3．生理学上的年龄 • 作为外植体的器官，其生理状态和发育 年龄直接影响形态发生。一般情况下， 幼年组织比老年组织具有较高的形态发 生能力，生理年龄越老的组织或器官， 越接近发育上的成熟，其再生能力逐渐 减弱甚至完全失去再生能力。 4．取材的季节：取材的季节以早春为好 • 不同植物的取材季节要求各有不同。对大多数 植物而言，应在其生长开始的季节采样 。 • 在生长末期或已进入休眠期时取样，则外植体 可能对诱导反应迟钝或无反应，较难成活。 • 在母株生长旺盛的季节取材，不仅成活率高， 而且增殖率也大。 外植体取材方法--确定大小 取大小适中的茎段、芽体进行清洗、灭菌，大了容易污染，小了不易成活。 (二) 外植体的处理过程及注意事项 1．采样 2．洗涤 3．表面灭菌 4．分割（外植体切割） 5．接种 1．采样 • 在采样前除应预先制备好用于接种的培养 基外，还应携带刀、剪、广口瓶、塑料袋、 采集箱（袋）等， • 到田间或盆栽植物中选取洁净、无病虫伤 害的健壮植株。剪取比较幼嫩，生长能力 较强的部位，但又不能太嫩， 这样的茎段或叶片有下述优点： 污染程度较老龄部位轻，又比较耐表面灭菌 剂的处理，接种后生长能力强，反应较明显。 如果室外栽培的材料污染太严重，多次接种都难获 得无菌的材料，那就要采取比较严格的预防措施： • 先将植物样本掘出，剪除一些不必要的枝条，改为室内盆 栽，喷布杀虫剂和杀菌剂，经常施肥，加强管理。 • 不方便移栽的，可套塑料袋，避免灰尘和昆虫污染，等它 们长出新枝条后，再行采样接种，可以大大增加无菌材料 的得率。 • 另外，在久晴之后采样也可比在阴雨天后采样效果好，距 地面较高部位，特别是暴露在强烈阳光下的枝条，采样的 污染较轻。 • 采得的样品妥为收藏，尽量使其保持新鲜，迅速带回实验 室，尽快作表面灭菌处理。 外植体取材方法--修剪 外植体取来后，需要根据品种、特性进行修剪，取一定大小的芽体、茎段进行灭菌。 外植体取材方法——花粉 做花粉培养时，应取没有开开的花骨朵，从中去用花粉。 外植体取材方法——冬季取材 冬季取来的枝条，清洗后放在温暖潮湿的环境下催芽，如果有 培养箱，效果更好。 外植体取材方法——成年大树 对于从成年大树上取外植体，不能去外围的枝叶，要取内堂枝 外植体取材方法——幼树 在幼树上采集外植体，以健壮的钉梢枝或侧枝为宜。 外植体取材方法——草本植物 对于草本植物而言，取外植体时要选取幼嫩、健壮的部分 外植体取材方法——草花 以生长健壮、生长势旺的枝体为宜 外植体取材方法--储运 外植体采集下来以后，如果需要运送距离较远，则需要冷藏保湿 运输 2．洗涤 第一步 刷洗、冲洗 • 采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细弄干 净， 如用适当的刷子、画笔等刷洗，硬的材料可用刀刮。 • 把材料切割到适当大小，视清洁程度而异，置自来水龙头 下，流水冲洗几分钟至数小时， 易漂浮或细小的材料可用尼龙丝网袋、塑料纱窗或铜丝网 笼扎住，置烧杯中冲洗。 第二步是用洗涤剂溶液浸泡并搅动， • 洗衣粉可按每100ml水加1-2角匙的量配制，即浓度较高 为好。 • 大约浸泡5-10分钟，然后倒掉洗涤剂溶液，流水下冲洗 30-60分钟. 外植体取材方法--清洗 剪切好一定大小的外植体，在灭菌前要充分浸泡、冲洗，尽量降低 均量。 3．表面灭菌 • 表面灭菌，要在超净工作台或接种箱内操作。工 作人员换上洁净的工作服，戴上帽子，防止头发 散落尘屑。用肥皂洗手至肘部，用洁净毛巾擦干， 戴或不戴乳胶手套，用70％酒精棉球擦手。 • 坐到超净工作台前（已开机20分钟以上），附近 应放有座钟或表，将一干净烧杯（大小视材料多 少而定）或广口瓶内、外表面用70％或75％酒精 棉球擦拭作表面灭菌，放一经同样灭菌处理的玻 璃棒，再把处理好的植物材料置入，同时已准备 好了消毒溶液、无菌水、待用培养基等。 • 把沥干水的植物材料转放到消毒过的烧杯或广口 瓶中，看好时间，倒入消毒溶液，加消毒助剂吐 温-80（Tween-80）数滴，在持续消毒的时间内不 时用玻璃棒轻轻搅动或盖上广口瓶盖轻轻摇动， 以促进植物材料各部分与消毒溶液充分接触，驱 除气泡，使消毒彻底。 需要注意的是灭菌时间是从倒入消毒液开始，至 倒入无菌水时为止。 • 在快到预定时间之前1-2分钟，即开始把消毒溶液 倒入另一准备好的大烧杯中，要注意勿使材料倒 出。 • 倾净后立即倒入无菌水，轻搅涮洗。涮洗2-3分钟 左右，视采用的消毒溶液种类不同，涮洗的次数 变动在5-8次之间。 • 其中，幼嫩茎尖、花蕾5分钟；老枝条7-8 分钟，如花楸50日龄实生苗幼茎0.1%的升 汞溶液浸泡10~15min，无菌水冲洗8次。涮 洗完毕，植物材料的表面灭菌就做完了， 这时的材料就可以接种了。 为什么要用无菌水涮呢？ 这是因为各种消毒剂不但能杀灭微生物，也 能杀伤植物细胞，所以消毒的时间要考虑选定， 消毒后又要尽量将消毒剂对植物的影响压缩到最 低限度。 植物材料的表面灭菌剂种类较多，在不同的情况下 选用其中一至二种进行外植体表面灭菌即可。 表6-2 常用表面灭菌剂使用浓度及效果比较表 消毒剂 使用含量/﹪ 去除消毒剂难易 NaClO 2* 易 5-30 很好 3 Ca(ClO)2 5-10 易 5-30 很好 3 漂白粉 饱和溶液 易 5-30 很好 3 HgCl2（升汞） 0.1-1 较难 2-10 最好 6-8 酒精 70-75 易 0.2-2 好 1 H2O2 （双氧水） 10-12 最易 5-15 好 3 Br2 1-2 易 2-10 很好 3 硝酸银 1 较难 5-30 好 3 抗生素 4-50mg/L 中 30-60 较好 2-3 消毒时间/min 灭菌效果 冲洗次数 注：上述灭菌剂都应于使用前临时配制，氯化汞可短时间内贮用；*注意 商品溶液的标称浓度，经计算后配制成有效成分2﹪。 吐温-80（表面活性剂） • 主要作用：使药剂更易于展布，更容易浸润到要 灭菌的材料表面，因此加用吐温后灭菌剂活力大 为提高，但对材料的伤害也在增加，应仔细斟酌 吐温的用量和灭菌的时间。 • 通常每100ml灭菌溶液加1-15滴不等 • 多加吐温灭菌效果好，时间要缩短些。 • 灭菌溶液要充分浸没材料，宁可多用些灭菌溶液， 切勿勉强在一个体积偏小的容器里灭菌很多材料。 否则，污染会大幅度增加。 表面灭菌注意事项 1、表面消毒剂对植物组织是有害的，应正确选择消毒剂的浓度 和处理时间，以减少组织的死亡。 2、在表面消毒后，必须用无菌水漂洗材料3次以上以除去残留杀 菌剂，但若用酒精消毒，则不必漂洗。 3、与消毒剂接触过的切面在转移到无菌基质前需将其切除，因 为消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质的吸收。 4、若外植体污染严重则应先用流水漂洗1小时以上或先种子培养 得到无菌种苗，然后用其各个部分建立组织培养。 5、HgCl2效果最好，但对人的危害最大，用后要用水冲洗至少5 次。 4．分割（外植体切割） 表面灭菌后用小滤纸片吸干材料上的水分，放在大 滤纸或培养皿上切割。 • 通常情况下，叶片切割0.5-1cm2，太大得率低； 过小植物组织发生得慢； • 茎段多为1-2cm，保证每个茎段至少有一个芽； • 茎 尖 用于 快 繁多 为 0.1-1cm ，用于 脱 毒多 小于 0.1cm；鳞片1cm2左右； • 花蕾、花托1/4—1/2（视大小而定）。 放置时要平放，正面朝上，切口与培养基接触（往 下压一压）；或直插（注意极性），芽眼留在培 养基上（为了呼吸更好）。 5．接种 • 把分割好的植物材料放入准备好的培养基中，叶 片、茎段、茎尖、花蕾、花托每瓶接种一块。 （三）试管苗的初代培养 • 外植体消毒灭菌后，接种到培养基上，首先要得 到无菌材料，然后逐渐促其分化和生长，这是试 管苗的第一代，称为初代培养。以后通过不断转 接试管苗，使试管苗很快扩大数量，这种不断培 养转苗的过程称为继代培养。 1．无菌材料的获得 外植体接种后通常2-3天内如果被污染即 可被表现出来。 一般有几种污染情况： ①细菌污染 ②真菌污染 ③培养基灭菌不彻底而引起的污染 ①细菌污染 • 病症：在插入培养基中的材料周围形成细菌膜， 并逐渐产生黏液或浑浊的水迹，在培养基与材料 接触处产生气泡，时间长了有的出现乳白色或橙 黄色的菌落，形状呈圆形并很快扩大。 • 产生原因:是在某个环节消毒灭菌布彻底， 如:无菌水消毒布彻底，或操作中某种工具带菌， 违反操作规程、说话、咳嗽等都能引起杂菌感染。 • 因此，接外植体，进行无菌操作前工作人员一定 要注意自身卫生，最好戴帽子和口罩操作。 ②真菌污染 • 病症：首先在有真菌孢子存在的地方产生白色的 菌丝，经常可以在外植体和培养基表面看到。特 别是夏季阴雨天，空气湿度大，周围环境不清洁， 含孢子量较多，甚至棉花塞上也落上了孢子。 • 产生原因：没有定时和及时对实验室、接 种室、培养室进行消毒，对污染瓶、培养 基等污染物的杀菌处理不够彻底，都可以 增加真菌污染。 • 这种污染发展很快，通过无性繁殖使菌丝进一步 形成黑色、蓝色、红色孢子，孢子很小，很轻， 可以进入空间及物体的每个角落，一旦遇到合适 的条件就繁衍开来，开始时往往肉眼看不见，一 旦发现应在各方面都进行认真检查，以便彻底进 行消毒灭菌。 ③培养基灭菌不彻底而引起的污染 • 病症：这种污染使大量的培养基都产生细 菌污染，在尚未接种材料的培养基表面或 中间产生气泡和细菌菌落，很容易和接种 材料等其他污染途径相区别。 • 产生原因：此种情况一发生，就要检查高压灭菌 锅各个主要部件如压力表、放气管等是否有问题， 以及在操作过程中如放气、控温等是否规范，如 果冷空气排不净，高压灭菌锅内的压力、温度都 会受影响，使培养基消毒不彻底而引起培养基污 染。 • 在外植体接种后几天内不发生污染，不能肯定已 获得无菌材料，因为外植体及培养环境内所残留 的微生物中，有的细菌及真菌生长很缓慢，需要 一定的条件和时间才表现出污染现象，一定要注 意观察，及时清除污染材料。一般20多天后没有 污染，材料已起动，开始有新芽或新叶生长，这 才算基本上获得成功。 污染的预防措施 组织培养中降低污染率是工厂化生产 中不可忽视的技术环节 1、防止材料带菌 2、防止用具带菌 3、操作室要处于无菌状态 4、操作人员要按照操作程序进行 有时外植体虽没有污染，但也不起动，这可 能有几种情况： • 一种可能是消毒时间过长或消毒剂浓度过高，把 外植体已经杀死，这种情况下外植体往往逐渐萎 缩、褐化。 • 另一种是由于所取外植体部位和季节不合适，例 如有些休眠芽不起动。还有一种情况是培养基不 合适，尤其是营养成分过高，糖浓度高，渗透压 高时会引起外植体营养成分外渗，造成材料萎缩、 枯黄而死亡，轻则影响材料的生长。 • 另外，初代培养时容易产生褐变，也影响外植体 生长。必须根据具体情况，具体分析予以解决。 2．初代培养的培养基 • 要选择最合适的培养基，一方面进行文献调查， 参考前人的经验；另一方面要根据个人长期实验 观察结果来设计。渗透压应比一般的稍高一些 。 • 初代培养基中激素浓度不需要太高，有时为了加 速芽的启动，可以加入少量赤霉素（2-5mg/l）。 • 初步培养的目的主要是获得无菌材料，然后根据 材料特性转入分化培养基中。 （四）外植体的成苗途径 1.短枝发生型 2.丛生芽发生型 3.不定芽发生型 4.胚状体发生型 5.原球茎发生型 1、短枝发生型 类似于微型扦插，指外植体携带的带叶茎段，在适宜的培养 环境中萌发，形成完整植株，再将其剪成带叶茎段，继代再 成苗的繁殖方法。能一次成苗，遗传稳定，成活率高，但繁 殖系数低。 藤本月季外植体 图示茎段培养过程 去叶片用自来水冲洗 健康植株上选健壮的枝梢 0.1%升汞 MS培养基 再生 培养 75%酒精1分钟 1%次氯酸钠 2、丛生芽发生型 是大多数植物快繁的主要方式。指外植体携带的顶芽 或腋芽在适宜培养环境（含有外源细胞分裂素）中不 断发生腋芽而呈丛生状芽，将单个芽转入生根培养基 中，诱导生根成苗的繁殖方法。 不经过愈伤阶段，后代变异小，应用普遍，也可用于 无病毒苗的生产。 丛生芽：指由顶芽或侧芽在适宜的培养基和培养条件下，诱导腋芽原基不断萌发而 形成的丛生状芽 3、不定芽发生型 指外植体在适宜培养基和培养条件下，形成不定芽，后经 生根培养，获得完整植株的繁殖方法。分为通过愈伤组织 产生不定芽，和直接产生不定芽两种方式。 外植体涉及多种器官，如茎段、叶、根、花器官等。是植 物快繁的另一种主要方式，繁殖系数高。但变异率较高， 尤其是通过愈伤途径产生的植株。 不定芽：植物组织培养中，外植体在适宜的培养基和培养条件下,经过细胞脱分化形 成愈伤组织,然后经愈伤组织再分化产生的芽,或外植体细胞经脱分化恢复分生状态后 即刻经再分化而直接从外植体表面形成的芽。 A B E 花烛叶片离体培养及植株再生 C 大花红景天组织培养 A 刚接种的叶片外肢体； B.8周后基部开始形成愈伤组织； C.16周后叶片外植体分化出芽； D.28周后叶片外植体芽的增殖；E.转入生根培养基2周后生根情况；F.生根培养6周后可移栽的植株。 4、胚状体发生型 指外植体在适宜培养环境中，经诱导产生体细胞产生体 细胞胚，从而形成小植株的繁殖方法。分为间接途径 （经愈伤途径）和直接途径两种。 成苗数量大、速度快、结构完整。但由于对其发生及发 育过程了解不够，应用上还没有前两种广泛。 胚状体：是由体细胞形成的，类似于生殖细胞形成合子胚发育过程的胚胎发生途径。 胚状体与合子胚的比较 合子胚 胚状体 质量 萌发率高，质量好 萌发率低，质量差 来源 受精卵 体细胞 胚柄 形态 有，明显 即使有也不明显 固定，体积相对较小 复杂，常有两个以 上的子叶体积相对 较大 低 高 变异率 菊花花瓣体细胞胚胎发生及体胚发育过程的扫描电镜观察 5、原球茎发生型 • 是兰科植物特有的一种快繁方式。指茎尖或腋芽外植体经 培养产生原球茎的繁殖类型。原球茎可以增殖形成原球茎 丛。 大花蕙兰原球茎增殖与植株再生 原球茎：兰科植物组织培养中形成的一种特殊的中间繁殖体，是呈珠粒状、由胚 性细胞组成、基部生假根、类似嫩茎的器官。圆球茎可以增殖形成原球茎丛。 （五）首次接种污染率的计算与对策 • 首次接种，小容器。多数量，尽量分散， 互相隔离，效果最好。初次接种时以每管 放一块材料，采用大量小试管将材料分散， 是最有效的。