初代培养

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初代培养
• 从理论上讲,植物细胞都具有全能性,能够再生新植株,
因此植物体的各个器官、组织、细胞及原生质体都可以作
为外植体。但在实际组织培养过程中,需要对外植体进行
选择,因为不同来源的外植体,在离体条件下对灭菌剂的
敏感性不同;生长潜力不一样;细胞恢复分裂(即脱分化)
的能力或愈伤组织再次分化(即再分化)的能力也有差异。
如果选择不好,就很难获得培养的成功。因此,在进行植
物组织培养时,必须选择合适的外植体,以确保组织培养
工作的顺利进行。
(一)外植体的选取原则
什么是外植体(Explant)?
外植体(Explant)
 是指初次用于培养的植物材料。
包括植物体的各个器官、组织、
细胞和原生质体等。
外植体的选择有什么要求?
外植体的来源
外植体的大小
选材
生理学上的年龄
取材的季节
1.外植体的大小
0.5-1cm,
过大的外植体容易污染,
过小存活率很低。
2.外植体的来源(选取部位)
•不同种类的植物以及同一植物的不同器官对诱导条件反应是不
一致的,有的部位诱导分化的成功率高,有的部位却很难脱分
化,或者再分化频率很低。
•在选择植物外植体进行组织培养时,还要求考虑待培养材料的
来源是否有保证,是否容易成苗;同时要考虑到该外植体,特
别是经过脱分化产生的愈伤组织,是否会引起不良变异,丧失
原品种的优良性状。
对于大多数植物来讲,茎尖是最好的部位,由于其形态已
基本建成,生长速度快,遗传性稳定,也是获得无病毒苗
的重要途径,但茎尖往往受到材料来源的限制,而采用茎
段可解决培养材料不足的困难。
常用的外植体种类:
①茎尖(园艺植物组织培养中应用最多,繁殖率高,不易发
生遗传变异,但取材有限)
②茎段(采用嫩茎的切段促进腋芽萌发,取材容易)
③叶(幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株,
取材容易,操作方便,但易发生变异);
④花球和花蕾
⑤种子、根、块根、块茎、花瓣、胚等。
3.生理学上的年龄
• 作为外植体的器官,其生理状态和发育
年龄直接影响形态发生。一般情况下,
幼年组织比老年组织具有较高的形态发
生能力,生理年龄越老的组织或器官,
越接近发育上的成熟,其再生能力逐渐
减弱甚至完全失去再生能力。
4.取材的季节:取材的季节以早春为好
• 不同植物的取材季节要求各有不同。对大多数
植物而言,应在其生长开始的季节采样 。
• 在生长末期或已进入休眠期时取样,则外植体
可能对诱导反应迟钝或无反应,较难成活。
• 在母株生长旺盛的季节取材,不仅成活率高,
而且增殖率也大。
外植体取材方法--确定大小
取大小适中的茎段、芽体进行清洗、灭菌,大了容易污染,小了不易成活。
(二) 外植体的处理过程及注意事项
1.采样
2.洗涤
3.表面灭菌
4.分割(外植体切割)
5.接种
1.采样
• 在采样前除应预先制备好用于接种的培养
基外,还应携带刀、剪、广口瓶、塑料袋、
采集箱(袋)等,
• 到田间或盆栽植物中选取洁净、无病虫伤
害的健壮植株。剪取比较幼嫩,生长能力
较强的部位,但又不能太嫩,
这样的茎段或叶片有下述优点:
污染程度较老龄部位轻,又比较耐表面灭菌
剂的处理,接种后生长能力强,反应较明显。
如果室外栽培的材料污染太严重,多次接种都难获
得无菌的材料,那就要采取比较严格的预防措施:
• 先将植物样本掘出,剪除一些不必要的枝条,改为室内盆
栽,喷布杀虫剂和杀菌剂,经常施肥,加强管理。
• 不方便移栽的,可套塑料袋,避免灰尘和昆虫污染,等它
们长出新枝条后,再行采样接种,可以大大增加无菌材料
的得率。
• 另外,在久晴之后采样也可比在阴雨天后采样效果好,距
地面较高部位,特别是暴露在强烈阳光下的枝条,采样的
污染较轻。
• 采得的样品妥为收藏,尽量使其保持新鲜,迅速带回实验
室,尽快作表面灭菌处理。
外植体取材方法--修剪
外植体取来后,需要根据品种、特性进行修剪,取一定大小的芽体、茎段进行灭菌。
外植体取材方法——花粉
做花粉培养时,应取没有开开的花骨朵,从中去用花粉。
外植体取材方法——冬季取材
冬季取来的枝条,清洗后放在温暖潮湿的环境下催芽,如果有
培养箱,效果更好。
外植体取材方法——成年大树
对于从成年大树上取外植体,不能去外围的枝叶,要取内堂枝
外植体取材方法——幼树
在幼树上采集外植体,以健壮的钉梢枝或侧枝为宜。
外植体取材方法——草本植物
对于草本植物而言,取外植体时要选取幼嫩、健壮的部分
外植体取材方法——草花
以生长健壮、生长势旺的枝体为宜
外植体取材方法--储运
外植体采集下来以后,如果需要运送距离较远,则需要冷藏保湿
运输
2.洗涤
第一步 刷洗、冲洗
• 采来的植物材料除去不用的部分,将需要的部分仔细弄干
净,
如用适当的刷子、画笔等刷洗,硬的材料可用刀刮。
• 把材料切割到适当大小,视清洁程度而异,置自来水龙头
下,流水冲洗几分钟至数小时,
易漂浮或细小的材料可用尼龙丝网袋、塑料纱窗或铜丝网
笼扎住,置烧杯中冲洗。
第二步是用洗涤剂溶液浸泡并搅动,
• 洗衣粉可按每100ml水加1-2角匙的量配制,即浓度较高
为好。
• 大约浸泡5-10分钟,然后倒掉洗涤剂溶液,流水下冲洗
30-60分钟.
外植体取材方法--清洗
剪切好一定大小的外植体,在灭菌前要充分浸泡、冲洗,尽量降低
均量。
3.表面灭菌
• 表面灭菌,要在超净工作台或接种箱内操作。工
作人员换上洁净的工作服,戴上帽子,防止头发
散落尘屑。用肥皂洗手至肘部,用洁净毛巾擦干,
戴或不戴乳胶手套,用70%酒精棉球擦手。
• 坐到超净工作台前(已开机20分钟以上),附近
应放有座钟或表,将一干净烧杯(大小视材料多
少而定)或广口瓶内、外表面用70%或75%酒精
棉球擦拭作表面灭菌,放一经同样灭菌处理的玻
璃棒,再把处理好的植物材料置入,同时已准备
好了消毒溶液、无菌水、待用培养基等。
• 把沥干水的植物材料转放到消毒过的烧杯或广口
瓶中,看好时间,倒入消毒溶液,加消毒助剂吐
温-80(Tween-80)数滴,在持续消毒的时间内不
时用玻璃棒轻轻搅动或盖上广口瓶盖轻轻摇动,
以促进植物材料各部分与消毒溶液充分接触,驱
除气泡,使消毒彻底。
需要注意的是灭菌时间是从倒入消毒液开始,至
倒入无菌水时为止。
• 在快到预定时间之前1-2分钟,即开始把消毒溶液
倒入另一准备好的大烧杯中,要注意勿使材料倒
出。
• 倾净后立即倒入无菌水,轻搅涮洗。涮洗2-3分钟
左右,视采用的消毒溶液种类不同,涮洗的次数
变动在5-8次之间。
• 其中,幼嫩茎尖、花蕾5分钟;老枝条7-8
分钟,如花楸50日龄实生苗幼茎0.1%的升
汞溶液浸泡10~15min,无菌水冲洗8次。涮
洗完毕,植物材料的表面灭菌就做完了,
这时的材料就可以接种了。
为什么要用无菌水涮呢?
这是因为各种消毒剂不但能杀灭微生物,也
能杀伤植物细胞,所以消毒的时间要考虑选定,
消毒后又要尽量将消毒剂对植物的影响压缩到最
低限度。
植物材料的表面灭菌剂种类较多,在不同的情况下
选用其中一至二种进行外植体表面灭菌即可。
表6-2 常用表面灭菌剂使用浓度及效果比较表
消毒剂
使用含量/﹪
去除消毒剂难易
NaClO
2*
易
5-30
很好
3
Ca(ClO)2
5-10
易
5-30
很好
3
漂白粉
饱和溶液
易
5-30
很好
3
HgCl2(升汞)
0.1-1
较难
2-10
最好
6-8
酒精
70-75
易
0.2-2
好
1
H2O2 (双氧水)
10-12
最易
5-15
好
3
Br2
1-2
易
2-10
很好
3
硝酸银
1
较难
5-30
好
3
抗生素
4-50mg/L
中
30-60
较好
2-3
消毒时间/min 灭菌效果 冲洗次数
注:上述灭菌剂都应于使用前临时配制,氯化汞可短时间内贮用;*注意
商品溶液的标称浓度,经计算后配制成有效成分2﹪。
吐温-80(表面活性剂)
• 主要作用:使药剂更易于展布,更容易浸润到要
灭菌的材料表面,因此加用吐温后灭菌剂活力大
为提高,但对材料的伤害也在增加,应仔细斟酌
吐温的用量和灭菌的时间。
• 通常每100ml灭菌溶液加1-15滴不等
• 多加吐温灭菌效果好,时间要缩短些。
• 灭菌溶液要充分浸没材料,宁可多用些灭菌溶液,
切勿勉强在一个体积偏小的容器里灭菌很多材料。
否则,污染会大幅度增加。
表面灭菌注意事项
1、表面消毒剂对植物组织是有害的,应正确选择消毒剂的浓度
和处理时间,以减少组织的死亡。
2、在表面消毒后,必须用无菌水漂洗材料3次以上以除去残留杀
菌剂,但若用酒精消毒,则不必漂洗。
3、与消毒剂接触过的切面在转移到无菌基质前需将其切除,因
为消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质的吸收。
4、若外植体污染严重则应先用流水漂洗1小时以上或先种子培养
得到无菌种苗,然后用其各个部分建立组织培养。
5、HgCl2效果最好,但对人的危害最大,用后要用水冲洗至少5
次。
4.分割(外植体切割)
表面灭菌后用小滤纸片吸干材料上的水分,放在大
滤纸或培养皿上切割。
• 通常情况下,叶片切割0.5-1cm2,太大得率低;
过小植物组织发生得慢;
• 茎段多为1-2cm,保证每个茎段至少有一个芽;
• 茎 尖 用于 快 繁多 为 0.1-1cm ,用于 脱 毒多 小于
0.1cm;鳞片1cm2左右;
• 花蕾、花托1/4—1/2(视大小而定)。
放置时要平放,正面朝上,切口与培养基接触(往
下压一压);或直插(注意极性),芽眼留在培
养基上(为了呼吸更好)。
5.接种
• 把分割好的植物材料放入准备好的培养基中,叶
片、茎段、茎尖、花蕾、花托每瓶接种一块。
(三)试管苗的初代培养
• 外植体消毒灭菌后,接种到培养基上,首先要得
到无菌材料,然后逐渐促其分化和生长,这是试
管苗的第一代,称为初代培养。以后通过不断转
接试管苗,使试管苗很快扩大数量,这种不断培
养转苗的过程称为继代培养。
1.无菌材料的获得
外植体接种后通常2-3天内如果被污染即
可被表现出来。
一般有几种污染情况:
①细菌污染
②真菌污染
③培养基灭菌不彻底而引起的污染
①细菌污染
• 病症:在插入培养基中的材料周围形成细菌膜,
并逐渐产生黏液或浑浊的水迹,在培养基与材料
接触处产生气泡,时间长了有的出现乳白色或橙
黄色的菌落,形状呈圆形并很快扩大。
• 产生原因:是在某个环节消毒灭菌布彻底,
如:无菌水消毒布彻底,或操作中某种工具带菌,
违反操作规程、说话、咳嗽等都能引起杂菌感染。
• 因此,接外植体,进行无菌操作前工作人员一定
要注意自身卫生,最好戴帽子和口罩操作。
②真菌污染
• 病症:首先在有真菌孢子存在的地方产生白色的
菌丝,经常可以在外植体和培养基表面看到。特
别是夏季阴雨天,空气湿度大,周围环境不清洁,
含孢子量较多,甚至棉花塞上也落上了孢子。
• 产生原因:没有定时和及时对实验室、接
种室、培养室进行消毒,对污染瓶、培养
基等污染物的杀菌处理不够彻底,都可以
增加真菌污染。
• 这种污染发展很快,通过无性繁殖使菌丝进一步
形成黑色、蓝色、红色孢子,孢子很小,很轻,
可以进入空间及物体的每个角落,一旦遇到合适
的条件就繁衍开来,开始时往往肉眼看不见,一
旦发现应在各方面都进行认真检查,以便彻底进
行消毒灭菌。
③培养基灭菌不彻底而引起的污染
• 病症:这种污染使大量的培养基都产生细
菌污染,在尚未接种材料的培养基表面或
中间产生气泡和细菌菌落,很容易和接种
材料等其他污染途径相区别。
• 产生原因:此种情况一发生,就要检查高压灭菌
锅各个主要部件如压力表、放气管等是否有问题,
以及在操作过程中如放气、控温等是否规范,如
果冷空气排不净,高压灭菌锅内的压力、温度都
会受影响,使培养基消毒不彻底而引起培养基污
染。
• 在外植体接种后几天内不发生污染,不能肯定已
获得无菌材料,因为外植体及培养环境内所残留
的微生物中,有的细菌及真菌生长很缓慢,需要
一定的条件和时间才表现出污染现象,一定要注
意观察,及时清除污染材料。一般20多天后没有
污染,材料已起动,开始有新芽或新叶生长,这
才算基本上获得成功。
污染的预防措施
组织培养中降低污染率是工厂化生产
中不可忽视的技术环节
1、防止材料带菌
2、防止用具带菌
3、操作室要处于无菌状态
4、操作人员要按照操作程序进行
有时外植体虽没有污染,但也不起动,这可
能有几种情况:
• 一种可能是消毒时间过长或消毒剂浓度过高,把
外植体已经杀死,这种情况下外植体往往逐渐萎
缩、褐化。
• 另一种是由于所取外植体部位和季节不合适,例
如有些休眠芽不起动。还有一种情况是培养基不
合适,尤其是营养成分过高,糖浓度高,渗透压
高时会引起外植体营养成分外渗,造成材料萎缩、
枯黄而死亡,轻则影响材料的生长。
• 另外,初代培养时容易产生褐变,也影响外植体
生长。必须根据具体情况,具体分析予以解决。
2.初代培养的培养基
• 要选择最合适的培养基,一方面进行文献调查,
参考前人的经验;另一方面要根据个人长期实验
观察结果来设计。渗透压应比一般的稍高一些 。
• 初代培养基中激素浓度不需要太高,有时为了加
速芽的启动,可以加入少量赤霉素(2-5mg/l)。
• 初步培养的目的主要是获得无菌材料,然后根据
材料特性转入分化培养基中。
(四)外植体的成苗途径
1.短枝发生型
2.丛生芽发生型
3.不定芽发生型
4.胚状体发生型
5.原球茎发生型
1、短枝发生型
 类似于微型扦插,指外植体携带的带叶茎段,在适宜的培养
环境中萌发,形成完整植株,再将其剪成带叶茎段,继代再
成苗的繁殖方法。能一次成苗,遗传稳定,成活率高,但繁
殖系数低。
藤本月季外植体
图示茎段培养过程
去叶片用自来水冲洗
健康植株上选健壮的枝梢
0.1%升汞
MS培养基
再生
培养
75%酒精1分钟
1%次氯酸钠
2、丛生芽发生型
 是大多数植物快繁的主要方式。指外植体携带的顶芽
或腋芽在适宜培养环境(含有外源细胞分裂素)中不
断发生腋芽而呈丛生状芽,将单个芽转入生根培养基
中,诱导生根成苗的繁殖方法。
 不经过愈伤阶段,后代变异小,应用普遍,也可用于
无病毒苗的生产。
丛生芽:指由顶芽或侧芽在适宜的培养基和培养条件下,诱导腋芽原基不断萌发而
形成的丛生状芽
3、不定芽发生型
 指外植体在适宜培养基和培养条件下,形成不定芽,后经
生根培养,获得完整植株的繁殖方法。分为通过愈伤组织
产生不定芽,和直接产生不定芽两种方式。
 外植体涉及多种器官,如茎段、叶、根、花器官等。是植
物快繁的另一种主要方式,繁殖系数高。但变异率较高,
尤其是通过愈伤途径产生的植株。
不定芽:植物组织培养中,外植体在适宜的培养基和培养条件下,经过细胞脱分化形
成愈伤组织,然后经愈伤组织再分化产生的芽,或外植体细胞经脱分化恢复分生状态后
即刻经再分化而直接从外植体表面形成的芽。
A
B
E
花烛叶片离体培养及植株再生
C
大花红景天组织培养
A 刚接种的叶片外肢体;
B.8周后基部开始形成愈伤组织;
C.16周后叶片外植体分化出芽;
D.28周后叶片外植体芽的增殖;E.转入生根培养基2周后生根情况;F.生根培养6周后可移栽的植株。
4、胚状体发生型
 指外植体在适宜培养环境中,经诱导产生体细胞产生体
细胞胚,从而形成小植株的繁殖方法。分为间接途径
(经愈伤途径)和直接途径两种。
 成苗数量大、速度快、结构完整。但由于对其发生及发
育过程了解不够,应用上还没有前两种广泛。
胚状体:是由体细胞形成的,类似于生殖细胞形成合子胚发育过程的胚胎发生途径。
胚状体与合子胚的比较
合子胚
胚状体
质量
萌发率高,质量好
萌发率低,质量差
来源
受精卵
体细胞
胚柄
形态
有,明显
即使有也不明显
固定,体积相对较小 复杂,常有两个以
上的子叶体积相对
较大
低
高
变异率
菊花花瓣体细胞胚胎发生及体胚发育过程的扫描电镜观察
5、原球茎发生型
• 是兰科植物特有的一种快繁方式。指茎尖或腋芽外植体经
培养产生原球茎的繁殖类型。原球茎可以增殖形成原球茎
丛。
大花蕙兰原球茎增殖与植株再生
原球茎:兰科植物组织培养中形成的一种特殊的中间繁殖体,是呈珠粒状、由胚
性细胞组成、基部生假根、类似嫩茎的器官。圆球茎可以增殖形成原球茎丛。
(五)首次接种污染率的计算与对策
• 首次接种,小容器。多数量,尽量分散,
互相隔离,效果最好。初次接种时以每管
放一块材料,采用大量小试管将材料分散,
是最有效的。