Transcript 第二章核酸化学
第二章 核酸化学 主要内容：介绍核酸的分类和化学组成， 重点讨论DNA和RNA的结构特征，初步认识核酸 的结构特征与其功能的相关性；介绍核酸的主 要理化性质和核酸研究的一般方法。 思考 核酸的结构与功能 第一节 核酸通论 第二节 核酸基本构件单位—核苷酸 第三节 DNA的分子结构 第四节 RNA的分子结构 第五节 核酸的某些理化性质及核酸研究常用技术 第六节 人类基因组计划简介 第一节 核酸通论 一、 核酸的研究历史和重要性 二、 核酸的种类和分布 三、DNA储存遗传信息的证实 核酸的研究历史和重要性 1869 Miescher从脓细胞的细胞核中分离出了一 种含磷酸的有 机物，当时称为核素（nuclein）,后称为核酸（nucleic acid）； 此后几十年内，弄清了核酸的组成及在细胞中的分布。 1944 Avery 等成功进行肺炎球菌转化试验；1952年Hershey等 的实验表明32P-DNA可进入噬菌体内， 证明DNA是遗传物质。 1953 Watson和Crick建立了DNA结构的双螺旋模型，说明了 基因的结构、信息和功能三者间的关系，推动了分子生物学的 迅猛发展。 1958 Crick提出遗传信息传递的中心法则， 60年代 RNA研究取得大发展（操纵子学说，遗传密码，逆转 录酶）。 核酸的研究历史和重要性（续） 历史 70年代 建立DNA重组技术，改变了分子生物学的面貌，并导 致生物技术的兴起。 80年代 RNA研究出现第二次高潮：ribozyme、反义RNA、 “RNA世界”假说等等。 90年代以后 实施人类基因组计划（HGP）, 开辟了生命科学 新纪元。生命科学进入后基因时代： 功能基因组学（functional genomics） 蛋白质组学（proteomics） 结构基因组学（structural genomics） RNA组学（Rnomics）或核糖核酸组学（ribonomics） 核酸分类和分布 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）:遗传信息的 贮存和携带者，生物的主要遗传物质。在真核细胞中，DNA主 要集中在细胞核内，线粒体和叶绿体中均有各自的DNA。原核 细胞没有明显的细胞核结构，DNA存在于称为类核的结构区。 每个原核细胞只有一个染色体，每个染色体含一个双链环状 DNA。 核糖核酸（ribonucleic acid, RNA）：主要参与遗传信息的 传递和表达过程，细胞内的RNA主要存在于细胞质中，少量存 在于细胞核中，病毒中RNA本身就是遗传信息的储存者。另外 在植物中还发现了一类比病毒还小得多的侵染性致病因子称为 类病毒， 它是不含蛋白质的游离的 RNA分子， 还发现有些 RNA具生物催化作用（ribozyme）。 肺炎球菌转化实验图解 III S型细胞 （有毒） 破碎细胞 II R型细胞 （无毒） DNA + R（粗糙） S（光滑） II R型细胞接受 III S型DNA DNAase降 解后的DNA R 只有II R型 S 少数II R型细胞被转化 产生III S型荚膜 R 大多数仍 为II R型 第二节 核酸的基本结构单位—核苷酸 一、核苷酸的化学组成与命名 1、 碱基、核苷、核苷酸的概念和关系 2、 常见碱基的结构与命名法 3、 常见（脱氧）核苷酸的基本结构与命名 4、 稀有核苷酸 5、细胞内游离核苷酸及其衍生物 二、核苷酸的生物学功能 5´-磷酸核苷酸的基本结构 O O P （N = A、G、C、U、T） O 5´ N 碱基 CH2 O O 磷酸 4´ H H H O 3´ 2´ OH 核糖 1´ H (O)H 碱基、核苷、核苷酸的概念和关系 Pyrimidines C Cytosine Purihes T U Thymine Uracil A G Adenine Guanine 核酸 Phosphate Nitrogenous base 核苷 磷酸 Pentose sugar 戊糖 HOCH2 OH HO Ribose (in RNA) HOCH2 OH H Doxyribose (in DNA) 碱基 基本碱基结构和命名 嘧啶 嘌呤 Adenine (A) Guanine (G) Cytosine Uracil Thymine (C) (U) (T) 核苷酸的结构和命名 OH 腺嘌呤核苷酸（ AMP） H Adenosine monophosphate 脱氧腺嘌呤核苷酸（dAMP） Deoxyadenosine monophosphate 鸟嘌呤核苷酸（GMP） 脱氧鸟嘌呤核苷酸（dGMP） 胞嘧啶核苷酸（CMP） 脱氧胞嘧啶核苷酸（dCMP） 尿嘧啶核苷酸（UMP） 脱氧胸腺嘧啶核苷酸（dTMP） P P 腺嘌呤核苷酸 （AMP） P P 胞嘧啶核苷酸 （CMP） 尿嘧啶核苷酸 （UMP） 鸟嘌呤核苷酸 （GMP） P P P P 脱氧腺嘌呤核苷酸 （dAMP） 脱氧鸟嘌呤核苷酸 （dGMP） 脱氧胸腺嘧啶核苷酸 （dTMP） 脱氧胞嘧啶核苷酸 （dCMP） 常见（脱氧）核苷酸的结构和命名 几种稀有核苷 H3C CH3 H H H 5 H CH3 假尿苷（） 二氢尿嘧啶（DHU） Am m26G 几种稀有核苷酸 H3C 5 CH3 H H H H CH3 假尿苷（） 二氢尿嘧啶（DHU） Am m26G 细胞内游离核苷酸及其衍生物 • 多磷酸核苷酸 • 环核苷酸 • 辅酶类核苷酸。 5´-NMP 5´-NDP 5´-NTP N=A、G、C、U AMP Adenosine monophosphate ADP Adenosine diphosphate ATP Adenosine triphosphate 腺苷酸及其多磷酸化合物 5´-dNMP 5´-dNDP 5´-dNTP N=A、G、C、T O CH2 O H H O H O P A (G) O H OH OH cAMP(cGMP)的结构 Cyclic adenylie (Guanine)acid 二 、核苷酸的生物学功能 作为核酸的单体 细 胞 中 的 携 能 物 质 （ 如 ATP、GTP、 CTP、GTP） 酶的辅助因子的结构成分（如NAD） 细胞通讯的媒介（如cAMP、cGMP） 第二节 DNA的分子结构 一、核酸分子中的共价键 二、 DNA 一级结构 三、DNA碱基组成的Chargaff规则 四、 DNA的二级结构 五、 DNA的三级结构 六、DNA与蛋白质复合物的结构 核酸分子中核苷酸之间 的共价键 5 3 3 -5 磷酸二酯键 5 3 二、DNA 的一级结构 DNA分子中各脱氧核苷酸 之间的连接方式（3´-5´磷酸二 酯键）和排列顺序叫做DNA的 一级结构，简称为碱基序列。一 级结构的走向的规定为5´→3´。 不同的DNA分子具有不同的核 苷酸排列顺序，因此携带有不同 的遗传信息。 一级结构的表示法 结构式，线条式，字母式 5 ´ 3´ DNA一级结构的表示法 A C T G 1´ 3´ 5´ p p 5 ´ p p OH 3´ 线条式 3´ 5´ ACTGCATAGCTCGA 3´ 字母式 结构式 三、DNA碱基组成的Chargaff规则 Chargaff首先注意到DNA碱基组成的某些规律性，在 １９５０年总结出DNA碱基组成的规律： 腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔数相等，即 A=T。 鸟嘌呤和胞腺嘧啶的摩尔数也相等，即G=C。 含氨基的碱基总数等于含酮基碱基总数，即 A+C=G+T。 嘌呤的总数等于嘧啶的总数，即A+G=C+T。 DNA、RNA的一级结构 OH 5´ 5´ 3´ OH 3´ OH RNA一级结构 DNA一级结构 四、DNA的二级结构 （1） DNA的双螺旋结构(Watson-Crick模型) （2） DNA双螺旋结构特征及意义 （3） DNA双螺旋的多态性 （4）DNA的三股螺旋（tripkex） DNA的双螺旋结构的形成 5´ 3´ 5 ´ 3´ 5´ 3 ´ 磷酸 核糖 T-A碱基对 碱基 C-G碱基对 3´ 5´ DNA的双螺旋模型特点 a. 两条反向平行的多聚核苷酸链沿一个假 设的中心轴右旋相互盘绕而形成。 b. 磷酸和脱氧核糖单位作为不变的骨架组 成位于外侧，作为可变成分的碱基位于内侧 ，链间碱基按A—T，G—C配对（碱基配对 原则，Chargaff定律） c. 螺旋直径2nm，相邻碱基平面垂直距离 0.34nm,螺旋结构每隔10个碱基对（base pair, bp）重复一次，间隔为3.4nm DNA的双螺旋结构稳定因素 氢键 碱基堆集力 磷酸基上负电荷被胞内 组蛋白或正离子中和 碱基处于疏水环境中 DNA的双螺旋结构的意义 该模型揭示了DNA作为遗传物质的稳定性 特征，最有价值的是确认了碱基配对原则，这 是是DNA复制、转录和反转录的分子基础，亦 是遗传信息传递和表达的分子基础。该模型的 提出是本世纪生命科学的重大突破之一，它奠 定了生物化学和分子生物学乃至整个生命科学 飞速发展的基石。 DNA双螺旋的不同构象 三种DNA双螺旋构象比较 A B-DNA A-DNA Z 适中 细长 外型 粗短 螺旋方向 螺旋直径 右手 2.55nm 右手 2.37nm 左手 1.84nm 碱基直升 0.23nm 0.34nm 0.38nm 碱基夹角 32.70 34.60 60.00 11 10.4 12 3.32nm 4.56nm 每圈碱基数 Z-DNA B 轴心与碱 基对关系 2.46nm 碱基倾角 190 糖苷键构象 反式 10 反式 90 C、T反式，G顺式 大沟 很窄很深 很宽较深 平坦 小沟 很宽、浅 窄、深 较窄很深 T-A-T 多聚嘌呤 C-G-C 多聚嘧啶 DNA分子间 的三链结构 DNA三链间 的碱基配对 DNA分子内 的三链结构 DNA的三 级结构指双螺 旋DNA分子通 过扭曲和折叠 所形成的特定 构象，包括不 同二级结构单 元间的相互作 用、单链和二 级结构单元间 的相互作用以 及DNA的拓扑 特征。 五、DNA的三级结构 1．超螺旋DNA（supercoiled DNA） (1) 超螺旋DNA的形成 (2) 超螺旋状态的定量描述 (３) DNA超螺旋结构形成的重要意义 2．拓朴异构酶（topoisomerase） (1) 两类拓朴异构酶 (2) 拓朴异构酶作用机理 螺 旋 和 超 螺 旋 电 话 线 螺旋 超螺旋 23 1 20 DNA超螺旋的形成 5 L=25,T=25, W=0 1 5 10 15 20 25 松弛环形 10 15 1 5 10 15 20 23 右手旋转拧松两匝后的线形DNA 超螺旋的拓 扑学公式： L=T+W 23 4 21 13 23 8 16 20 L=23,T=23, W=0 解链环形 或 =+ 1 15 10 5 1 L=23,T=25,W=–2 负超螺旋 23 1 超螺旋状态的定量描述 5 L=25,T=25, W=0 20 松弛环形 10 公式1： L=T+W 15 L——连环数（linking number），DNA双螺旋中一 条链以右手螺旋与另一条链缠绕的次数。 T——DNA分子中的螺旋数（twisting number） W——超螺旋数或缠绕数（writhing number） 公式2： λ=（L-L0）/L0 λ——超螺旋度 （degree of supercoiling） L0——松驰态DNA连环数 4 21 13 23 8 16 1 L=23,T=25,W=–2 负超螺旋 DNA超螺旋结构形成的意义 使DNA形成高度致密状态从而得以装入核中； 推动DNA结构的转化以满足功能上的需要。如负 超螺旋分子所受张力会引起互补链分开导致局部 变性，利于复制和转录。 原核生物两类拓扑异构酶 除连环数（L）不同外其他性质均相同的DNA分子称为拓扑异 构体（topoisomerase）。DNA拓扑异构酶通过改变DNA的L值而 影响其拓扑结构。 拓扑异构酶I通过使DNA的一条链发生断裂和再连接，能使超 螺旋DNA转变成松弛型环状DNA，每催化一次可消除一个负超螺 旋，即使L增加１，反应无需供给能量。 拓扑异构酶II则刚好相反，可使松弛型环状DNA转变成负超螺 旋DNA，每催化一次，L 减少２，可引入负超螺旋。拓扑异构酶 II亦称促旋酶，它可以使DNA的两条链同时断裂和再连接，当它 引入超螺旋时需要ATP提供能量。 细胞内两类拓扑异构酶的含量受严格的控制，使细胞内DNA 保持在一定的超螺旋水平。 连接数 = n+1 连接数 = n 切割 a 穿越断口和 使两端连接 b c 原核拓扑异构酶I的作用机制 d 拓扑异构酶II的作用机制 DNA 双链穿过 DNA 双链断裂 DNA 双链重新连接 重复起始 DNA 的释放 拓扑异构酶 六、DNA与蛋白质复合物的结构 生物体内的核酸通常都与蛋白质结合形成复合物，以 核蛋白（nucleoprotein）的形式存在。 DNA分子十分 巨大，与蛋白质结合后被组装到有限的空间中。 １、病毒 ２、细菌拟核 ３、真核染色体 噬菌体T2结构 头部 颈圈 尾部 基板 尾丝 尖钉 动物病毒切面模式图 被膜（脂蛋白、 碳水化合物） 突起（糖蛋白） 衣壳（蛋白质） 核酸 病毒粒 细菌拟核（nucleoid ）的突环结构 平均一个突环含 有约40kpDNA RNA-蛋白质核心 突环由双链DNA结 合碱性蛋白质组成 组蛋白与DNA的结合 组蛋白与DNA的结合 核小体 DNA的念珠状结构 核小体盘绕及染色质示意图 DNA （2nm） 真核生物染色体DNA 组装不同层次的结构 核小体链（ 11nm，每个核小体200bp） 纤丝（ 30nm，每圈6个核小体） 突环（ 150nm，每个突环大约75000bp） 玫瑰花结（ 300nm ，6个突环） 螺旋圈（ 700nm，每圈30个玫瑰花） 染色体（ 1400nm， 每个染色体含10个玫瑰花200bp） 第四节 RNA的分子结构 一、 RNA一级结构 和类别 二、 tRNA 的分子结构 三、 rRNA的分子结构 四、 mRNA的分子结构 RNA的类别 信使RNA（messenger RNA，mRNA）：在蛋白 质合成中起模板作用； 核糖体RNA（ribosoal RNA，rRNA）：与蛋白 质结合构成核糖体（ribosome）,核糖体是蛋白质合成 的场所； 转移RNA（transfor RNA，tRNA）：在蛋白质 合成时起着携带活化氨基酸的作用。 RNA的一级结构 RNA分子中各核苷之间 的连接方式（3´-5´磷酸二 酯键）和排列顺序叫做 OH RNA的一级结构 5´ RNA与DNA的差异 3´ DNA 糖 碱基 RNA 脱氧核糖 核糖 AGCT AGCU OH 不含稀有碱基 含稀有碱基 OH tRNA 的结构 二级结构特征： 三级结构 特征： 在二级结构基础上 单链 三叶草叶形 进一步折叠扭曲形成倒 四臂四环 L型 3´ A C C 酵母tRNA Ala 的二级结构 Ala 5´ 氨基酸臂 TψC环 可变环 DHU环 反密码环 I GC 反密码子 tRNA的三级结构 rRNA的分子结构 特征：单链，螺旋化程度较tRNA低 与蛋白质组成核糖体后方能发挥其功能 5sRNA的二级结构 mRNA的分子结构 原核生物mRNA特征： 先导区+翻译区（多顺反子）+末端序列 真核生物mRNA特征： “帽子”（m7G-5´ppp5´-N-3´p）+单顺 反子+“尾巴”（Poly A） 原核细胞mRNA的结构特点 顺反子 顺反子 顺反子 5´ 3´ 插入顺序 先导区 插入顺序 末端顺序 真核细胞mRNA的结构特点 AAAAAAA-OH 顺反子 5´ “帽子 ” PolyA 3´ m7G-5´ppp-N-3 ´ p 第五节 核酸的某些理化性质及 核酸研究常用技术 一、 核酸的两性解离性质 二、 核酸的紫外吸收（λmax=260nm） 三、 核酸的变性、复性和分子杂交 四、核酸的熔解温度（Tm） 五、核酸的沉降性质 腺嘌呤核苷酸 pK2 = 3.7 含氮环 pK3 = 6.2 pK1 = 0.9 第二磷酸基 第一磷酸基 核 苷 酸 的 解 离 曲 线 小牛胸线DNA 的滴定曲线 鸟嘌呤核苷酸 离 子 化 程 度 pK2 = 3.7 pK3 = 6.1 含氮环 第二磷酸基 pK1 = 0.7 第一磷酸基 烯醇式羟基 胞嘧啶核苷酸 pK2 = 4.3 含氮环 pK3 = 6.3 pK1 = 0.8 第二磷酸基 第一磷酸基 尿嘧啶核苷酸 pK1 = 1.0 第一磷酸基 pK3 = 6.4 第二磷酸基 烯醇式羟基 pH pH DNA的紫外吸收光谱 3 2 0.4 光 吸 收 1 0.3 0.2 1 天然DNA 2 变性DNA 0.1 3 核苷酸总吸收值 220 240 260 波长（nm） 280 加热 部分双螺旋解开 无规则线团 DNA的变性过程 链内碱基配对 核酸的变性、复性和杂交 变性：在物 理、化学因素影 响 下 ， DNA 碱 基对间的氢键断 裂，双螺旋解开 ，这是一个是跃 变过程，伴有 A260 增 加 （ 增 色 效 应 ） , DNA 的 功能丧失。 复性：在一 定条件下，变性 DNA 单 链 间 碱 基重新配对恢复 双螺旋结构，伴 有 A260 减 小 （ 减 色 效 应 ） , DNA 的功能恢复。 变性（加热） 复性（缓慢冷却） 杂交（缓慢冷却） 探针 限制性酶切割 限制片段 琼脂糖电泳 DNA分子 带有DNA片 段的凝胶 用缓冲液 转移DNA 转移至硝酸纤维素膜上 凝胶 滤膜 与放射性标记 DNA探针杂交 吸附有DNA 片段的膜 放射自显影 Southern 印迹法 不 同 来 源 的 DNA单链间或单 链DNA与RNA之 间只要有碱基配 对的区域，在复 性时可形成局部 双螺旋区，称核 酸分子杂交（ hybridization） 制备特定的探针 （probe）通过杂 交技术可进行基 因的检测和定位 研究。实例： southern印迹法 分子杂交的原理示意图 Tm：熔解温度（melting temperature） DNA的变性发生在 一个很窄的温度范围 内，通常把热变性过 A260 1 1 .4 100% 2 3 程中A260达到最大值一 半时的温度称为该 DNA的熔解温度，用 1 .2 Tm表示。 Tm 的 大 小 与 DNA 分 子 中 （ G+C） 的 百 分含量成正相关 ，测 定Tm值可推算核酸碱 基组成及判断DNA纯 度。 1 .0 60 Tm 80 Tm t \ 0C Tm 100 某些DNA的Tm值 Poly d(A-T) 1 DNA 2 Poly d(G-C) 3 人类基因组计划概况 （Human Genome Project，HGP） 该计划是美国科学家在1985年率先提出，1990年正 式启动。美、英、德、法、日先后参加了此项工作， 1999年我国成为 HGP的第六个成员国。 HGP旨在阐明人类基因组DNA所具有的3×109核苷酸 的序列，发现所有的人类基因并阐明其在染色体上的位 置，破译人类的全部遗传信息，使得人类第一次在分子 水平上全面地认识自我。 到目前为止，已完成了人类基因组的框架图，测序的 工作已基本完成。 HGP的实施，揭开了生命科学新的一 页，它可以造福于人类，但也面临的伦理的挑战。 HGP取得的成就 完成了人类基因组工作草图绘制,揭示了人类基因 组若干细节 基本上测定了人类基因组上的碱基序列 一些模式生物(果蝇、拟南介等)和作物（如水稻） 基因草图绘制成功，测序基本完成 促进了生物信息学、蛋白质组学、糖组学的迅猛 发展 人类基因组草图绘就，中国科学家功不可没 HGP面临的挑战 基因的隐私权问题 基因组图谱和信息的使用与人的社会权利问题 基因资源问题 基因知识的滥用问题 人类将进入生物经济时代 基因——操纵生命的工具 基因组——潜藏着巨大的经济价值 基因技术——21世纪的投资热点 谁掌握了人类基因图谱，就等于谁破译了人类 的生命密码，获得了操纵生命的工具。 与互联网相比，网络只是对人类的信息沟通带 来了巨大的革命，而基因领域的革命则能够从根 本上改变人类的命运，基因工程所带来的商业机 会将会大大超过网络。 转头腔 离 心 机 结 构 示 意 图 转头 沉降样品 驱动马达 真空 冷冻 沉降系数 （sedimentation coefficient） 生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度称为沉降系 数。即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下，从静止状态 到达极限速度所需要的时间。 数学定义式为： s = d2 /dt 沉降系数单位：由于蛋白质、核酸、病毒等的沉降系数介于1×10-13 到200×10-13秒的范围，为方便起见，把作为沉降系数的一个单位，用 Svedberg单位，用即S表示。 沉降系数（s）与相对分子量（Mr）的关系: Svedberg方程: Mr = RTs D(1-) 问答题 1、某DNA样品含腺嘌呤15.1%（按摩尔碱基计），计算其余碱基的百分 含量。 2、DNA双螺旋结构是什么时候，由谁提出来的？试述其结构模型。 3、DNA双螺旋结构有些什么基本特点？这些特点能解释哪些最重要的生 命现象？ 4、tRNA的结构有何特点？有何功能？ 5、DNA和RNA的结构有何异同？ 6、简述核酸研究的进展，在生命科学中有何重大意义？ 6、计算（1）分子量为3105 的双股DNA分子的长度；（2）这种DNA一 分子占有的体积；（3）这种DNA一分子占有的螺旋圈数。（一个互补的 脱氧核苷酸残基对的平均分子量为618） 名词解释 变性和复姓 分子杂交 cAMP Chargaff定律 增色效应和减色效应 回文结构 Tm