Transcript 第九章
Chapter9 遗传的分子基础与基因工程 9.1 DNA作为主要遗传物质的证据 9.2 核酸的化学结构与DNA复制 9.3 遗传信息的表达与调控 9.4 基因的概念与发展 9.5 核酸研究技术简介 9.6 人类基因组计划简介 9.7 遗传工程及其应用 本章要点求 复习思考题 9.1 DNA作为主要遗传物质的证据 一、染色体组成 二、作为遗传物质必须具备的条件 三、DNA是遗传物质的间接证据 四、DNA是遗传物质的直接证据 1.细菌转化试验 2.噬菌体侵染与繁殖试验 3.烟草花叶病毒拆合实验 一、染色体组成 染色体 DNA（1） Pr（1.5~2.5） RNA（0.05） 非组蛋白（1） 组蛋白（0.5~1.5） 二、作为遗传物质必须具备的条件 1.普遍性 2.具有世代延续性 3.具有相对稳定性和可塑性 4.具有多样性 三、DNA是遗传物质的间接证据 1. DNA普遍存在于生物体内。 2.DNA在同一物种不同组织的细胞中含量恒定， 且配子中DNA的含量恰好是体细胞的一半。而蛋白 质则不是。 3.DNA结构的变化与突变具有一致性。凡能引起 DNA结构变化的因素都能引起性状突变，如紫外线 的诱变作用在波长为2600Å附近效果最好，而此处 正是DNA的吸收高峰值。 4.DNA在代谢上较稳定。DNA能自我复制，具有世 代的延续性。 四、DNA是遗传物质的直接证据 1. 细菌转化试验 ①Griffith以肺炎双球菌作为材料的试验（1928） RⅡ型肺炎双球菌——无荚膜，菌落粗糙，无毒 SⅢ型肺炎双球菌——有荚膜，菌落光滑，有毒 RⅡ型活菌 注射 小鼠 注射 小鼠 SⅢ型死菌 注射 小鼠 （高温杀死） 此实验说明，被加热杀死的肺炎 双球菌内必然含有某种促成RⅡ型 菌转化为SⅢ型菌的活性物质 生 死 分离出SⅢ型活菌 生 四、DNA是遗传物质的直接证据 1. 细菌转化试验 ②Avery 的实验 SⅢ型活菌 抽提分离 Pr、DNA、荚膜 SⅢ型细菌有活性的Pr 注射 小鼠 生 RⅡ型活菌 荚膜 注射 小鼠 生 SⅢ型细菌有活性的DNA+DNase 注射 小鼠 生 RⅡ型活菌 SⅢ型细菌有活性的DNA 注射 小鼠 死 此物质不受蛋白酶、多糖酶和核糖核酶 （Rnase）的影响，而只能为DNA酶所破 坏，首次证明了遗传物质是DNA。 Avery的转化实验 四、DNA是遗传物质的直接证据 2.噬菌体侵染与繁殖试验 ①背景知识——噬菌体侵染与繁殖基本过程 T2噬菌体浸染大肠杆菌后，遗传物质进入细菌细胞； 利用大肠杆菌的遗传复制系统复制噬菌体遗传物质； 利用大肠杆菌的遗传信息表达系统合成噬菌体组件； 最后组装形成完整的T2噬菌体。 因此只要弄清侵染时进入细菌的是噬菌体的哪一部 分，就可能证明哪种物质是遗传信息的载体。另外： P是DNA的组成部分，但不存在于蛋白质中； S存在于蛋白质中，但DNA中没有。 ② Hershey和Chase的实验（1952）——又一次证明遗 传物质是DNA。 四、DNA是遗传物质的直接证据 3.烟草花叶病毒 拆合实验 Frankel-Conrat, Singer (1956)进行了 图示试验，该实验 表明在不含DNA的 某些病毒中，RNA 是遗传物质。 9.2 核酸的化学结构与DNA复制 一、两种核酸和它们的分布 二、DNA的化学结构 三、双链DNA的不同构型 四、DNA的变性和复性 五、DNA的复制—半保留半不连续复制 六、DNA的损伤修复 1.光复活 2.切除修复 3.重组修复 4.诱导修复和应急反应（SOS修复） 9.3 遗传信息的表达与调控 一、蛋白质的结构和功能 二、DNA的功能 三、RNA的种类和功能 四、遗传密码及其特点 五、遗传信息的转录与RNA的加工 六、蛋白质的生物合成 七、中心法则及其发展 八、基因表达调控 一、蛋白质的结构和功能 1.蛋白质的一级结构与功能的关系 2.蛋白质的高级结构与功能的关系 3.分子构象病 氨 基 酸 一 级 结 构 二级结构 结构域 三 级 结 构 四 级 结 构 二、DNA的功能 1.自体催化——复制 2.异体催化——转录 3.核酸的研究历史和重要性 核酸的研究历史和重要性 1869 Miescher从脓细胞的细胞核中分离出了一 种含磷 酸的有机物 ，当时称为核素（nuclein）,后称为核酸 （ nucleic acid）；此后几十年内，弄清了核酸的组成及在细 胞中的分布。 1944 Avery 等成功进行肺炎球菌转化试验；1952年 Hershey等的实验表明 32 P-DNA可进入噬菌体内， 证明 DNA是遗传物质。 1953 Watson和Crick建立了DNA结构的双螺旋模型， 说明了基因的结构、信息和功能三者间的关系，推动了分 子生物学的迅猛发展。 1958 Crick提出遗传信息传递的中心法则。 60年代 RNA研究取得大发展（操纵子学说,遗传密码,逆 转录酶）. 核酸的研究历史和重要性 70年代 建立DNA重组技术，改变了分子生物 学的面貌，并导致生物技术的兴起。 80年代 RNA研究出现第二次高潮：ribozyme 、反义RNA、“RNA世界”假说等等。 90年代以后 实施人类基因组计划（HGP）, 开 辟了生命科学新纪元。生命科学进入后基因时代 ： 功能基因组学（functional genomics） 蛋白质组学（proteomics） 结构基因组学（structural genomics） RNA组学（Rnomics）或核糖核酸组学（ ribonomics） 三、RNA的种类和功能 1.tRNA 2.rRNA 3.mRNA 4.snRNA tRNA的二、三级结构 Small RNAs 四、遗传密码及其特点 1.遗传密码——DNA分子中核苷 AUG（Met） 酸的排列顺序与蛋白质中氨基酸 排列顺序之间的对应关系。遗传 密码是由三个碱基组成的，因此 叫三联体密码。 GUG（Val） 2.遗传密码的特点 UAA f-Met UAG ①简并现象 UGA ②具有起始密码子和终止密码子 ③具有连续可读性和不重叠性 21 硒半胱氨酸 ④普遍通用性 22 吡咯赖氨酸 遗 传 密 码 表 遗传密码通用性的另外情况 五、遗传信息的转录与RNA的加工 1.mRNA的转录（mRNA的合成） 2.合成后的加工 ①原核生物——边转录边合成Pr，无转录后加工 ②真核生物 A：HnRNA的加工剪接 B：mRNA的加帽和甲基化 C：mRNA的加尾 D：mRNA的转运 真核细胞信息流动 六、蛋白质的生物合成 1.合成场所 2.合成体系(合成起始、肽链延伸、翻译终止） 3.合成后的加工与修饰 （肽链中AA残基的化学修饰，N端部分AA的切除，信号 肽的切除，肽链的折叠，切除前体中功能不需要的肽 段，二硫键的形成等） 4.合成后的贮存、转运与功能行使 翻 译 示 意 图 七、中心法则及其发展 1.中心法则——遗传信息从DNA转录到mRNA再翻 译成蛋白质，以及遗传信息从DNA到DNA的复制过程， 这就是分子生物学的中心法则。这一法则提示了基 因的两个基本属性：自我复制和控制蛋白质合成。 2.尚需解决的问题 ①HnRNA转录后加工 ？？？ mRNA ②mRNA 翻译 多肽 ？？？？ 蛋白质或亚基 ？？？？ 高级结构 逆转录过程中cDNA的合成 八、基因表达调控 1.原核生物基因表达调控 ①正调控和负调控 ②乳糖操纵子 ③色氨酸操纵子与衰减作用 ④基因表达的时序调控 ⑤DNA序列重排的调控 2.真核生物基因表达调控 ①DNA及染色体水平的调控 ②转录水平的调控（顺式作用元件和反式作用元件） ③转录后水平的调控（RNA编辑，mRNA前体的选择性拼 接，反义RNA的调控） 9.4 基因的概念与发展 1.1865年 Mendel——遗传因子 2.1909年 丹麦Johanssen——基因 3.1910年—40年代 Morgan等认为基因是三合一体，即基因既是一 个功能单位，也是一个突变单位和一个交换单位。 4.1944年Avery首次证实基因是由DNA构成，及 1953年DNA双螺旋模型的提出，人们认为基因是 具有一定遗传效应的DNA片段。 5.1955年，Benzer通过顺反互补实验发现一个基 因内部的许多位点上可以发生突变，并且可能在 这些位点间发生交换，说明一个基因并不是一个 突变单位和一个交换单位。 9.4 基因的概念与发展 6.操纵子的发现修正了有一个基因就有一条多肽或 决定一个蛋白质功能的就是基因的说法。 1944年Beadle研究脉胞菌突变——提出一基因一酶学说； 后来研究血红蛋白时发现蛋白质可由不同肽链组成，而突变 只影响一条肽链——提出了一基因一多肽学说； 60年代，Jacod和Monod研究细菌基因调控时发现基因是可分 的，功能上是有差别的。 结构基因—决定合成某种蛋白质 调节基因—编码阻遏或激活结构基因转录的蛋白质基因 无翻译产物的基因 7.新的发现——断裂基因，重叠基因，跳跃基因 比较DNA序列和成熟mRNA——内含子和外显子 9.4 基因的概念与发展 ①基因是实体，它的物质基础是DNA（或RNA）； ②基因是具有一定遗传效应的DNA分子中的特定核 苷酸序列； ③基因是遗传信息传递和性状分化发育的依据 ④基因是可分的 按原初功能（基因的产物）基因可分为 编码蛋白质的基因（结构基因+调节基因） 无翻译产物的基因（如rDNA ，tDNA ，SnDNA ） 不转录的DNA区段（如启动子，操纵基因等） 9.5 核酸研究技术简介 一、核酸分子杂交 二、 DNA重组技术 三、基因文库与cDNA文库 四、聚合酶链式反应（PCR） 五、核酸分子标记技术 六、DNA芯片(DNA Chip)技术 七、蛋白质技术和核酸技术的相互增强 八、肽核酸及其性质 DNA杂交原理示意图 一 、 核 酸 分 子 杂 交 限制性酶切割 限制片段 琼脂糖电泳 DNA分子 带有DNA片 段的凝胶 一 、 核 酸 分 子 杂 交 用缓冲液 转移DNA 转移至硝酸纤维素膜上 凝胶 滤膜 与放射性标记 DNA探针杂交 吸附有DNA 片段的膜 放射自显影 Southern 印迹法 Southern和Western印迹法 32P-labled DNA Electrophoresis frangment Transfer of DNA by blotting Agarrose gel SDS-Polyacrylamide gel Polymer sheet Autoradiography Autoradiogram Nitrocellulose sheet Add radiolabled spesfic antibody , Wash to remove unboud antibody Transfer protein DNA probe Autoradiography Protein band detected by specific antibody Autoradiogram 复印至硝酸 纤维素膜上 用NaOH菌体裂解 DNA变性 细菌菌落 单链DNA结 合到膜上 32P-cDNA 杂交 放射自显影 原位杂交法筛选 DNA重组体图解 与放射性cDNA杂 交的菌落的斑点 一 、 核 酸 分 子 杂 交 基因工程的 技术路线 + Foreign DNA to be inserted Joining 1、目的基因的制备 3、目的基因与载体 二 、 的重组 DNA 2、载体的构建 4、重组 体导入宿 主细胞进行扩增 5、目的基因的表达 等一系列复杂的过 程 Plansmid vector Recombinant DNA molecule Introduction into host cells by transformation of viral infection 重 组 技 术 Host chromateme Cloning Slection for cells coteining a recombinant DNA molecule 植物冠瘿瘤 pBR322质粒的结构 Ti质粒结构 噬菌体感染大肠杆菌的途径 二、 DNA重组技术 二、 DNA重组技术 胰岛素原的人工合成 胰岛素原 胰岛素原基因 mRNA 反转录酶 与质粒 连接 感染 E.coli (A)n 胰脏 胰岛素原mRNA cDNA 重组质粒 转化细菌 I 二元载体系统 Ti 质 粒 为 载 体 的 同 源 重 组 外源基因 Ti辅助DNA 给体质粒 Ti辅助质粒 宿主特 异性 II 载体系统 pBR型质粒 （给体质粒） 宿主特 异性 整合 Ti辅助DNA 给体质粒 III T-DNA的转移与整合 二、 DNA重组技术 带有外源基因 的Ti质粒 Ti质粒转移并 插入植物DNA 植物DNA 基因文库 基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分 子克隆之总和。应用DNA重组技术，可以将各种生物体全部基因 组的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定重组体中，以备需要 时应用。好象将文献资料贮存于图书馆一样，所以称其为genomic library。 基因文库中应包含多少DNA克隆才能使任意所需要的基因以 极高的概率存在于该文库中？其计算公式如下： N=ln(1-p)/ln(1-f) N 基因文库所包含克隆的数目； p 任意所需基因存在于基因文库中的概率，要求大于99%； f 克隆的DNA片段大小（bp）占基因组大小(bp)的分数。 现在已构建的基因组文库主要有 •BAC(细菌人工染色体)，以细菌作为对象，将 DNA片段与质粒重组后转入细菌中繁殖。 •YAC(酵母人工染色体)，以酵母作为对象。 • PAC(噬菌体人工染色体), 以噬菌体作为对象。 •TAC(可转化的细菌人工染色体) • MAC(哺乳类人工染色体） cDNA文库 真核细胞基因是断裂的，在基因最后产物中表达的编码序列（外显 子）被非编码序列（内含子）分隔开，需经RNA转录后加工过程才使编 码序列拼接在一起。真核生物基因不能在原核生物中表达，只有将加工成 熟的mRNA反转录成cDNA （complemental DNA）接上原核生物表达控 制元件，才能在原核生物中表达。再有，真核生物的基因通常只有一小部 分进行表达，由于mRNA的不稳定性，对基因表达和有关mRNA都通常通 过对其cDNA来进行研究的。将细胞全部mRNA反转录成cDNA并被克隆 的总和称为cDNA文库。 RNA病毒的基因组是RNA，也必须将RNA先转 录成cDNA，再建立文库。 为使低丰度的mRNA的cDNA克隆存在的概率大于99%，cDNA文库 应含的克隆数的计算公式如下： N=ln(1-p)/ln(1-1/n) N cDNA文库所包含克隆的数目； p 低丰度cDNA存在于基因文库中的概率，要求其大于99%； 1/n 每一种低丰度的mRNA占总 mRNA的分数。 基因文库和cDNA文库的建立 组织 载体 mRNA DNA cDNA 部分或完全 酶解DNA 甲基化，双链 接头DNA DNA长度分级 可克隆之DNA DNA与载体连接 引入大肠杆菌 筛选出所需 要的克隆 鉴定文库的滴度和特性 扩增后供 长期储存 基 因 文 库 的 构 建 四、聚合酶链式反应（PCR） （1）PCR的原理 1985年Mullis发明PCR（ polymerase chain reaction）快速扩增 DNA的方法。该法模仿体内DNA的复制过程，首先使DNA变性，两条 链解开，然后使引物模板退火，二者碱基配对，DNA聚合酶随即以4种 dNTP为底物，在引物的引导下合成与模板互补的DNA新链。重复此过 程，DNA以指数方式扩增。扩增的公式为: Y=(1+X)n 式中 y一产量; X--扩增效率; n一循环次数。 （2） PCR的应用 PCR技术原理示意图 靶序列 循环1 变性和引 物复姓 链延伸 循环2 变性和引 物复姓 链延伸 循环3 PCR技术的发展与应用 用于合成特异探针； 用于DNA的测序； 将逆转录与PCR相偶联 （RT-PCR）； 用于基因定位诱变； 末知序列的PCR扩增； 基因组序列的比较研究； 用于临床诊断。 五．核酸分子标记技术 1．限制性片段多态性（RFLP, restriction fragment length polymorphism） 2．随机扩增多态DNA（RAPD, random amplified polymorphic DNA） 3．扩增片段长度多态性（AFLP, amplified fragment length polymorphism） 4．简单串联重复序列（SSR，simple sequence repeat） 5．单核苷酸多态性（SNP，simple nucleotide polymorphism） RFLP （ restriction fragment length polymorphism） 由限制性内切酶把很大的DNA分子降解成许多长短不同 的较小片段，其数目和长度反映了限制性内切酶的切点在 DNA分子上的分布，它能作为某DNA或含这种DNA生物所 特有的“指纹”，不同个体的等位基因之间碱基代换、重排 、插入、缺失等都会引起这种“指纹”的多态性。 对于复杂的真核基因，要检测限制性片段长度多态性必 须借助于放射性同位素(通常用32p)或非放射性物质(如地高辛 等)标记的探针,与经限制性内切酶消化的基因组DNA杂交,再 通过电泳显示限制性酶切片段的大小来检测不同遗传位点的 等位变异(多态性)。 例1：人的RFLP指纹分析 A C B A为父亲的DNA指纹图 谱，B为母亲的DNA指纹 图谱，C为子\女可能出 现的DNA指纹图谱。图 左、右两侧的箭头表示 子女DNA指纹图中分别 与其父、母的DNA指纹 图谱中相对应的分子杂 交条带。 F1 ＋ 例2：系统发育的RFLP分析 13 5 6 2 8 A植物的DNA限制性内切酶图谱 A B C 13 11 A B C 9 8 6 5 4 系统发育图谱 2 琼脂糖电泳图谱 如果植物A与祖先植物种相比变化很小，假设它发生了两个突变， 一个突变是形成植物B的过程中产生了一个9kp和4kp的片段；另一个突 变是形成植物C的过程中，一个限制性内切酶位点消失，产生一个11kp 的内切酶片段，而5kp和6kp两条带消失。可以根据这些变化列出如右 侧的系统发育图。 RAPD （random amplified polymorphic DNA） RAPD是1990年由Williams等发明的。其方法是用一个随机 核苷酸序列（9-10bp）为引物对基因组的DNA进行 PCR扩增， 产生不连续的DNA产物，再通过凝胶电泳来观察扩增片段的多 态性，获得特异分子标记。 RAPD只产生显性标记（即有或没有），所以不能用来鉴定 杂合体。 RAPD也不能单独的用来对没有基因标记的生物进行 遗传图谱分析，因为它所产生的多态性是随机的。 然而RAPD比RFLP有一定的优点：随机引物可在实验室空 间进行交换；免去DNA分子杂交；对低拷贝序列同样灵敏；操 作自动化，可成为遗传图谱构建的普遍方法。 AFLP （amplified fragment length polymorphism） AFLP是RFLP和PCR技术相结合产生的一种 新技术。用限制性内切酶消化基因组DNA，由于不 同材料的DNA的酶切片段存在差异，用特定引物选 择性地扩增基因组限制性酶切片段，再用凝胶电泳 分离就可以观察基因组DNA的多态性。该法避免了 使用繁杂的DNA杂交技术，同时具有多态性丰富、 不受环境影响、无复等位效应、灵敏度高、快速高 效等特点。 简单串联重复序列(SSR) (simple sequence repeat ) 这是一类由1-5个核苷酸为重复单位组成的长达几 十个核苷酸的串联重复序列（微卫星DNA）。同一类微卫 星DNA可分布在整个基因组的不同座位上，由于重复次数 不同或重复程度不完全而形成每个座位的多态性，这种多 态性的信息量是比较高的。在每个微卫星两端DNA的序列 多是相对保守的单拷贝序列，因此可以根据两端的序列设 计一对特异的引物，扩增每个位点的微卫星序列,再经 PAGE电泳，比较扩增产物的长短变化，即可显示不同基 因型的个体在每个微卫星DNA位点的多态性. 单核苷酸多态性（ SNP ） (single nuclotide polymorphism) SNP是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异或只 有小的片段插入、缺失等。据估计,每500～1000个单核苷酸会出现 1个单核苷酸多态性(slngle nuclotide polymorphism，SNP)。实际 上,所有遗传多态性的基础都是核苷酸的差异，SNP有可能在密度 上达到人类基因组多态位点数目的极限。 SNP与RFLP和SSR等DNA标记的主要不同点是不再以长度的 差异作为检测手段，而直接以序列上单个核苷酸的变异为标记。 理论上，SNP可在核苷酸水平上把序列图、物理图与遗传图有机 地整合、统一起来。 六、DNA芯片技术简介 DNA芯片(DNA chip)技术是采用寡核苷酸原位合成或显微打印手段， 将数以万计的DNA探针片段有序地固化于支持物表面上，产生二维DNA 探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，反应结果通过检测杂交信号的 方法（同位素法、化学荧光法、化学发光法或酶标法）显示，再用精密 的扫描仪或CCD摄象技术记录，通过计算机软件分析，综合成可读的IC 总信息，来实现对生物样品的快速、并行、高效地检测或诊断。 芯片分析实际上也是传感器分析的组合。芯片阵列中的每一个单元微 点都是一个传感器的探头，所以传感器技术的精髓往往都被用于芯片的 发展。阵列检测可以大大提高检测效率，减少工作量，增加可比性，所 以芯片技术也是传感器技术的发展。 DVA芯片工作示意图 DNA clones test reference Laser 1 Laser 2 reverse transcription PCR amplification purfication Label with fluor dyes emission robotic printing hybridize target to microarray computer analysis 七、蛋白质技术和核酸技术的相互增强 转化寄主细胞 插入表达载体 蛋白质 基因或 cDNA 推导出 AA顺序 测定出 AA顺序 制备合成肽 合成cDNA 探针 蛋白质 制备专一的抗体 制备对所编码蛋白 专一的抗体 用Southern印迹法 筛选DNA文库 用Western印迹法 制备DNA文库 基因或 cDNA 八、肽核酸 199l年 Michael Egholm，Peter Nielen，Ole Buchardet和Rolf Berg在 丹麦的哥本哈根大学将代表DNA、RNA遗传信息的碱基连在肽骨架上, 由此诞生了一类新的分子—肽核酸（Peptide Nucleic Acid，PNA）。肽 核酸以其特异性和稳定性高的优势，在很多领域已取代了寡核苷酸如作 为探针、反义药物等，并开拓了一些新领域。 1 PNA的分子结构 2 PNA的杂交性质及特点 3 PNA的分子生物学效应 4 PNA在分子生物学研究中的应用 5 PNA在基因诊断和基因治疗中的研究 1 PNA的分子结构 亚甲基羰基 H2 主链基本结构单位： (2-氨基乙基)甘氨酸 PNA DNA 2 PNA的性质 （1）PNA的杂交性质 PNA能识别含互补碱基的靶序列，可与单链 DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)及RNA序列 特异性杂交。 （2）PNA与核酸结合的特点 以平行或反平行方式与核酸结合 高度的特异性与亲和性（ Tm值高） 不被核酸酶和蛋白酶所降解 常以链侵袭（Stand invasion）方式与核酸结合 PNA的杂交性质 与单链DNA或RNA杂交 PNA-DNA(或RNA)-PNA 三螺旋 PNA-DNA(或RNA ) 双螺旋 (纯嘧啶序列PNA) (嘌呤嘧啶混合或 纯嘌呤序列PNA) 与双链DNA杂交 PNA2-DNA三螺旋 PNA-DNA双螺旋 PNA-DNA2三螺旋 (高比例胸腺嘧啶的 纯嘧啶序列PNA) (纯嘌呤序列PNA) (富含胞嘧啶PNA) 5' 平行PNA-DNA 杂交链 B P B P 3' PNA的链侵袭作用 PNA DNA双螺旋 PNA DNA\PNA 双螺旋D环 DNA\PNA2 三螺旋D环 3、PNA的分子生物学效应 （1）对核酸序列识别蛋白的影响 （2）对转录的调节 (反基因性质) （3）对基因表达的调节 (反义性质) （4）对逆转录抑制作用 PNA介导的dsDNA转录序列专一的S1酶切割 核 酸 酶 S1 切 割 位 点 DNA PNA 核 酸 酶 S1 切 割 位 点 DNA PNA PNA介导的转录 转录 RNA聚合酶利 用D环进行转录 DNA PNA 转录 在两段PNA链与 dsDNA同一链结合产 生的D环进行转录 转录 在两段PNA链与 dsDNA相对链结合产 生的D环进行转录 转录 4 、 PNA在分子生物学研究中的应用 PNA杂交实验 增强固相柱或生物磁粒亲和捕获力 控制限制性内切酶的切割位点 为反义研究提供新方法 不测序列的点突变分析 5 PNA在基因诊断和基因治疗中的研究 5.1 基因诊断 PNA杂交探针 DNA结构分析 点突变部位分析 5.2 基因治疗 PNA进入细胞的方式研究 基因治疗 基因调节药物研究 经载体的PNA跨摸运送 PNA 生物素 亲合素 受体单克 隆抗体 受体介导PNA 跨摸运送 生物素化PNA和亲 合素转铁蛋白受体 单克隆抗体结合 PNA转铁蛋白复合 体与受体结合 9.6 人类基因组计划简介 （Human Genome Project,HGP） 1. HGP大事记 2. HGP的科学目标 3. HGP的导向性意义 4. HGP面临的挑战 1、HGP大事记 1985年：R.Sinsheime 在加州大学Santa Cruz分校主持会议，讨论将人 类基因组全部测序的可行性；同年，Mullis发明了PCR技术。 1986年： 3月,美国能源部(Department of Energy，DOE)在新墨西哥州 召开会议,讨论人类基因组测序计划。第一台DNA自动测序仪问世。 1990年：NRC和DOE宣布这一年的10月1日为人类基因组计划的正式 启动时间。 1992年：美国和法国的两支研究队伍分别完成了人类Ｙ染色体和第21 条染色体的第一张物理图谱；随后又分别完成了鼠和人的遗传图谱。 1993年： 位于英国剑桥的Sanger中心加入人类基因组计划，并成为一 个重要的测序中心。 1994年：美国与法国完成了人类基因组中的第一个完整遗传连接图谱 1996年： 各国科学家聚集在百慕大群岛，讨论并通过了充分体现HGP 精神（全球共有，国际合作，即时公布，免费共享）的百慕大原则。 1997年：大肠杆菌基因组（5Mb）全部测序完成，毛细管测序仪上市 HGP大事记(续) 1998年： Venter宣布成立Celera公司，并宣称将采用“全基因组鸟枪法 ”完成人类基因组的全部测序。从此，人类基因组测序在“公” “私”之 间展开了激烈竞争； 同年,线虫基因组测序完成。 1999年：中国获准参加HGP，承担测定人类基因组1%测序任务；英国 日本和美国共同完成了第一条人染色体—第22条染色体的全部测序工作。 2000年： 6月26日，HGP与Celera公司的领导人在白宫的庆祝仪式上共同 宣布了人类基因组工作框架图的完成，并约定将双方的研究成果同时发表; Celera公司完成了果蝇基因组(180Ｍｂ)的全部测序工作，证明了“全基因 组鸟枪法”的可行性；德国和日本的科学家公布了人类第21条染色体的测 序结果；第一个植物基因组—拟南芥基因组（125Mb）被全部测序。 2001年： HGP将人类基因组工作框架图发表在《Nature》; Celera公司 则将其成果发表在《Science》上。“工作框架图”已能覆盖人类基因组的 97%，其中至少92%的序列已组装得准确无误，并显示其中只有3万到4万 个编码蛋白质的基因，这是人类基因组研究的一个重要里程碑。 2、HGP的科学目标 HGP使人类对自身的认识达到了一个前所未有的高度，其主要 的科学目标是绘制四张图,这四张图组成人类不同层次的、分子水 平的“第二张解剖图”，将成为人类认识自我的知识源泉。 遗传图 物理图 转录图 序列图 随着该目标的日趋实现，“功能基因组学”兴起，HGP研究的重心 逐步由结构向功能转移，即基因组功能信息的提取、鉴定和开发利用， 以及与此相关的数据资料和技术手段的储存和使用。 遗传图 以具有遗传多态性的遗传标记为路标 ,以遗传学距离为图距绘 制的基因组图。此处的遗传多态性定义为在某个遗传位点上具有一个以上 的等位基因,且其在群体中出现的频率均高于1%。而遗传学距离则是指在 减数分裂事件中,两个位点之间进行交换、重组的百分率,并规定1%的重组 率为1ｃＭ。 多态性标志 第一代： 限制性酶切片段长度多态性（restriction fragment length polymophism，RFLP） 第二代：简单序列长度多态性（simple sequence length polymophism，SSLP） 第三代：单个核苷酸多态性（sequence tagged site，SNP） 物理图 以一段已知核苷酸序列的DNA片段为标记,以Mb或Kb作 为 图 距 绘 制 的 基 因 组 图 。 该 DNA 片 段 称 序 列 标 记 位 置 (sequence tagged site，STS)。 物理图的意义在于STS可把经典遗传学与细胞遗传学的 位点信息转化为基因组位点的物理信息，基于STS位点信息 的相连片段群又提供了研究区域的实验材料，以这些片段的 材料便可进行该区域的基因组研究或在该区域寻找新基因。 转录图 把mRNA先分离、定位，再转录成cDNA，这就构 成一张人类基因的转录图，cDNA片段又称表达序列标 签(exprossed sequence tag，EST)，因此转录图也称为 表达序列图。 由于cDNA具有组织、生理与发育阶段的特异性， 因此EST除提供序列信息外，同时也提供了该基因表达 的组织、生理状况与发育阶段的信息。 序列图 人类基因组核苷酸序列图即是分子水平的最高层次的、 最详尽的物理图，由总长度为1ｍ左右、约由31亿核苷酸组 成。当前人类基因组全序列图实际上是一个“代表性人类 个体”的序列图，因为所有人类基因个体的基因位点都是 相同的,不同族种、不同个体的基因差异,以及“正常”与“ 致病”基因的差异,只是同一位点上的等位基因的差异。 3、HGP对生命科学与生物产业发展的的导向性意义 规模化 序列化 信息化 产业化 医学化 人文化 4、HGP面临的挑战 基因的隐私权问题 基因组图谱和信息的使用与人的社会权利问题 基因资源问题 基因知识的滥用问题 9.7 遗传工程及其应用 一、基因工程 二、细胞工程 三、染色体工程 四、细胞器工程 基因工程的基本步骤及实施要点 1.目的基因的制备 ①鸟枪法（shot gun） ②化学合成 ③从cDNA库中分离 ④从基因组文库中分离 2.载体的构建 ①载体的选择 ②限制性内切酶的选择 3.目的基因与载体的重组 4.重组体的导入 5.目的基因的表达及筛选 ①转化或转染 ②高压电穿孔法 ③ PEG(聚乙二醇)介导的 原生质体转化法 ④磷酸钙或DEAE-葡聚糖介 导的转染 ⑤原生质体融合 ⑥脂质体法 ⑦细胞显微注射法 本章要求 1.DNA是主要遗传物质的间接证据与直接证据； 2.DNA分子一级结构及双螺旋结构模型要点， DNA复制的基本模型(半保留半不连续性)； 3.遗传信息传递的中心法则与发展； 4.转录、翻译的基本过程及机理； 5.基因概念的发展历程； 6.常用核酸研究技术； 7.基因工程的概念及其基本步骤。 复习思考题