Transcript 分子诊断的临床应用 - 上海交通大学医学院医学检验系

分子诊断的临床应用
上海交通大学医学院
樊绮诗 教授
用分子生物学技术通过检测基因而达
到诊断疾病的目的是生物学者在分子生物
学技术发展的最初阶段就有的设想。
上世纪70年代人们开始在实验室进行
研究，80年代以来，基因检测在许多国家
已成为常规检验项目，主要用于感染性和
遗传性疾病等的诊断。
1953年Watson 和Crick 提出脱氧核糖核酸
的双螺旋结构模型。
 1990年人类基因组计划正式启动。
 2001年2月科学家宣布完成人类基因组的全
部序列图。

DNA重组技术(DNA recombination)
转基因技术(transgenic technique)
基因组学(genomics)
蛋白组学(proteomics)
基因治疗(genotherapy)
生物芯片(biochip)等技术
已应用到医学领域，对疾病机理的认识、疾
病的诊断、预防和治疗产生了深刻的影响。
分子诊断不仅能早期对疾病作出确切的诊
断，也能确定个体对疾病的易感性，判别
致病基因携带者并对疾病的分期、分型、
疗效监测和预后作出判断。
分子诊断已成为实验诊断学的一个重要组
成部分，成为一门新的学科。
Molecular diagnosis
Molecular diagnostics
一、基因检测在感染性疾病
中的应用
SARS相关冠状病毒的分子诊断

2003年4月，香港研究者Peiris等报告了50 例
SARS病人的临床表现和病毒学研究结果。

一种新的冠状病毒 (Coronavirus) 是SARS 的
致病原因。
(Lancet, 2003, 361: 9365)

2003年4月，德国汉堡Bernhard-Nocht热带医
学研究所学者Drosten等用随机扩增技术，获
得一段长度为300bp的核苷酸序列。

根据这段序列，建立了检测新冠状病毒的常
规和实时定量PCR技术。
www.nejm.com.org on April 10, 2003）

检测标本
痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺泡灌洗液 、
血浆、粪便。

检测方法
1. 逆转录-巢式PCR (Reverse-Nested PCR)
2. 逆转录-实时PCR (Reverse-Real time PCR)
有报道显示，在可能SARS病人中病毒的
检出率为100%。
 在疑似SARS病人中的检出率为23%。
 所有健康接触者中未检测到病毒。

另一项研究显示
检测病毒的3种方法（血清学检测、病
毒分离、PCR技术）中，PCR技术的检出率
最高。
讨 论

疾病的早期即可获得阳性结果(早于血清转换
期）。

SARS患者中的阳性率约为80%，对照中的阴性
率约为98%～100%。

现有的PCR方法有较高的特异性但灵敏度较差，
阴性结果不能排除病毒感染。
讨 论

痰液中病毒RNA浓度极高，说明病毒从呼吸道
排放是主要传播途径。

血清中检测到极低浓度的病毒RNA，提示病毒
复制不仅发生于呼吸道。

病人恢复晚期的粪便中存在病毒RNA，说明粪
便可能也是一种传播途径。

鼻、咽拭子中含有的病毒RNA显著少于痰液，
提示不适合作为标本（有可能漏检）。
SARS相关冠状病毒基因检测
必须注意的问题

必须在规范的基因扩增实验室中进行。

应采取必要的质控规程，包括阳性对照和阴
性对照。

阳性结果时必须对原始样本重复检验：
或者扩增另一个基因片段
或在另一个实验室对同一样本进行检测。
肝炎病毒基因的检测
临床价值主要体现在：

病情评估
血清中病毒含量的多少与肝脏病理损害程度相关，
病毒载量越高，肝组织炎症反应程度越重。

疗效预测
治疗前病毒核酸载量越高，疗效越差；载量越低，
机体清除病毒的可能性越大。
预后判断
 病毒核酸载量持续处于高浓度者预后不良。
 垂直传播途径感染者，预后较差。
 反映肝细胞损害的其它指标正常，但病毒核酸
水平经常波动者更易发展为肝硬化。
病毒分型和耐药检测

各个编码区段存在着大量有意义的自然变异
或药物诱导的变异，并由此产生不同的变异
株，从而导致 HBV感染的不同血清学和临床
表现。

检测HBV的变异株对了解疾病机制、药物耐受
和指导用药有一定的价值。
HPV基因的检测在预防宫颈
癌中的作用

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在
女性恶性肿瘤中居第二位，每年约有50万左右
新发病例。

我国每年有新发病例约13.15万，占世界宫颈
癌新发病例总数的26%。

持续的人乳头瘤病毒(human papillomavirus,
HPV) 感染是引起宫颈癌和癌前病变的必要因
素，93.0%-99.7%的宫颈癌组织中均可检测到
HPV DNA。

高危型HPV-16和HPV-18分别占宫颈癌的50%和
14%。高危型HPV的持续感染可使患宫颈癌的风
险增加250倍。
HPV DNA的检测方法
 实时定量PCR (Real time PCR)
 核酸杂交捕获（Hybrid CaptureⅡ，HCⅡ）

HC Ⅱ可一次检测所有致癌的13种高危型HPV。

敏感度：对CIN Ⅱ、Ⅲ和癌的检出率为 98%。

阴性预期值：对高度鳞状上皮细胞病变或更高度
病变的阴性预期值99.9%

细胞学检查结果为意义不明确的非典型细胞时，
HPV基因的检测能预测受检者患宫颈癌的风险。

细胞学检查+HPV基因的检测是宫颈癌前病变和宫
颈癌筛查的最佳方法，成为预防宫颈癌的关键。
基因检测在监测移植物排
斥中的作用
关于多瘤病毒

人类多瘤病毒中常见的3种病毒：BK、JC、SV40。

BK病毒于1971年首次从肾脏移植受体的尿液中分离
出。病毒主要在宿主的细胞核内进行复制。

在美国，10岁以上的正常人群中60%～80%有BK
病毒感染史。

感染的病毒多潜伏于肾小管上皮细胞和尿道上
皮细胞中。

BK病毒重新激活大部分是由于免疫机制缺陷或
大量使用免疫抑制剂后。

肾脏移植术后大量使用免疫抑制剂，使BK病毒重
新激活，大量复制。

BK病毒复制进一步发展，成为BK病毒感染的肾间
质性肾病（BKVAN）。

BKVAN患者中60%～70%会发生远期的肾脏移植失
败。

BK病毒感染已经成为肾脏移植远期失败的
重要原因之一。

BK病毒感染越来越受到关注。

早期无临床症状，后期症状与肾移植排斥和药
物毒性反应相似，易引起误诊和漏诊。

BK病毒感染和移植排斥治疗原则相反：BK病毒
感染需要降低免疫抑制剂量，而移植排斥则应
加大用量。
因此，建立有效的BK病毒检测和监测体系
是十分必要的。
decoy细胞

BK病毒感染的肾脏小管上皮细胞脱落至尿液。

形态学检测敏感性较好，但特异性差。

细胞形态在尿液中很容易破坏。
巴氏染色的decoy细胞
未经染色的decoy 细胞
BK病毒感染的检测
BK病毒的检测

血、尿中BK病毒核酸定量检测

尿液中decoy细胞检查

尿沉渣涂片原位杂交
组织病理学检查（判断肾脏间质性肾病）
肾脏移植术后病人BK病毒检测的
研究
对象

瑞金医院肾脏移植术后2个月～3年的患者95例

正常人标本60例
研究方法

尿沉渣细胞形态学检测

血、尿中BK 病毒DNA的定量检测
Decoy细胞形态学特征:
小管上皮细胞的细胞核明显增大，多偏向
一侧，核浆比例明显增加；细胞边缘常常
出现毛玻璃样改变；胞浆有细小颗粒，较
均匀，呈果冻状；细胞核常较粗糙。
结 果
95例患者的尿沉渣形态学检查，35例
患者的尿沉渣中出现可疑的病毒感染肾
小管上皮细胞（decoy细胞）。
尿液中BK病毒核酸定量检测

14例尿液中检测到BKV DNA，病毒载量为
4×103～2×109/ml，平均为5.6×105/ml。

发生病毒尿的中位时间为移植术后14个月。
血浆中BK病毒核酸检测

14例病毒尿中，有5例同时出现病毒血症。

核酸载量为2×104/ml～4.8×106/ml，平均为
4.2×104/ml。
阴性对照
核酸序列分析


6例病毒检测阳性的核酸标本进行序列分析。
所测片段序列均为BK病毒的核酸序列
BK病毒核酸序列

3例患者在临床上出现不明原因的发热、白细胞
降低、缓慢的肌酐升高等症状，有1例甚至出现
了尿道阻塞。

临床上认为发生BKVAN的可能性较大，给予抗病
毒治疗。
病例1、2
治疗前：
尿液和血浆病毒核酸载量在104/ml～105/ml
 血肌酐分别为181μmol/L和168μmol/L

治疗后：
血浆和尿液中BK病毒已检测不出
 血肌酐降为160μmol/L和129μmol/L

病例3
治疗前
 尿液中BK病毒核酸载量为2×109拷贝/ml
 尿沉渣细胞中见到大量decoy细胞和炎性细胞
治疗后
 尿液中BK病毒核酸载量降至105拷贝/ml
 尿沉渣细胞中decoy细胞明显减少
治疗前
治疗10天后
治疗20天后
讨 论

文献报道BK病毒的复制感染率为5%～60%，本
研究中发生BK病毒复制的占14.7%。

35例患者中发现decoy细胞，仅14例被证实存
在病毒核酸，提示形态学检查特异性差。

肾脏移植的患者容易导致包括BK病毒在内的多
种病毒感染。
因此

是否存在BK病毒感染，形态学仅作为筛查
实验。

病毒核酸定量可有效地动态观察病毒核酸
的复制。
BK病毒核酸定量检测

用于检测BK病毒是否复制
为是否需要进行病理学检查提供依据
 监测疾病和评价治疗效果
 预防间质性肾病，防止移植远期失败

二、遗传性疾病的分子
诊断
分子诊断能够检出家系中的致病基
因携带者或高危个体，能够在胎儿出生
前判断其是否为患者，因此分子诊断是
降低单基因遗传病发病率的根本措施。

单基因遗传病是由于某一基因结构的变
化或基因表达异常而导致的疾病

用分子生物学技术检测致病基因的遗传
缺陷是诊断这类疾病最根本的手段
遗传性疾病中常见的分子异常

遗传性疾病的产生是由于一个（或数个）基因
发生异常导致这些基因所载有的遗传信息受到
改变，而发病是通过遗传物质的表达产物——
蛋白质（或酶）的表现异常所致。

基因突变主要包括点突变、片段性突变和动态
性突变。
点突变 (point mutation)

包括错义突变、无义突变、移码突变

各种点突变所造成的后果：
蛋白质分子量改变
蛋白质合成量下降
无蛋白质合成
片段性突变(fragememtal mutation)
核苷酸的丢失和增多

缺失：基因中硷基（遗传物质）的丢失

插入：外来基因片段插入某一基因序列中
倍增：基因内部某一段序列发生重复
 基因重排：基因组中原来不在一起的基因
由于某些原因组合排列在一起

动态性突变(dynamic mutation)
以三核苷酸为单位的重复序列在传递过程中
不稳定，会发生扩展，即子代的重复次数往
往较亲代大为增加，因此又称动态性突变。
脆性X综合征：CGG重复
少年脊髓型共济失调：GAA重复
亨廷顿病：CAG重复
• 脆性X综合征是遗传性智力缺陷最常见的一种。
• 致病基因FMR-1的5’端有CGG三核苷酸重复区。
• 普通男性群体中的患病率为1/4000。
• 普通女性群体中的患病率为1/6000。
• 患者智力低下、语言障碍、行为异常、呈特殊
面容。
X染色体（xq27.3）的脆性位点
正常个体：CGG重复次数6~52次，中国人群以(CGG)28为多见。
前突变(premutation)：
(CGG) 53~230为携带者，虽表型正常，但在传
递过程中易发生进一步扩展，使后代的CGG重复次数大大增加，并
有异常表型。
全突变：
(CGG) ≥230时，100%的男性表现为典型的脆性X综合征,
53%的女性表现为程度不同的智力低下。
遗传性疾病基因诊断的策略
（一）直接诊断策略
基因诊断的直接策略是通过各种分
子生物学技术检测基因的遗传缺陷，因
此直接诊断的前提是被检测基因的正常
序列和结构必须被阐明。
直接诊断由于是直接揭示遗传缺陷，
因而比较可靠。
DMD的基因检测
Duchenne muscular dystrophy (DMD) 是一
种高发病率、高致残、高致死的X连锁的遗传
性疾病，在3500个活产男婴中即有一个患者。


DMD基因的全长为250kb，有79个外显子。

DMD 的最主要遗传缺陷是外显子缺失，约占
60%～70%。
DMD基因外显子的检测
（二）间接诊断策略
间接诊断的实质是在家系中进行连锁
分析，通过分析可确定个体来自双亲的同
源染色体中的哪一条为致病染色体，从而
判断该个体是否带有致病基因。
间接诊断不是寻找 DNA 的遗传缺陷，
而是通过分析DNA的遗传标记的多态性估
计被检者患病的可能性。
间接诊断：分析DNA的遗传标记的多态性
双等位基因(bi-allele）多态性：
限制性片段长度多态性（RFLP）
第一代DNA遗传标记，所含信息量有限。
检测技术：Southern印迹技术
多等位基因多态性(multi-allele)
小卫星序列

又称串联重复可变数目（variable number
tandem repeats，VNTR）

第二代DNA遗传标记

以 6～70bp 为单位，以串联形式排列，构成
数量可变的串联重复序列

等位基因常常达10个以上，信息量比 RFLP大
检测技术：PCR
微卫星序列 (microsatellite)
 以 2～6bp 为单位，重复次数可达几十次，又称
短串联重复序列(STR) 。

在基因组中分布广泛，出现的数目和频率不同，
具高度多态性。
检测技术：PCR
单核苷酸多态性(single
nucleotide poly- morphism，SNP)

第三代DNA的遗传标记，其多态性仅表现为
单个核苷酸的变异。

在人类基因组中的数目可达300万个，是一种
信息量非常大的标记系统。
检测技术：DNA芯片技术
1
2
8
7
3
4
5
C50:
C49:
C45:
C44:
Cjp:
6
15
9
10
C50:
C49:
C45:
C44:
Cjp:
11
2
1
1
2
1
2
1
3
1
3
C49:
C45:
C44:
Cjp:
C50:
C49:
C45:
C44:
Cjp:
2
1
1
2
1
13
2
1
3
1
3
14
C50:
C49:
C45:
C44:
Cjp:
2
1
1
2
1
1
2
2
1
2
21
20
19 C50:
12
2
1
3
1
3
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C49:
C45:
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Cjp:
2
1
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23
C50:
C49:
C45:
C44:
Cjp:
16
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2
1
2
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C49:
C45:
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1
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3
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Cjp: 2
2
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1
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18
C50:
C49:
C45:
C44:
Cjp:
1
1
2
2
3
1
2
2
1
2
凝血因子Ⅷ(F8)基因
的主要遗传缺陷
 点突变(point
mutation)
 缺失(deletion)
 倒位(invertion)：发生于第22号内含子，
可在40%-50%重型HA中检测到
间接诊断的不确定性




遗传标记所带的信息性有限
新突变
基因重组
家系成员不完整
三、基因检测在多基因
病中的应用
多基因病具一定的遗传因素，家庭发
病率高于人群发病率，但是疾病的产生都
以一定的环境条件为诱因，遗传因素在其
中所起作用程度各异。
多基因病中的遗传因素是若干个易
感基因微小作用的累加，某一易感基因结
构的变化不足以导致疾病的产生。
人类基因组多态性是多基因病基因诊
断的基础，易感基因多态性的检测能帮助
我们理解多基因病发生的机制，有助于对
疾病的诊断和分类。
高血压候选基因多态性分析
在EH中的应用前景

临床分型

靶器官损伤研究

个体化治疗
基因多态性与盐敏感性高血压
-内收素
上皮钠通道
心钠素
SA
………
血管紧张素转换酶
血管紧张素原
2肾上腺素能受体
G蛋白亚单位3
基因多态性与高血压靶器官损伤
脑卒中
载脂蛋白E
-纤维蛋白原
血管紧张素原
血管紧张素II的1型受体
内皮型一氧化氮合酶
心钠素
冠心病
副氧酶
凝血因子V
凝血因子VII
载脂蛋白B
ACE基因多态性与高血压靶器官损伤
疾病
冠心病
心肌梗死
脑卒中
高血压肾病
糖尿病肾病
研究报告数
30
15
5
19
11
I D
+
+
+
+
+
11
12
22
10
40
%
%
%
%
%
DD
+
+
+
+
+
32
39
94
53
56
%
%
%
%
%
* 与II型相比，DD型和ID型发生上述疾病的危险性增高程度
(ACE基因I/D多态性研究49959例的荟萃分析）
ACE基因多态性：16号内含子有一Alu重复序列，为插入/缺失多态性，
构成II、ID、DD三种基因型
基因多态性检测与个体化治疗
人类基因组计划已经完成，功能基因
组研究正在实施。
有朝一日，临床医师能根据病人易
感基因的多态性设计有效的、个体化的
治疗方案，以达到最佳治疗效果。
ATG基因多态性研究
目的：观察ATG基因分型与限钠盐摄入及减轻体重后的
血压变化和高血压发病率间的关系
对象：1509例
基因分析：ATG基因G-A多态性
结果：三年后高血压发生率（%）
对照组
AA型
GG型
1998;32:393-401
45
32
限盐组
28
41
减轻体重组
25
32
Hunt SC,et al: Hypertension,
基因多态性分析指导抗高血压药物
的选择
药物种类
利尿剂
ACE抑制剂
-受体阻滞剂
基因
-内收素
ACE、AT1
G蛋白（Gs)
四、肿瘤相关基因检测
在肿瘤病情监测中的应用
肿瘤是由于遗传物质（肿瘤相关基因）发
生突变而导致的疾病。肿瘤相关基因的突变只
是增加了个体对肿瘤的易感性而并不一定马上
产生肿瘤，肿瘤的发生是一个多因素、多步骤
打击的过程。
实时定量RT-PCR技术
在急性早幼粒细胞白血病中的应用
PML-RAR融合基因是
APL特异的分子标志

初发APL的PML-RAR融合基因的拷贝数均大于
1000。
经全反式维甲酸、ATRA +化疗、三氧化二砷
治疗获得缓解后，其PML-RAR融合基因的拷
贝数明显降低，并随着巩固治疗的进行而进一
步降低。


长期无病生存的患者的PML-RAR融合基因
的拷贝数均长期低于200

一旦患者的检测值高于该值，则强烈提示
复发的可能
APL完全缓解和复发时
PML-RAR融合基因的检测
复发
CEA基因的定量检测
在监测胃肠癌微转移中的应用
CEA基因在消化系统上皮腺癌，尤
其是直结肠癌和胃癌中高表达，而在正
常成人体内极少表达。
正常人外周血CEA基因表达情况
在肿瘤发生血道转移时，外周血中
有少量肿瘤细胞残留。在肿瘤细胞内可
检测到CEA基因的转录本。
胃肠癌组织中CEA基因的表达
胃肠癌患者外周血中CEA基因的表达

用灵敏、特异的荧光定量PCR技术检测
到这些肿瘤细胞中CEA基因的转录本，
是发现肿瘤早期转移的关键。