Transcript 肿瘤诊断和预后生物标志物 的研究进展 曹志成 院士 香港伊利沙伯医院

肿瘤诊断和预后生物标志物
的研究进展
曹志成 院士
香港伊利沙伯医院
2010年5月22日
Dual-specificity phosphatase 6 (DUSP6),
monocyte-to-macrophage differentiation associated protein (MMD),
signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1),
v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 3 (ERBB3),
lymphocyte-specific protein tyrosine kinase (LCK).
结论
五个基因指纹与非小细胞肺癌的无复发生存期和总生存期密切相关
根据五个基因指纹RT-PCR检测的不同结果，用Kaplan-Meier法分
析非小细胞肺癌患者的生存时间
Overall survival and relapse-free survival are shown for the 101 patients with
NSCLC (Panel A and Panel B, respectively) and for the 59 patients with stage I or
II disease (Panel C and Panel D, respectively). Overall survival is also shown for
the independent cohort of 60 patients (Panel E), for the 42 patients in this cohort
who had stage I or II disease (Panel F), and for the 86 patients described in an
independent set of published NSCLC microarray data10 (Panel G).
70 个预后相关基因表达谱
监督分析
肿瘤标本
70 个与预后显著相关的基因
van´t Veer et al., Nature 415, p. 530-536, 2002
设定为 10%假阴性
灵敏性 91 %, 特异性 73%
70 个预后相关基因
与肿瘤细胞生物学各个方面均有关
细胞增殖
血管新生
进入血管内、存活、 外渗
与细胞外基质的黏附
局部侵犯
与细胞外基质的黏附
细胞增殖
血管新生
未知功能的基因 (25)
独立验证：
307 例
Buyse et al, JNCI 2006;98:1183-92
微阵列试验具有高度的可重复性 (99%)
可重复性：重复试验
Glas et al, BMC Genomics 2007
良好预后组患者没有一例复发
MammaPrint:
良好预后组
(n = 23)
不良预后组
(n = 144)
Straver M et al,
Brit Cancer Res Treat 2009
Oncotype Dx的临床研究发展
● 发展高通量、实时RT-PCR技术来定量检测固定肿瘤标本中的基因表达
● 筛选出250个候选基因
已发表的文献
基因组数据库
基于DNA 阵列的实验
● 在来自3个临床研究、共447例患者中检测250个候选基因与复发风险的
相关性
16 个肿瘤相关基因 + 5 个参考基因 → Oncotype DX (复发风险指数)
Paik et al. NEJM. 2004.
如何评估乳腺癌患者的复发风险
传统病理学标准
肿瘤大小
基因组学时代的
新工具…
淋巴结状态
Oncotype DX
年龄
肿瘤分期
ER/PR
HER2
辅助化疗
基于电脑模式
Oncotype DX 21-基因复发指数
16个肿瘤基因和5个参考基因构成了Oncotype DX基因组，根据这
些基因的表达情况计算复发指数：
细胞增殖
Ki-67
STK15
Survivin
Cyclin B1
MYBL2
参考基因
Beta-actin
GAPDH
RPLPO
GUS
TFRC
雌激素
ER
PR
Bcl2
SCUBE2
RS =
BAG1
GSTM1
细胞侵润
Stromelysin 3
Cathepsin L2
CD68
HER2
GRB7
HER2
+ 0.47 x HER2 指数
- 0.34 x ER 指数
+ 1.04 x 细胞增殖指数
+ 0.10 x 细胞侵润指数
+ 0.05 x CD68
- 0.08 x GSTM1
- 0.07 x BAG1
Paik et al, NEJM 2004;351:2817-26
复发指数
低危组
RS < 18
复发风险 = 6.8%
C.I. = 4.0% - 9.6%
40
十年内远处复发转移发生率
35
中危组
RS 18 - 31
复发风险 = 14.3%
C.I. = 8.3% - 20.3%
高危组
RS  31
复发风险 = 30.5%
C.I. = 23.6% - 37.4%
30
25
20
15
复发指数
95% C.I.
10
5
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
复发指数
Paik et al, NEJM 2004;351:2817-26
Oncotype DX
低复发指数（RS）与最小化疗获益相关；
高复发指数（RS）与较好的化疗获益相关。
Oncotype DX复发指数提供了简洁、定量的个体预后信
息，是具有统计学意义、与患者年龄、肿瘤大小和肿
瘤分期分级无关的独立指标。
2006年诺贝尔生理学和医学奖
Andrew Z. Fire
Craig C. Mello
Cho WC. MicroRNAs in cancer - from research to therapy.
Biochim Biophys Acta - Rev Cancer 2010;1805:209-17
C. elegans
非编码-RNA：曾经被认为是毫无意义的「多余物」
RNA 转录
编码蛋白的mRNA
非编码 RNA 转录
调节RNA
miRNA
siRNA
piRNA
反义 RNA
•
•
•
•
转录/染色体结构调节因子
转录调节因子
蛋白功能调节因子
RNA/蛋白定位调节因子
管家 RNAs
核仁小RNAs
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
非编码-RNA在复杂的基因组学中起重要作用
tRNA
rRNA
snRNA
tmRNA
Rnase P RNA
vRNAs
gRNAs
MRP RNA
SRP RNAs
端粒酶RNA
肺癌诊断和预后的独特microRNA表达谱
• miRNAs是非编码的小RNA，在调节mRNA的反
应和降解中发挥重要作用
• 先天和后天的转变可能改变miRNA的表达，
从而引起肿瘤靶基因的异常表达
• Yanaihara et al, Cancer Cell 2006:
采用miRNA微阵列法对104对原发性
肺癌和相应非肿瘤肺部组织的miRNA表达谱做
分析
-
43个miRNAs显示出了统计学差异
肺癌诊断和预后的独特microRNA表达谱
• 一项单变量Cox比例风险回归模型全局排列检
验显示：miRNA hsa-miR-155 和 hsa-let-7a-2
的表达与腺癌患者的结局相关
• hsa-miR-155高表达或hsa-let-7a-2低表达
的肺腺癌患者预后较差
Yanaihara N, et al. Unique microRNA molecular profiles in lung cancer diagnosis and prognosis. Cancer Cell 2006, 9:189-198.
microRNAs在肿瘤诊断中的作用
● 应用原位RT-PCR技术，发现miR-221、miR-301和miR-376a
只在胰腺癌细胞中异常表达，但在细胞基质、正常腺泡或
导管中无表达。
● 异常miRNA表达为胰腺肿瘤形成机制提供新的线索，可能
是胰腺癌诊断的生物标志物。
Lee et al. Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer. Int J Cancer
2007;120:1046-1054.
Cho WC. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for
therapy. Int J Biochem Cell Biol 2010.
Cho WC. MicroRNAs in cancer - from research to therapy. Biochim Biophys Acta - Rev Cancer
2010;1805(2):209-217.
microRNAs在肿瘤预后中的角色
● let-7 miRNA在肺癌中往往表达下降，而let-7
miRNA表达下调与患者术后生存期较短明显相关。
● 过表达的 let-7 miRNA 在A549肺腺癌细胞中能抑制
体外肺癌细胞的生长。
Takamizawa et al. Reduced expression of the let-7 microRNAs in human
lung cancers in association with shortened postoperative survival. Cancer Res
2004;64:3753-3756.
microRNAs在肿瘤预后中的角色
采用miRNA微阵列，比较胰腺癌和正常胰腺组织以及
慢性胰腺炎中miRNA的表达差异：
●miRNAs表达的差别可以用以鉴别胰腺癌、正常胰腺
组织或/和慢性胰腺炎。
●miR-196a-2的高表达能预测患者预后，高表达者往
往活不过24个月。
Bloomston et al. MicroRNA expression patterns to differentiate pancreatic
adenocarcinoma from normal pancreas and chronic pancreatitis. JAMA
2007;297:1901-1908.
microRNAs
肿瘤形成
miR-9
神经母细胞瘤
miR-10b
乳腺癌
miR-15, miR-15a
白血病，垂体瘤
miR-16, miR-16-1
白血病，垂体瘤
miR-17-5p, miR-17-92
肺癌，淋巴瘤
miR-20a
淋巴瘤，肺癌
miR-21
乳腺癌，胆管癌，头颈肿瘤，白血病
miR-29, miR-29b
白血病，胆管癌
miR-31
结直肠癌
miR-34a
胰腺癌
miR-96
结直肠癌
miR-98
头颈部肿瘤
miR-103
胰腺癌
miR-107
白血病，胰腺癌
miR-125a, miR-125b
神经母细胞瘤，乳腺癌
miR-128
胶质瘤
miR-133b
结直肠癌
miR-135b
结直肠癌
miR-143
结肠癌
miR-145
乳腺癌，结直肠癌
miR-146
甲状腺癌
诊断
预后
胰腺癌
神经母细胞瘤
microRNAs
肿瘤形成
miR-155, has-miR-155
乳腺癌，白血病，胰腺癌
miR-181, imR-181a, imR-181b, imR-181c
白血病，胶质瘤，甲状腺癌
miR-183
结直肠癌
miR-184
神经母细胞瘤
miR-193
胃癌
诊断
肺癌
胰腺癌
miR-196a-2
miR-221
胶质瘤，甲状腺癌
miR-222
甲状腺癌
miR-223
白血病
胰腺癌
miR-301
胰腺癌
miR-376
胰腺癌
let-7, let-7a, let-7a-1, has-let-7a-2, let-7a-3
预后
肺癌，结肠癌
Cho WC. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy.
Int J Biochem Cell Biol 2010.
Cho WC. OncomiRs: the discovery and progress of microRNAs in cancers. Mol Cancer 2007;6:60.
肺癌
基因以外的因素
相同的基因组
不同的蛋白组
在分子水平上描述蛋白和DNA的特性
是理清基因功能的关键
功能性基因组学
t-RNA
t-RNA
mRNA
核糖体
t-RNA
(....)
DNA
蛋白
t-RNA
基因组学
翻译后修饰
X
(....)
X
蛋白组学
具有活性的蛋白
CHO
PO4
蛋白组学：引领21世纪生物科学
● 蛋白组学代表着对有机生物、
器官和细胞器中所有蛋白的特
性、分子量、结构和生物化疗、
细胞功能加以明确
● 同时了解这些特性在空间、时
间或不同生理状态下的变化
Cho WC. Proteomics - leading biological science in the 21st century. Science J
2004;56(5):14-17.
Cho and Cheng. Oncoproteomics: current trends and future perspectives. Expert
Rev Proteomics 2007;4(3):401-410.
传统方法 vs 高通量技术
蛋白组学的出现和应用
DNA
static genome
Transcriptional control
RNA
message variable: transcriptome
Translational control
Protein
product variable: proteome
Post-translational modification
Genome Era
Post-genome Era
Intrinsic factors:
physiological &
pathological
status, …
Sample
preparation
& processing
Cho and Cheng.
Oncoproteomics: current
trends and future
perspectives. Expert Rev
Proteomics 2007;4:401-10.
Extrinsic factors:
environment, pathogens, drug, …
Functional protein
expressed
Automation sample application
ESI-TOF MS
MALDI-TOF MS
Low-throughput
High-throughput
Peptide ions
(MS)
Peptide fragment ions
(MS-MS)
Protein chip,
e.g. SELDITOF MS
ESI: 电喷雾电离
MALDI: 基质辅助激光解吸电离
Bioinformatics
Experimental or
clinical results
Database interrogation
Protein identification
Validation and application
SELDI: 表面增强激光解吸离子化
TOF: 飞行时间
表面增强激光解吸离子化 (SELDI)
化学表面 – 蛋白表达谱:
疏水性
阳离子
阴离子
金属离子亲和层析
常态
H50 – C9 链
WCX2 - 羧酸盐
SAX2 –
金属螯合物
NP20 –
4O 铵盐
(Cu, Ni, Zn, Ga, Mn, …)
SiO2
H4 – C16 链
生物表面 – 蛋白相互作用检测:
PS-10 or PS-20
蛋白耦合
抗体 – 抗原
受体 – 配体
DNA – 蛋白
Cho WC. Proteinchip. In: Encyclopedia of Cancer, 2nd Ed. Springer 2009.
HTP 自动化
Biomek 2000 (Beckman)
高度可重复的采样程序化流程
蛋白芯片系统 PCS4000
Aquarius (Tecan)
SELDI-TOF-MS技术
样本分溜、芯片结合和数据获得
Serum / lysate sample
Disease samples
Control samples
vs
Cho WC, et al. Clin Cancer Res
2004;10:43-52.
+ Urea / CHAPS / TrisHCl pH 9
Sample anion exchange
pre-fractionation
Strong anion exchange resin
Q HyperD resin
Organic
eluant
Fractionation
pH 7
eluant
Cho WC, et al. Dis Markers
2006;22(3):153-66.
pH 5
eluant
pH 4
eluant
Chip binding
Cho WC, et al. J Cell Biochem
2006;99(1):256-68.
pH 9/
flow through
pH 3
eluant
Weak cation exchange (WCX2 / CM10)
100 mM NaAc, pH 4
Cu(II) (IMAC3 / IMAC30)
100 mM phosphate, 0.5 M NaCl, pH 7
T O FM S
D etector
L a ser
Data acquisition
Cho WC. Chin J Biotech
2006;22(6):871-876.
Protein Biology System (PBS) IIc SELDI-TOF mass spectrometer
Cho WC, et al. J Ethnopharmacol
2006;108(2):272-9.
Cho WC, et al. Clin Chem
2007;53(2):241-250.
生物标志物的发现
● 通过比较蛋白图谱可
以容易地找出标志物
● SELDI 技术比2D
PAGE速度快，可重
复性高
(Normal)
(Cancer)
● 这一技术用以发现多
种疾病的生物标志物，
如卵巢癌、乳腺癌、
前列腺和膀胱癌
Cho WC. Contribution of oncoproteomics to cancer biomarker
discovery. Mol Cancer 2007;6:25.
蛋白质作为生物标志物
蛋白成分可能与机体疾病进展相关，因而可研发成
为诊断标志物。
• 大多数情况下，相对于遗传基因，蛋白与实际
疾病进程关系更为密切
• 蛋白是细胞功能的最终调节因子
• 大多肿瘤标志物都是蛋白质
• 绝大多数的药物靶点均为蛋白质
Cho WC. Cancer biomarkers. In: Methods of Cancer Diagnosis, Therapy and Prognosis.
New York: Springer, 5 Jan 2010.
鼻咽癌 (Nasopharyngeal carcinoma)
正常的鼻咽组织
•香港人群中第七大常见肿瘤
•鼻咽癌临床诊疗中的难题：
1. 诊断时往往已是晚期 (3/4期)
2. 复发常见 (其中>50%是CR的患者)
鼻咽肿瘤
肿瘤位于右侧咽鼓管垫
Cho WC. Most common cancers in Asia-Pacific region: nasopharyngeal carcinoma.
In: Cancer report of Asian-Pacific region 2010:284-289.
蛋白质芯片的应用：
鼻咽癌肿瘤生物标志物的发现
● 149 例鼻咽癌患者的血样
(未分化型鼻咽癌或分化差的鳞癌）
● 35 例正常人血样
10000
11000
12000
13000
14000
15000
GC10 A3 (P1F6)
GC10 A5 (P1F6)
GC17 A3 (P1F6)
GC29 A3 (P1F6)
GC6 A1 (P1F6)
GC1 A7 (P2F6)
GC25 A5 (P2F6)
GC37 A7 (P2F6)
GC3 A7 (P3F6)
GC24 A1 (P3F6)
GC23 BT1 (P3F6)
GC20 BT1 (P3F6)
GC11 A4 (P3F6)
GC11 A9 (P3F6)
GC9 BT1 (P4F6)
GC13 BT1 (P5F6)
GC8 A3 (P5F6)
GC15 BT1 (P5F6)
GC14 BT1 (P5F6)
GC21 A3 (P6F6)
GC18 A3 (P6F6)
GC12 A4 (P6F6)
GC26 A6 (P7F6)
GC22 BT1 (P7F6)
GC27 A3 (P8F6)
GC27 A10 (P8F6)
GC28 A7 (P8F6)
GC36 A8 (P9F6)
GC35 A3 (P9F6)
GC32 BT1 (P10F6)
GC31 A13 (P10F6)
GC34 A3 (P11V6)
PS165 A8 (P3F6)
PS165 A15 (P3F6)
PS178 A8 (P3F6)
PS178 A15 (P3F6)
PS192 A8 (P4F6)
PS192 A15 (P4F6)
PS205 A8 (P4F6)
PS205 A15 (P4F6)
PS213 A8 (P2F6)
PS213 A15(P2F6)
PS217 A8 (P5F6)
PS217 A15 (P5F6)
PS223 A8 (P6F6)
PS223 A15 (P6F6)
PS250 A8 (P4F6)
PS250 A15 (P4F6)
PS253 A8 (P2F6)
PS253 A15 (P2F6)
PS260 A9 (P4F6)
PS260 A16 (P4F6)
PS279 A8 (P5F6)
PS279 A15 (P5F6)
10000
11000
12000
13000
14000
15000
质谱数据采集进行蛋白识别鉴定
1021
1386
854
1524
标本
胰蛋白酶消化
2-D 凝胶纯化
识别鉴定
1600
600
质谱分析
(肽图信息)
数据库
寻找蛋白
MS/MS法识别标志物
+TOF Product (2176.9): 70 MCA scans from spot B 2177.wiff, Smoothed
34/37离子与
血清淀粉样A配对
931.4332
484
Max. 484.0 counts.
450
400
I n t e n s it y , c o u n t s
350
300
250
200
914.4099
418.2148
1317.6205
150
100
617.2782
315.1216
497.1998
461.2252
50
0
200
400
600
861.3582
661.2993
800
2178.9799
896.3904
1000
1247.5223
1200
m/z, amu
1400
1600
1800
2000
2200
随访生物标志物11,695 Da水平（3例鼻咽癌复发，11例缓解）
Cho WC et al. Clin Cancer Res 2004;10:43-52
血清生物标志物在鼻咽癌复发患者化疗前后的改变
EP: Biomarker: 7,659 Da
% Diff = 206.8%
increased
4
p = 4.8E-6
decreased
1.727
+/- 0.781
GC: Biomarker: 7,765 Da
Mean +/- SD
0.835
+/- 0.753
3
% Diff = 194.4%
increased
6
p = 6.1E-6
decreased
Mean +/- SD
2.382
+/- 1.128
5
4
2
1.225
+/- 0.734
3
1
2
0
1
-1
0
Before
After
Chemotherapy (N=35)
EP方案：依托泊苷和顺铂
Before
After
Chemotherapy (N=29)
GC方案：吉西他滨和顺铂
Cho WC et al. ProteinChip array profiling for identification of disease- and
chemotherapy-associated biomarkers of nasopharyngeal carcinoma. Clin Chem 2007;53:241-50.
卵巢癌的基本数据
● 患病率 40/100,000 (每2500人里有一个)
● 每年新诊断患者23,000人
● 每年死亡人数14,000人
● 五年总生存率20-30%
● 75%患者初诊时已是晚期 (III/IV期)
● I/IIa期治愈率90%
● 因此，早期发现对提高患者总生存期至关重要
发现生物标志物的研究设计
I/II期 (20)
地区 1
(100)
良性 (50)
多因素模型
获得
发现 1
对照组 (30)
交叉
比较
I/II期 (35)
地区 2
(176)
候选
标志物
III/IV期 (2)
发现 2
多因素
模型
良性 (90)
对照组 (49)
I/II期 (35)
地区 3
(164)
III/IV期 (103)
良性 (26)
独立
确认
对照组 63
蛋白 ID
Ca (41)
Other Ca 1 (20)
地区 5
(142)
Other Ca 2 (20)
免疫化验
独立确认
结果:
• 描述性数据
• 两组间 t-检验
• 表现
• ROC曲线分析
ROC curve, area=0.94327, std = 0.094973, alpha= 2.791, beta= 0.47154
1
0.9
Other Ca 3 (20)
0.8
0.7
0.6
Sensitivity
地区 4
(63)
0.5
0.4
对照组 (41)
0.3
0.2
0.1
0
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
1 - Specificity
0.7
0.8
0.9
1
总体表现
● 采用蛋白质芯片系统发现第I/II期卵巢癌的生物标志物
● 五个机构共503个样本
● 严密的交叉确认和独立确认研究设计
● 固定特异性 (97%)
● 三个标志物组 (载脂蛋白 A1、间α胰蛋白酶抑制物 IV和甲状腺素运
载蛋白)：敏感性74%
● CA125：敏感性65%
● 固定敏感性 (83%)
● 三个标志物组：特异性94%
● CA125：特异性54%
多标志物研究的开拓
Peak A
Criteria
Peak B
Criteria
肿瘤
正常
Peak C
Criteria
肿瘤
正常
敏感性
确认各个生物标志物的身份,
与相应的疾病生物学相联系
“真阳性”
特异性
“真阴性”
单个标志物
65%
35%
生物标志物模式
>90%
>90%
FDA于2009年9月11日批准了OVA1 试验
● 将生物标志物的发现从实验室开拓到临床应用中
● 基于一项前瞻性双盲的临床研究，纳入27个机构共
516例患者
● 269 例患者只根据手术前信息进行评估
● 247 例患者根据手术前信息和OVA1结果进行评估
● OVA1 检测能识别出额外的潜在恶性肿瘤患者
● 有助于指导手术决策
OVA1
● 首个FDA获准的基于蛋白水平的体外诊断多因素指
数检测
● 首个FDA获准的用于卵巢癌术前和术后的预后检测
● 在血标本中检测 5 个蛋白
● SELDI技术筛选出β2-微球蛋白、转铁蛋白、载脂蛋白
A1、 甲状腺素运载蛋白
● CA125
● 预测良恶性可能
Scientific American
Cho WC. Proteomic approaches to cancer target identification. Drug Discov Today: Ther Strategies 2007;4(4):245-250.
肿瘤治疗靶点
1
2
5
4
细胞膜
6
生长因子
信号通路
3
7
微管动力学
7
12
RNA 转录
7
8
1.
2.
3.
4.
生长因子
生长因子受体
连接蛋白
停靠蛋白/结合蛋白
5. 鸟嘌呤核苷酸交换因子
细胞核膜
9
11
6.
7.
8.
9.
10.
磷酸酶和磷酸酯酶
信号激酶
核糖体
转录因子
组蛋白
11. DNA
12. 微管
10
基因转录
细胞生长
运动性
DNA 复制和修复
细胞存活
细胞增殖
血管新生
结肠癌中KRAS突变决定了对EGFR治疗的疗效
Mutant KRAS
+EGFR
-EGFR
Wild type KRAS
+EGFR
-EGFR
51
Amado et al. J Clin Oncol; 26:1626-1634 2008
结肠癌中KRAS突变决定了对EGFR治疗的疗效
KRAS突变率: 32%
PIK3CA 突变率: 13%
BRAF突变率: 10%
Mutant KRAS
+EGFR
-EGFR
Wild type KRAS
+EGFR
-EGFR
52
Amado et al. J Clin Oncol 2008;26:1626-34
传统肿瘤治疗:
Dx
Rx
个体化肿瘤治疗:
→
Rx
治疗:
诊断
分期、分级、
免疫组织化学检验
治疗
化疗
信号通路
靶向治疗
结肠癌中PI3K信号途径的159个基因指纹
信号通路和网络分析
Cho WC. Proteomics technologies and challenges. Genomics
Proteomics Bioinformatics 2007;5(2):77-85.
Cho WC (ed). An omics perspective on cancer research. New York: Springer 2010.
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