Transcript 第十二章基因操作、定位与克隆

第十二章
基因操作、定位与克隆
第一节 基因操作
一、重组DNA技术(recombinant DNA technique)
1
2015年4月8日
（一）重组DNA两类重要的酶
1、限制性内切核酸酶 Restriction enzymes
限制性内切核酸酶又称限制酶。限制酶是从核酸分子内部切割 (水解断裂)磷
酸二酯键生成DNA片段的一种内切酶。
2
AA G C T T
T T C G AA
Hind III
from
Haemophilus influenz
命名：属名、种名、菌株名
3
•HaeⅢ酶的识别序列：
5'
GG
CC
3'
3'
CC
GG
5'
•酶切位点在GC之间，在对称轴上，产生的片
段为平末端。
5'
GG
CC
3'
3'
CC
GG
5'
4
•Pst I酶的识别的序列：
5'
CTGCAG
3'
3'
GACGTC
5'
•酶切位点在AG之间，不在对称轴上，产生
的片段则为粘性末端。
5'
CTGCA
3'
G
G
3'
ACGTC
5'
5
Sma I
CCCGGG
GGGCCC
5’----CCC
GGG---3’
3’----GGG
CCC----5’
平端
6
EcoR I
GAATTC
CTTAAG
5’----G
AATTC----3’
3’----CTTAA
G----5’
粘性末端
7
8
2、DNA连接酶
DNA连接酶
---粘性末端
T4DNA连接酶
---平末端
9
（二）重组DNA克隆的载体及选择
特点:
1.
2.
3.
4.
分子量小，结合DNA，可进入宿主细胞并扩增。
酶切位点的特异性
具有筛选标记
具有复制起始点（克隆载体）
或启动子（表达载体）
种类:
质粒; 噬菌体; 粘粒;
P1人工染色体;
细菌人工染色体 ; 酵母人工染色体
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DNA克隆的载体
短片段载体
（ <50kb ）
质粒（plasmid）
噬菌体（lambda phage）
粘粒（cosmid）
0~10kb
0~10kb
33~44kb
P1人工染色体（PAC）----- P1和F因子，100kb
细菌人工染色体
大片段载体
（bacterial artificial chromosome，BAC）
（大分子
-------数十kb~300kb
DNA克隆） 酵母人工染色体
（yeast artificial chromosome，YAC）
-------1~2Mb
11
• 1、质粒(plasmid)—存在于细菌染色体外的小
型环状双链DNA分子
– 理想的质粒
拷贝数多;
两三个遗传筛选标志，如抗药性基因：
抗氨苄青霉素基因(ampr) 、抗四环素基因
(terr)；β-半乳糖苷酶基因(lac Z) ,
多个限制酶的单一切点，即多克隆位点
(multiple cloning sites,MCS)，多连接子,
复制起点，Ori
12
EcoR I, Sac I, Kpn I, Sma I, BamH I, Xba I, Sal I, Pst I, Sph I, Hind III
MCS多连接子
Lac Z
pUC19
(2.69kb)
Ori
Ampr
13
质粒载体
Plasmid Polylinkers and Marker Genes for Blue-White
screening
14
15
2、λ噬菌体(λphage)和粘粒(cosmid)：
• 粘性质粒(cosmid)：
• 有粘端位点（COS）的质粒
• 将质粒和λ噬菌体改建的载体
• λDNA的 cos区+质粒，双链环状DNA，
克隆容量：40~50kb
• 用于高等生物的基因文库
16
17
粘粒
ampr
BamHI
cos
ampr
cos
ori
Cosmid vector
37~52kb
Cosmid vector
~5kb
insert
BamHI
BamHI
ori
cos
insert
cos
酵母人工染色体--YACs
3、大片段DNA克隆载体
SnaB I
CEN4
ARS
SUP4
pYAC3
11.4kb
TRP1
TEL
URA3
TEL
insert
TEL- telomeric DNA
CEN4- centromere sequence
ARS- 酵母复制起点
TRP1- 与 trp mutant 互补
URA3- 选择基因
SUP4- red-white color test
（三）
目的基因的获得和检测
1、基因文库(gene library)
DNA文库
是用重组DNA技术和DNA克隆方法人工建立的。
包含一个生物体或人的所有DNA序列克隆的集
团。
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（1） 基因组文库(genomic DNA library)
血细胞
DNA
Sau酶切消化
与载体重组
转化
选择性增殖
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（2）cDNA文库（ cDNA library ）：
mRNA 逆转录成cDNA，然后克隆到质
粒或噬菌体重组而形成的含有全部cDNA的
集团。
(3)染色体特异的基因文库
（ chromosome specific library ）
亚基因组探针
流式细胞仪、染色体显微切割技术
特异区带重组成黏粒或YAC、BAC文库
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2、基因文库的筛查—杂交分离目的基因
（1）探针的种类
DNA探针
RNA探针
简并探针
人工合成
寡核苷酸探针
单一EST探针
cDNA
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(2)探针的标记
放射性同位素标记：
缺口平移法
随机引物法
(nick translation) (random-primed labeling)
32P、35S、3H
放射自显影
非同位素标记：Bio-11-dUTP(生物素)
Dig-11-dUTP(地高辛)
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二、分子杂交
分子杂交：应用特异探针在复杂的靶DNA
中，根据碱基的互补性来鉴定与其同源的
DNA分子片段。
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• 分子杂交技术方法
（一）点印迹
• 1、斑点杂交(dot and slot hybridization)
• 2、等位基因特异性寡核苷酸杂交
(allele specific oligonucleotide, ASO)
（二）Southern印迹法(Southern blot)
（三）Northern印迹法(Northern blot)
（四）Western印迹法(Western blot)
ASO探针斑点杂交鉴定镰型细胞贫血的突变
βA βA
斑点印迹
βA βs
βs βs
杂交
βA -ASO 5′
TG ACT CCT GAG GAG AAG TC
3′
合成ASO
Glu
βA5′GTC CAC CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT GCC 3′
Val
βs5′GTC CAC CTG ACT CCT GTG GAG AAG TCT GCC 3′
合成ASO
βs -ASO 5′
TG ACT CCT GTG GAG AAG TC
3′
杂交
斑点印迹
βA βA
βA βs
βs βs
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含有EB染料的
琼脂糖凝胶
基因组DNA
基因组DNA
DNA限制片段
标准分子量DNA
重 物
吸引滤纸
玻璃板
凝胶
高盐缓冲液
硝酸纤维素膜
与探针杂交的
基因DNA片段
Southern 杂交法
X底片
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镰型细胞贫血突变MstII片段产生的特异性RFLP
•
Mst II识别的序列为CC↑TNAGG
1.2kb
βA5′3′-
CCTTAGG
GGAATCC
0.2kb
CCT-GAG-G
GGA-CTC-C
CCTTAGG - 3′
GGAATCC - 5′
突变
βs5′3′-
CCTTAGG
GGAATCC
CCT-GTG-G
GGA-CAC-C
CCTTAGG - 3′
GGAATCC - 5′
酶切、电泳
1.4kb(βs 特异）
1.2kb(βA特异）
βA βA
βA βs
βs βs
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三、聚合酶链反应
PCR
30
PCR的原理
31
1、
引物
2、
三磷酸
核苷
3、
缓冲体
系：
Mg2＋
Taq酶
32
33
34
35
第二节
基因定位
• 基因定位：(gene mapping)
利用一定的方法将一个基因确定
到染色体上的实际位置。
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一、 连锁分析在基因定位中的
作用
（一）连锁分析(linkage analysis)
• 是最早的传统基因定位方法，又与现代
生物技术结合发展为基因作图的基本方
法。基因在染色体上呈直线排列，不同
的基因在同一染色体上相互连锁。利用
这种连锁关系，分析被定位的基因与另
一基因在染色体上相互位置而定位。
41
连锁分析
42
Recomnbination fraction
重组率
1%
遗传图距 1 cM
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（二）遗传标记
1、第一代遗传标记—限制性酶切片段长度多
态性(Restriction Fragment Length
Polymorphism, RFLP)
2、第二代遗传标记—微卫星DNA
(Micro-satellite DNA)
数目变异的串联重复
（variable number repeat,VNTR)
短串联重复序列
(short tandem repeat,STR)
3、第三代遗传标记—单核苷酸多态性(SNP)
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连锁分析——
50/60
100
100/50
100/60
100/40
50
60
60/40
50/40
40
100/40
50/60
100/40
1、标记位点必须与致病
基因连锁。
2、标记位点必须具有
多态性。
单基因分析、多基因分析
父
母
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连锁分析——
46
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二、 体细胞杂交与基因定位
（一）体细胞杂交在基因定位中的作用
1、细胞融合过程
细胞膜融合
细胞质融合 → 异核细胞
细胞核融合 → 合核细胞 → 杂种细胞
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2、杂种细胞的染色体丢失
• 杂种细胞在增殖传代过程中，出现保留一
方染色体、另一方的染色体则逐渐丢失的
现象。
• 结果产生保存有或多或少人染色体的各种
稳定的杂种细胞系。
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3、杂种细胞的选择和分离
• 细胞融合时，培养中有大量末融合的双亲细
胞，这就需要进行选择分离纯化所需要的杂
种细胞。为此需要制造一种只让杂种细胞生
存而双亲细胞死亡的环境，利用杂种细胞和
双亲细胞对生长条件要求和代谢的差异来进
行选择。
• 基本方法是依据基因互补的原理，利用二者
对某种药物耐受力的不同，组成一种特异的
培养基，即有效的选择系统，把需要的杂种
细胞从双亲细胞中选择出来。
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• 最常用的就是HAT(选择系统）
次黄嘌呤(Hypoxanthine)
氨基喋呤(Aminopterin )
胸腺嘧啶(Thymine )
• HAT选择系统是从一种人突变细胞株 (其中含有
缺乏HPRT酶的遗传标记)建立了HPRT-系统，选择
一种缺乏TK酶的小鼠细胞株的TK-系统，并将二者
结合起来发展为HAT选择系统。在正常细胞生物
合成途径中，因有氨基蝶呤而阻断DNA合成。两
种亲本细胞在HAT培养基中不能生存。
次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 （ HPRT）
胸苷激酶(TK)
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• 将HPRT-人细胞和TK-小鼠细胞进行融合，培养于HAT
培养基中。
•
杂种细胞含有TK酶(人)和HPRT酶(小鼠)，就可
利用次黄嘌呤转变成次黄核苷酸，鸟嘌呤转变成鸟
核苷酸，胸腺嘧啶转变为胸腺嘧啶核苷酸；进而利
用这些外源核苷酸通过另一补救途径合成DNA。两种
亲本细胞在HAT培养基中不能生存，而杂种细胞却能
存活、繁殖被选择分离出来。
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4、利用杂种细胞进行基因定位
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微细胞融合 (microcell fusion):
• 1977年Frounier和Ruddle建立了含有单
个染色体的微细胞，再与啮齿类细胞融
合。
• 方法是在培养基中加入有丝分裂纺锤体
抑制剂，如细胞松弛素B，阻止其形成，
使有丝分裂停止，成为一个微核，经过
离心形成一个微细胞。
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（二）染色体结构畸变与基因定位
• 区域定位 (regional assignment)是依据染色体
结构畸变的特点，建立只含有特殊的部分人染
色体的杂种。
• 例如：易位杂种和缺失杂种，是由供体细胞只
含染色体的易位或缺失的片段与鼠细胞融合而
成的杂种细胞。它不含有正常染色体的同源片
段。利用这样的杂种才能用作亚染色体定位人
序列标签位点或生化标记。
• 某一蛋白质或酶在含有易位或缺失的染色体杂
种细胞中表达与否，就可将编码该蛋白或酶的
基因定位于染色体易位或缺失的区段。
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三、 原位杂交和荧光原位杂交
（一）原位杂交
• 原位杂交是利用放射性同位素（如32p）标
记的探针与玻片上中期染色体进行分子杂
交，将基因分别定位于染色体或具体区带，
是一种直接进行基因定位的方法。
• 首先制备中期染色体玻片标本，用甲酰胺
使DNA变性，再用适当放射性同位素（如
32p）标记的探针的进行杂交。然后进行放
射自显影。
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• 优点：
在已知探针情况下，可作特定DNA片段或
基因的区域定位。
• 缺点：
在末知基因时，不能进行。
放射标记易于出现高噪音背景，有时难以
区分真正信号和背景噪音。
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二、荧光原位杂交(FISH)
利用生物素或地高辛等非放射性物质
标记探针，并通过荧光素偶联的抗原-抗体
检测系统，在组织、细胞及染色体上对DNA
或RNA进行定性或定位分析。
标记物：
Bio-11-dUTP(生物素)
Dig-11-dUTP(地高辛)
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染色体FISH探针
整条染色体涂染探针
染色体重复序列探针
染色体专一位点探针
基本过程：
1、染色体标本制备
2、探针制备
3、杂交
4、显微观察（染色体分带）
60
61
染色体专一位点探针
62
荧光标记探针检测精子
63
四、 其他的重要方法
原位PCR
• 是原位杂交与PCR相结合对基因或特定DNA片
段进行定位或检出的方法，即在细胞中或组
织切片上对特异的寡核苷酸序列进行原位
PCR扩增。
• 间接法:先进行细胞内目的DNA基因原位扩增，
然后用标记的探针进行核酸分子原位杂交以
定位检测扩增的ＤＮＡ的技术，步骤相对较
多，需时长，但结果可靠。
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• 直接法:把同位素或非同位素(常用)标记的核
苷(如dig-dUTP及Biotin-dUTP)标记的底物或
引物5’未端连接标记物加入PCR反应液中，随
着扩增的进行，标记的核苷或引物直接掺入
到PCR产物中，而后放射自显影或用免疫组化、
荧光检测技术进行DNA定位或检测。
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第三节
基因克隆
• 基因克隆 (gene cloning)
把不同位点上的基因再用一定的方
法分离出来。
三种克隆策略:功能克隆、位置克隆、
候选克隆
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一、功能克隆（functional cloning）
先天性代谢病
血或尿的生化分析
某氨基酸过剩
蛋白酶缺陷
探针
基因
反转录
cDNA
合成
mRNA
蛋白质测序
筛选
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二、定位克隆（positional cloning）
基因产物（蛋白质）不明时，定位作图，克隆，功能基因
定位方法：连锁分析---相邻基因或遗传标记
染色体的结构异常---缺失、易位，
断点：定位、克隆
连锁分析
家系系谱
遗传标记
染色体定位
精细定位
染色体异常
突变
致病基因
转录子
候选DNA
筛查
YAC、BAC克隆片段
鉴定
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假肥大型肌营养不良（DMD）抗肌萎缩蛋白基因的克隆
XR，疲乏无力，行动困难，死于肌肉变性退行性并发症
用连锁分析和X—常染色体易位定位DMD基因
受累家系
RFLP连锁分析
Xp21
罕见女性患者， X—常染色体易位，断点Xp21.2
t(Xp21;21p)
13、14、15、21、22号短臂含有核糖体RNA基因
已知序列
克隆易位断点处的DAN序列
正常细胞克隆DMD基因
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用缺失定位DMD基因
男患儿
Xp21.2处微小缺失
Xp21
1986年Kunkel等人，
克隆出包含Xp21.2缺失 DNA片段----PERT87系列探针
证明DMD患儿存在Xp21.2处微小缺失
转录子鉴定法
PERT87探针Northern印迹证明
特异肌肉蛋白转录物16kbRNA
反转录
cDNA
钓出
DMD基因
最大人类基因，2300kb，X的1%，79个外显子
编码抗肌萎缩蛋白----影响横纹肌和心肌的结构与收缩
70
一名患有DMD、慢性肉芽肿及另外两种X连锁疾病男童
存在Xp21.2的微小缺失
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以PERT87区域的克隆为探针与
7名DMD患儿的DNA印迹杂交
RNA印迹杂交比较胎儿骨骼
肌细胞与非胎儿骨骼肌细胞
72
三、候选克隆（candidate cloning）--位置、表达、功能、同源性
模式生物基因
同源性功能类推
患者候选基因变异
克隆致病基因
Waardenburg综合症I型（WS1---2q35）
鼠
pax3
同源
Splotch鼠
变异
同源
paired box基因
果蝇
同源
表型类似
变异
PAX3
人
Waardenburg
综合症I型
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