Transcript 分子生物学基本技术课程简介

分子生物学基本技术课程简介
中国医科大学
卫生部细胞生物学重点实验室
教育部医学细胞生物学重点实验室
医学基因组学教研室
主讲:
罗阳 教授
课程主要讲授内容
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分子生物学前沿技术应用
分子生物学基本技术
分子生物学技术在科研设计
中的应用（实验课讲授）
基因数据库的应用
主要实验内容(基因组实验室
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综合楼15楼)
基因组DNA提取
PCR反应
琼脂糖凝胶电泳
目的基因克隆片段的回收和纯化
目的基因与克隆载体的连接、转化和筛选
RNA的提取
RT-PCR的原理和步骤
Southern印迹杂交
Western印迹杂交
分子生物学前沿技术介绍
讲授内容
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LCM(laser capture microdissection)
DHPLC（Denaturing High Performance
Liquid Chromatography）
MLPA（Multiplex ligation-dependent probe
amplification）
The Popular Technology in Molecular
Biology: Principle and Application
LCM(laser capture microdissection)研究技术体系
DHPLC（Denaturing High Performance
Liquid Chromatography）技术分析系统
Demonstration of temperature selection based
on melting curve
Three Modes of DHPLC Operation
DHPLC原理
DHPLC技术是利用液相色谱技术， 在高压
闭合液相流路中，将DNA样品自动注入并在
缓冲液携带下流过专利的DNA分离柱，通过
缓冲液的不同梯度变化，在不同分离柱温度
条件下实现对DNA不同的分析；由紫外检测
或荧光检测被分离的DNA样

DHPLC检测流程图
变性高效液相色谱
是一种检测微小突
变的高敏感性，高
精确性和高通量自
动化技术
野生型和突变型PCR产物等体积混合，进行变性和复
性形成异源双链，进行DHPLC检测
异源双链
同源双链
A
B
control
patient
图A，患者同正常对照的单峰相
比，出现肩峰
图B，对异常峰型样品的测序结果
MLPA（Multiplex ligation-dependent probe
amplification）结合毛细管电泳技术检测基因突变
CEQ8000遗传分析仪
MLPA技术应用范围
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
MLPA是一种灵敏度极高的相对定量技术，是利用简单的杂合
(hydriation)、连接(ligation)及PCR增幅(PCR amplication)反应，于
单一反应管內可同时检测最多40个不同的核苷酸序列的拷贝数变化。
应用于染色体数目异常(Trisomy13、18 & 21)、遗传疾病基因缺失重
复(如SMA、DMD基因…等)、基因甲基化检测(如Prader-Willi
syndrome (PWS) and Angelman syndrome (AS)、抑癌基因诊断(如
Breast cancer、Lung cancer…等)及mRNA分析等。检测探针种类，
已超过上百种。
MLPA的技术优势
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灵敏度高(High Sensitive) ：MLPA每次反应只需大约20 ng的DNA或10 ng
的 RNA即可，为Southern-blots及微阵列(micro-arrays)反应所需的
1/100~1/1000，且无须准确定量。
专一性高(Specific) ：利用MLPA可检测序列中单一核苷酸的改变，但需
要进一步验证。
再现性高(Reproducible)： 利用40-100 ng之DNA进行检测，其每一个探
针的变异系数(Coefficient of variability)仅3-8%。
简单(Simple) ：每一反应只需在同一PCR管內仅行，可获得多达30-40个
讯号值，这个反应中已经包含了內控制组，重复组及检测的目的基因，
可用于进行反应的监控。
高处理速度(High Throughput) ：MLPA搭配自动化设备，可在三小時内
同时处理96个检测。检测从DNA提取、反应至结果分析，仅需兩个工作
日。此外，因为所使用的反应条件都相同，可以平行处理不同的检验项
目。
MLPA 原理
探针构成
Synthetic oligonucleotide
50-60 bp
M13-derived oligonucleotide
60-450 bp
PCR引物X
PCR引物Y
填充序列
杂交序列
杂交序列
MLPA 反应过程
1、多对探针同时与靶序列杂交
2、连接酶连接
MLPA 反应过程
3、PCR扩增
通用引物X和Y进行PCR扩增
4、毛细管电泳检测
0 3 4 - N 3 - 1 .G 0 4 _ 0 7 0 7 2 6 1 2 R C
80000
70000
60000
50000
289.73
ex45
P34 DM D
371.31
ex27
P34 DM D
40000
314.48
ex6
P34 DM D
306.00
ex65
P34 DM D
30000
20000
282.30
ex5
P34 DM D
354.78
ex7
P34 DM D
320.96
ex46
P34 DM D
298.79
ex25
P34 DM D
412.58
ex68
P34 DM D
361.90
ex47
P34 DM D
328.23
ex26
P34 DM D
338.18
ex66
P34 DM D
405.33
ex28
P34 DM D
380.20
ex67
P34 DM D
397.09
ex48
P34 DM D
388.82
ex8
P34 DM D
421.33
xq 12
P34 DM D
445.59
ex29
P34 DM D
436.91
ex49
P34 DM D
428.68
ex9
P34 DM D
453.14
ex69
P34 DM D
469.65
ex50
463.26
ex10
10000
480.13
ex30
P34 DM D
Dye Signal
0
300
325
350
375
S iz e ( n t )
400
425
450
475
连续多外显子缺失突变
连续多外显子重复突变
患者和携带者检测结果
患儿
患儿母亲
患儿和患儿母亲的MLPA结果显示相同的重复区域
荧光显微分析系统
实验课教学团队和教学画面