Transcript 遗传病的诊断（C11
《医学遗传学》网络课程 主讲人：郭奕斌 中山医学院医学遗传学教研室 第十一章、遗传病的诊断 第五节、基因诊断 五、基因诊断的应用 2015/4/13 ****《医学遗传学》CAI教学 **** 2 <一> 核酸分子杂交技术 （一）基因探针 1. 概念：一段与目的基因或DNA互补的特异性核苷酸序列。 2. 种类：①基因组DNA探针；②cDNA探针；③RNA探针；④特 异性寡核苷酸探针。 3. 制备方法： ⑴基因组探针：基因组文库→筛选目的片段→克隆扩增 ⑵ cDNA探针：分离纯化相应的mRNA→逆转录→cDNA； 2015/4/13 ****《医学遗传学》CAI教学 **** 3 ⑶ 寡核苷酸探针的制备：人工合成十几个到几十个核苷酸 片段。 4、标记材料： ⑴ 同位素：32P标记核苷酸的α磷酸基； ⑵ 非同位素：生物素、地高辛。 5、标记方法： ⑴ 缺口平移法（nick translation）:DNA酶I切口，DNA聚 合酶酶切和聚合； ⑵ 随机引物标记法:6个核苷酸的随机DNA片段作为引物； 2015/4/13 ****《医学遗传学》CAI教学 **** 4 缺 口 平 移 标 记 法 2015/4/13 ****《医学遗传学》CAI教学 **** 5 ⑶特异引物法：PCR标记特异探针，并扩增该片段。 ⑷末端标记法。 (二)DNA的变性与复性及核酸分子杂交： 在加热、强碱等条件下，DNA双链解开成两条单链，称 为DNA变性；两条分开的互补DNA链再结合成双链的过 程，称为复性。不同来源的两条互补核酸单链复性成 双链(DNA-DNA，DNA-RNA)的过程称为分子杂交。 2015/4/13 ****《医学遗传学》CAI教学 **** 6 (三) Southern印迹杂交 1、原理：限制酶将DNA切成不同长度的片段→凝胶电泳能 将DNA片段分开→硝酸纤维膜吸附力DNA→探针与待检的特 定DNA互补结合。 2、主要过程： (四) 斑点杂交：DNA样品直接点在硝酸纤维膜上，余同上。 (五) 等位特异性寡核苷酸探针杂交(ASO） 主要用于已知点突变遗传病诊断。 2015/4/13 ****《医学遗传学》CAI教学 **** 7 2015/4/13 ****《医学遗传学》CAI教学 **** 8 制备探针 提取DNA ↓ 限制酶消化 ↓ 凝胶电泳 ↓ DNA转至硝纤膜 32P（或非同位素） 标记探针 分子杂交 ↓ 放射自显影 ↓ 带谱分析 2015/4/13 ****《医学遗传学》CAI教学 **** 9 β地中海贫血反向点杂交 2015/4/13 ****《医学遗传学》CAI教学 **** 10 ASO探针杂交进行PKU家系的产前诊断 1、原理： 碱基错配会影响互补DNA结合的稳定性，不完全互 补的探针杂交后会被洗脱。 2、主要过程： ⑴ 合成一对与目的基因互补的寡核苷酸探针，一条与正常 基因序列完全互补，另一条与突变基因完全互补； ⑵ PCR扩增； ⑶ 分子杂交：斑点杂交，反向斑点杂交。 3、诊断结果（见下图）： 2015/4/13 ****《医学遗传学》CAI教学 **** 11 PKU诊断结 果：II2正常 2015/4/13 ****《医学遗传学》CAI教学 **** 12 <二> 连锁分析技术 包括以下过程：⑴选择将要分析的座位；⑵确定将应用 的分析方法；⑶选择适用于分析的家系；⑷对家系中各成 员进行表型分析；⑸分析、判断并解释所得到的结果。 (一)限制性核酸内切酶 能特异地识别和切割核苷酸序列，将双链切成特异的较 小片段；它主要来源于原核生物；通常识别和切割的序列 为4-6个核苷酸；酶切末端可分为粘端和平端两种。 2015/4/13 ****《医学遗传学》CAI教学 **** 13 ↓ ↓ EcoRI CCAGG G AATT C C EcoRII TTAA G GGTCC ↑ ↑ 限制酶的特点及用途： ⑴可将不同来源的DNA片段连接在一起，即重新组合； ⑵可得到大量的具相同长度的一组片段； 2015/4/13 ****《医学遗传学》CAI教学 **** 14 平端和粘端酶切示意图 2015/4/13 ****《医学遗传学》CAI教学 **** 15 (二)类型： ⑴限制性片段长度多态性（RFLP）：为点多态。不同个体基因 组DNA，用同一种限制性内切酶切割时，所得DNA片段长度可 能存在差异。群体中这种DNA片段长度的差异称为RFLP。它反 映了不同个体间DNA的变异，并按孟德尔方式遗传。 哺乳动物基因组中，1次中性突变/100-200bp,有些会导致 限制酶切点改变（产生或消失），从而产生RFLP。RFLP为第 一代标记系统。 碱基变异→原切点消失或新切点出现→ 酶切片段长度差异 。 2015/4/13 ****《医学遗传学》CAI教学 **** 16 RFLP原理 2015/4/13 ****《医学遗传学》CAI教学 **** 17 BglI酶对血友病的RFLP分析 2015/4/13 ****《医学遗传学》CAI教学 **** 18 ⑵数目变异串联重复(VNTR) :人类基因组中存在一类DNA重 复序列，分别称为小卫星DNA（重复单位长16-28bp，重复 次数在人群中高度变异)）和微卫星DNA（重复单位长16bp, 通常重复10-60次），以上重复序列在人类是高度变 异的。当用限制酶切割基因组DNA时，只要切点不在重复 区内，就可能得到长度不同的片段。 VNTR为第二代标记。 ⑶ 扩 增 片 段 长 度 多 态 性 （ Amplified Fragment Length Polymorphism,Amp-FLP） 2015/4/13 ****《医学遗传学》CAI教学 **** 19 2015/4/13 ****《医学遗传学》CAI教学 **** 20 小卫星DNA和微卫星DNA的长度多态性可以通过PCR扩增后电 泳来检出，并用于致病基因的连锁分析，此法即称Amp- FLP连锁分析法。 ⑷单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism,SNP ） 对每一个核苷酸来说，其突变率大约为10-9 左右，因 此，每一个核苷酸在任何一代人群中大约每1× 10-9 个个 体就会发生一次变异。由这种方式产生的单碱基变异就形 成许多双等位型标记，这种标记在人类基因组中可达300 万个，平均约每1000个碱基对就会有一个。SNP为第三代 标记系统。 2015/4/13 ****《医学遗传学》CAI教学 **** 21 (三)特点：具有高度变异性，按孟德尔法方法遗传，类 型众多，分布广泛；杂合频率高。 (四)步骤：小卫星DNA、微卫星DNA →PCR →聚丙烯酰胺 凝胶电泳 (五)应用：⑴突变性质不明遗传病诊断；⑵动态突变遗 传病诊断；⑶法医鉴定（DNA指纹分析）。 2015/4/13 ****《医学遗传学》CAI教学 **** 22