Transcript 第十六章遗传病的诊断
第十六章 遗传病的诊断 主讲教师：朱玉琢 1 遗传病的诊断指临床医生根据患者的症状、体征 以及各种辅助检查结果结合遗传学分析，从而确 认是否患有某种遗传病并判断其遗传方式及遗传 规律。 产前诊断(prenatal diagnosis) 植入前诊断(preimplantation diagnosis) 症状前诊断(presymptomatic diagnosis) 现症患者诊断(symptomatic diagnosis) 2 第一节 病史、症状和体征 1.病史: 家族聚集现象 准确、详尽 (1)家族史 (2)婚姻史 (3)生育史 2.症状和体征 (1)特异性征候群 (2)形态学改变 (3)生长发育情况 (4)实验室检查 3 第二节 系谱分析 绘制系谱能准确而有效地记录家族史，对遗传病的诊断及确定遗 传病的遗传方式是非常重要的。系谱以图解的方式提供各种信息，易 于分析和解释。 系谱分析是在对先证者的症状、体征、实验室检查和其他辅助检 查作出诊断之后，进一步追溯家系中其他成员，绘出系谱图。 在系谱绘制过程中要力求 系统、完整、真实 去伪存真 注意隔代遗传 注意有新的基因突变 4 辨别遗传方式 一、孟德尔式遗传病 遗传异质性 延迟显性 二、非孟德尔式遗传病 1.线粒体遗传病 线粒体遗传病的特点:母系遗传,主要表现为晚发，并呈进行性加重。 2.多基因病 (多因子疾病、复杂性疾病) 三、具有特殊遗传方式的疾病 遗传印记 动态突变 显性和隐性的概念是相对的 5 第三节 细胞遗传学检查 一、染色体检查 —— 核型分析 智能发育不全、生长迟缓或伴有其它先天畸形者 夫妇中有染色体异常，如平衡易位、嵌合体等 家族中已发现染色体异常或先天畸形个体 多发性流产的妇女及其丈夫 原发闭经和男女不育症者 34岁以上的高龄孕妇 有两性内外生殖器畸形者 6 二、性染色质检查 X染色质检查 X染色质的检查可刮取口腔粘膜、 阴道粘膜脱落上皮细胞，亦可采用绒毛或羊 水中胎儿脱落细胞涂片，经硫堇或甲苯胺蓝 染色，在光镜下计数X染色质数目。如 Turner综合征X染色质为阴性，Klinefelter 综合征X染色质为阳性。 Y染色质检查 Y染色质检查适用于具有一个或 一个以上Y染色体的个体或细胞群 。如XYY 男性有2个Y小体。 7 三、染色体荧光原位杂交 整条染色体涂染 易位染色体 8 染色体荧光原位杂交 X染色体 Y染色体 13号染色体 18号染色体 21号染色体 9 染色体荧光原位杂交 13号染色体 21号染色体 10 第四节 生物化学检查 苯丙酮尿症, PKUⅠ 酶活性检查 PAH Guthrie test 血液滤片法 FeCl3显色反应 肝脏 苯丙酮酸 绿色 上海：1981～1987年对284,396名新生儿进行 PKU筛查，查出PKU患儿15名，高苯 丙氨酸血症4名。 11 第五节 基因诊断 1978年，Kan YW —— 镰状细胞贫血 症状前诊断 —— 外周静脉血 产 前 诊 断 —— 孕早期的绒毛细胞 孕中期的羊水胎儿脱落细胞 母亲外周血中的胎儿有核红细胞 植入前诊断 —— 受精卵卵裂细胞 12 基因诊断的概念 又称分子诊断，指利用分子生物学技术，直接探 测遗传物质的结构或表达水平的变化情况，从而 对被检查者的状态和疾病做出诊断。 基本途径 直接诊断 间接诊断 13 基因诊断的一般方法 直接诊断 基 因 诊 断 间接诊断 限制性内切酶片段长度多态性(RFLP) 分子杂交：点印迹 (dot blot) 斑点杂交(dot and slot hybridization) 等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO ) Southern印迹法(Southern blot) Northern印迹法(Northern blot) Western印迹法(Western blot) 聚合酶链反应（PCR） 多态性连锁分析（RFLP) 变性梯度凝胶电泳（DGGE) 单链构象多态性分析（SSCP） DNA芯片(DNA chip) 14 基因诊断两个必要的条件 一．特异的基因探针． 二．基因组ＤＮＡ 基因探针：就是一段与目的基因或ＤＮＡ互 补的特异核苷酸序列． 15 基因探针的来源和制备： 1．基因组探针：来自基因组中有关的基因 本身． ２．ＣＤＮＡ探针：从相应的基因转录获得 了ｍＲＮＡ，再通过逆转录得到的探针． ３．寡核苷酸探针：在体外人工合成碱基数 目不多的与目的基因序列互补的DNA片段。 16 基因诊断的应用 分子杂交 合酶链聚式反应多态性连锁分析（RFLP) 多态性连锁分析（RFLP) 单链构象多态性分析（SSCP） DNA芯片(DNA chip) 17 Southern印迹法(直接分子杂交法） （1）制备样品： 提取DNA或RNA 限制性内切酶消化 凝胶电泳 变性处理 转印到支持膜 （2）制备探针 （3）杂交 （4）检测 18 HbS 镰型细胞贫血 正常人 1.2kb 0.2kb Mst II 1.4kb 异常 ßAßA Southern ßAßS ßSßS 1.4kb 1.2kb 0.2kb 19 斑点杂交法 等位基因特异性寡核苷酸杂交（allelespecific oligonucleotide，ASO ） 基因的突变部位和性质已完全明了 等位基因特异的寡核苷酸探针 探针通常为长20bp左右的核苷酸 正常探针：与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不 能与突变基因序列杂交； 突变探针：与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交， 但不能与正常基因序列稳定杂交 PCR可结合ASO，即PCR－ASO技术，即先将含有突变点的基 因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO探针作点杂交，这样大 大简化了方法，节约了时间，而且只要极少量的基因组DNA就可 进行。 20 ASO斑点杂交 1986年，胡流清等基于点突变原理，用 寡核苷酸探针进行基因诊断。 PKU，AR 正常探针 突变探针 21 HbS 异常探针 TAG 正常探针 GAG 正常人 DNA 患者 DNA 正常人 DNA 患者 DNA 22 聚合酶链式反应 预变性(92-95C,2-5m) PCR的一般过程 变性(92-95C,30s) (25-35) 复性 延伸 (40-60C,30s) (72C,30-60s) 总延伸 (72C,7m) 经过30次的循环, 扩增的DNA片段可达100万倍以上。 23 聚合酶链式反应 24 聚合酶链式反应 25 聚合酶链式反应 26 聚合酶链式反应 27 RFLP法（间接分子杂交连锁分析法） 诊断苯丙酮尿症 9.7kb 与PKU连 锁，可以 进行明确 产前诊断 28 RFLP 连锁分析检测成年型多囊病APKD AD, 1/1000 ,30岁后，肾、肝多发性囊肿：腰痛、蛋白尿、血尿、高 血压、肾盂肾炎、肾结石等，导致肾功能衰竭和尿毒症。 发病机理未明。 APKD 致病基因与珠蛋白基因3‘附近的一段小卫星DNA 序列HVR紧密 连锁。 5.7kb 3.4kb 2.4kb 29 RFLP诊断 α地中海贫血 用限制性核酸内切Bgl II消化 正常人 12.5kb 7.7kb 右侧缺失 16.5kb 左侧缺失 7.7kb 30 病例 产妇陈某某，34岁，广东籍，第3胎。第1胎流产，第2胎足月分娩一女婴，患HbH病;丈夫患a地中海贫 血2，孕妇本人患a地中海贫血1。妊娠17周左右，用羊膜穿刺术取羊水20ml，并取孕妇及其丈夫、女 儿抗凝静脉血各l0ml，制备染色体DNA，经琼脂糖凝胶电泳分离，通过DNA印迹法转移至硝酸纤维素 膜上，与"P标记的"基因探针进行分子杂交，放射自显影结果如图所示。 1 2 4 5 16.5kb 3 12.5kb 4 5 7.7kb aa/a- aa/-- a-/-- aa/aa ？ 31 单体型分析 Ⅰ 1 2 PKU，AR Ⅱ 1 2 3 5.6 Kb 5.2 Kb 4.2 Kb 4.0 Kb Hind Ⅲ 32 单体型分析 Ⅰ 1 2 PKU，AR Ⅱ 1 2 3 5.6 Kb 5.2 Kb 11.0 Kb 9.7 Kb 4.2 Kb 4.0 Kb 7.0 Kb Hind Ⅲ SphⅠ 33 单链构象多态性 DNA分子在电泳中的行为取决于分子量 和分子构象。 DNA单链的构象取决于序列。 PCR产物变形后于中性胶中电泳，有一个碱 基的不同，则会形成不同的二级结构，造成 迁移率不同。与正常对照比较，若电泳行为 异常，则认为内含突变的碱基。 34 PCR-SSCP 1989年，Orita等建立的PCR产物单链 DNA凝胶电泳技术。 1 a 2 3 4 5 b 1：正常人 2,4,5：纯合体患者 3：杂合体(2的弟弟) 左为泳动变位模式：a 正常人；b 纯合体患者 35 PCR-SSCP GAA→GAG TGT→TAT CTC→CAC 36 第六节 产前诊断 一、产前诊断的主要对象 1.夫妇一方有染色体数目或结构异常，或曾生育过染色体病患儿的孕 妇。 2.夫妇一方是染色体平衡易位携带者. 3.脆性X染色体家系的孕妇。 4.具有染色体断裂综合症家系中的孕妇。 5.夫妇一方是某种基因病患者,或曾生育过某基因病患儿的孕妇。 6.夫妇一方有神经管畸形,或生育过开放性神经管畸形儿的孕妇 。 7.有原因不明的自然流产、畸胎史、死产或新生儿死亡史的孕妇。 8.羊水过多的孕妇。 9. 34岁以上的高龄孕妇。 10.夫妇一方有明显致畸因素接触史的孕妇。 37 二、几种主要产前诊断方法 1．X线检查 主要用于检查24周以柏胎儿骨骼先天畸形。但因X 线对胎儿有一定影响，现已极少使用。 2.超声波检查是一项简便对母体无痛无损伤的产前诊断方法。B 型超声波应用最广，利用超声波能作出的产前诊断或排除性诊断。 此外还可直接对胎心和胎动进行动态观察，并可摄象记录分析， 亦可作胎盘定位，选择羊膜穿刺部位，可引导胎儿镜操作，采集 绒毛和脐带血标本供实验室检查。 3.胎儿镜 胎儿镜（fetoscope）又称羊膜腔镜或宫腔镜，是一 种带有羊膜穿刺的双套管光导纤维内窥镜。能直接观察胎儿，可 于怀孕15－21周进行操作。由于B超的应用，此方法已少用。 38 4.羊膜穿刺术 羊膜穿刺（amniocentesis）亦称羊水取样。抽取羊水最佳时间 是妊娠16－18周。经体外培养后，可进行染色体分析、酶和蛋白质检测、性染色 质检查提取DNA作基因分析，也可不经培养，用微量技术作酶和蛋白质分析或直 接提取DNA作基因诊断。 5．绒毛取样 绒毛可经宫颈部取样，最好在B超监视下进行。绒毛取样（cvs） 一般于妊娠7－9周时进行。绒毛枝经处理（与蜕膜严格分离）或经短期培养后进 行染色体分析、酶和蛋白质检测和直接抽取DNA进行基因分析 39 6．脐带穿刺术（cordocentesis） 经母腹抽取胎儿静脉血， 可在B超引导下于孕中期、孕晚期（17-32周）进行。脐血可作 染色体或血液学各种检查，亦可用于因羊水细胞培养失败，DNA 分析无法诊断而能用胎儿血浆或血细胞进行生化检测的疾病，或 在错过绒毛和羊水取样时机下进行，在一些情况下，可代替基因 分析。 7.孕妇外周血分离胎儿细胞这是一项非创伤性产前诊断技术，并 易于被孕妇接受。孕妇外周血中的胎儿细胞至少有3种，即滋养叶 细胞、有核红细胞和淋巴细胞。在孕妇外周血中的胎儿细胞数量 虽然不多，但已有用单克隆抗体或以滋养叶细胞表面特异性抗原 的抗体作为标记等来识别胎儿细胞。结合富集和纯化技术不断完 善，如果方法能更加简便、经济，将可能在遗传病的预防中发挥 作用。 8．植入前诊断 植入前诊断（preimplantation diagnosis） 是利用微操作技术和DNA扩增技术对胚泡植入前进行检测。 40 思考题 一、名词解释 遗传印迹 基因探针 ASO探针 二、简答 动态突变 1.遗传性代谢病的诊断应从哪几方面着手？ 以PKU为例说明。 2.可以通过哪些方法进行产前诊断？ 41