Transcript 分子生物学相关知识及技术

分子生物学相关知识及技术
2012-11-29
核糖与脱氧核糖结构
核糖
2’-脱氧核糖
核苷酸结构
DNA双螺旋
大沟
小沟
细胞内的DNA具有超螺旋结构
DNA复制有特定的起始位点
原核生物
复制原点
复制叉
真核生物
复制原点
约30-40kb
大肠杆菌复制原点序列
例：大肠杆菌复制起始
DNA聚合酶底物要求决定复制过程需要引物
DNA复制由多种蛋白协同完成
β夹子
单链结合蛋白
DNA聚合酶III
前导链
前导链模板
拓扑异构酶
冈崎
片段
DNA聚合酶I
DNA连接酶
冈崎
片段
引物
解旋酶/引发酶
引物
引物
后随链模板
完成DNA复制必需去除RNA引物
外切酶
DNA聚合酶
DNA连接酶
原核生物复制结束产生的问题及解决
真核生物复制结束产生的问题及解决
转录需要启动子

启动子是RNA聚合酶结合并起始转录的DNA区
域
大肠杆菌启动子
5-8bp
consensus
共有序列
-35区
Pribnow 盒
+1
原核生物转录起始
封闭式启动子
复合物的形成
开放式启动子
复合物的形成
流产式起始
启动子
清除
转录是由RNA内部的信号终止
双对称
转录后形成发夹结构
真核生物的启动子更加复杂
BRE: TFIIB 识别元件; Inr: 起始位点; DPE: 下游起动子元件
真核生物有三种RNA聚合酶



RNA聚合酶I 前rRNA 的转录
RNA聚合酶II 前mRNA 的转录
RNA聚合酶III 前tRNA、snRNA和5S rRNA
的转录
真核生物转录的mRNA需要加工



5 ’端加上鸟苷帽子
3 ’端加上多聚腺苷酸尾巴
切除内含子
5 ’端加上鸟苷帽子
内含子切除
5’-拼接点
外显子1
分枝点
内含子
3’-拼接点
外显子2
外显子2
Lariat（套索）
外显子2
3 ’端加上多聚腺苷酸尾
RNA聚合酶
RNA聚合酶
继续合成
起始
增加PolyA
信号序列
在信号序列
下游10-30个核苷
酸的位置切断
polyA聚合酶增加
密码子与反密码子配对的摇摆现象
反密码子
摇摆位置
密码子
原核翻译起始
Shine-Dalgarno序列
真核翻译起始
AC CATG G
扫描
Kozak 序列
起始合成
分子生物学相关技术
DNA克隆技术
DNA片段
1.目的DNA片段获得(PCR、基因文库
和人工合成）
载体
重组载体
重组载体
大肠杆菌
2.载体的制备
3.DNA片段与载体连接
抗菌素
抗菌素
4.重组载体转化到大肠杆菌中
5.筛选
死亡
生长
重组DNA的分离
PCR扩增技术
变性
引物退火
DNA合成
变性
引物退火
DNA合成
RT-PCR（反转录PCR）技术
基因组和cDNA文库构建技术
基因组文库
连接
细菌
细胞
DNA
限制酶
消化
限制酶
消化
载体
限制酶
消化
cDNA文库
连接接头
细菌
限制酶
消化
连接
限制性内切酶能在特定位置切割DNA
琼脂糖凝胶电泳技术
双脱氧测序技术（Sanger 测序）
dATP
ddATP
双脱氧核苷酸渗入造成合成终止
双脱氧测序技术
Southern杂交和DNA芯片技术基础
变性
RNA或DNA
双链DNA
杂交
杂合分子
Southern杂交技术
DNA芯片技术
固定在载体上
的基因序列
标记的探针