Transcript 第11 章 基因治疗Gene Therapy

第二节 基因治疗

基因治疗 (gene therapy) 有关概念

基因治疗的基本程序

基因治疗策略和技术方法

基因治疗的应用研究
一. 基因治疗（Gene therapy ）有关概念

基因治疗（Gene therapy ） ：指在基因
水平上治疗疾病的方法。包括基因置换、
基因修正、基因修饰、基因失活、引入新
基因等。

体细胞基因治疗：somatic gene therapy
改变患者体细胞的基因组成、结构或基因
表达水平以达到治疗疾病的方法。

生殖细胞基因治疗：将正常基因转移到患
者生殖细胞中，使其发育为正常个体，从
根本上治疗遗传病的方法。
二. 基因治疗的基本程序
（一）目的基因的选择和制备
（二）基因的导入方式
体内法（in vivo），原位法（in situ），
回输法（ex vivo）
（三）靶细胞的选择
目前基因治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细
胞，而只能使用体细胞。可选择的细胞有淋
巴细胞、造血细胞、皮肤成纤维细胞、肝细
胞、血管内皮细胞、淋巴细胞、肌肉细胞和
肿瘤细胞等。（含量丰富、易培养、寿命长）
（四）基因的转移
（五）转基因细胞的筛选和导入基因的鉴定
基因治疗基本程序（回输法）
将治疗基因克隆入合适表达载体
以病毒核酸为载体
治疗基因转入靶细胞
治疗基因插入靶细胞基因组
筛选，再回输入病人身体
基因转移的方法


基因转移 (gene transfer): 外源基因导入细胞
（包括体外培养或体内细胞、真核或原核生物细
胞）的过程。可用转导、转染、感染、电穿孔、
显微注射或基因枪等手段。
基因转移途径分两类：
病毒学方法
非病毒学方法
病毒学方法：以病毒作为载体转移

逆转录病毒基因组经过改造后作为载体 ( retrovirus
vector, RV)

腺病毒(adenovirus, Ad)基因组可作为载体携带治疗基
因。 （双链DNA病毒）

腺病毒相关病毒（adenovirus associated virus,AAV)
载体适合治疗基因的稳定长效表达。

单纯性泡疹病毒(herpes simplex virus, HSV) 载体适
合将治疗基因导入神经细胞。 （双链DNA病毒）
病毒介导基因转移（Viral mediated transfer）
是通过病毒为载体（vector），将外源基因通过
重组技术与病毒重组，然后去感染靶细胞。
重组病毒
感
染
细
胞
逆转录病毒（retrovirus）RNA病毒
目前应用最多、最成功。病毒感染细胞后，其基因组RNA经逆转录产生双链
DNA拷贝，插入宿主基因组DNA形成前病毒（provirus），前病毒转录产生的
正链既是病毒RNA，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。
宿主基因组DNA
前病毒
正链
逆转录病毒感染宿主细胞的机制
小鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因组结构特点：
LTR：长末端重复序列
U3=增强子，R=启动子，U5=转录起始、终止信号位点。
Ψ=病毒包装信号， gag =基质蛋白、核衣壳， pol=逆转
录酶、蛋白酶、整合酶， env=外壳蛋白、包膜蛋白。
逆转录病毒介导的基因转移系统
逆转录病毒载体
结构基因被删除，保留包装信号（ψ），带有
抗性基因（neo），具有适当的酶切位点。
它可以克隆并表达外源基因，缺失病毒颗粒包
装蛋白基因，不能自我包装成有增殖能力的病
毒颗粒。
LTR
therapeutic gene
LTR
neo：新霉素磷酸转移酶
辅助细胞株（提供病毒包装蛋白）
它由另一种缺陷型逆转录病毒感染构建而成。
该细胞株能合成包装蛋白，用于逆转录病毒载
体包装。由于缺乏包装信号，本身不能被包装
成病毒颗粒。
gag pol env
逆转录病毒介导的基因转移系统
辅助细胞株
逆转录病毒载体
具感染性的逆转
录病毒载体颗粒
逆转录病毒载体优点：

高效感染靶细胞，感染率可达100%

病毒基因和所载的外源治疗基因都可能表达

宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留
缺 点

病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段；

病毒随机插入靶细胞基因组中，因病毒具有强大的
启动子和增强子，能使插入点附近的基因过度表达
或失活，插入的外源基因可能不适当的表达；

逆转录病毒有致癌作用，可能使受体细胞癌变。
非病毒学方法

脂质体（liposome)介导基因转移
利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以形成包埋外
源DNA的脂质体，与细胞一起温育，可通过细胞内吞作
用将外源DNA(目的基因）转移到细胞内。

细胞表面受体介导基因转移 *
将DNA与已证明有细胞或组织亲和性的配体偶联，即可
使其具有细胞靶向性。

直接注射进行基因转移
直接将裸露基因DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。

其他方法介导基因转移 *
脂质体（liposome）介导基因转移
脂质单体：由脂质双分子层组成的封闭囊泡，无毒、无免疫原性。
缺点：转染效率低，转染基因表达时间短暂。
受体介导基因转移
将含有目的基因的重组质粒和靶细胞表面受体能识别的特
异性
特点：
多肽（配体）形成复合物，通过细胞内吞途径达到转移基
因的
具有细胞组织专一性、配体
目的。
只能够被一些特殊的细胞吞
噬；转移效率高。
*
显微注射法（microinjection ）
利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或细胞核
例：转基因动物的制备
重组基因 DNA
微注射 （体外）
小鼠受精卵
回植
假妊娠
仔 鼠
动物模型：转基因鼠
(每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传)
电穿孔法（electroporotion）
将细胞置于高压脉冲电场中，通过电压使细胞产
生可逆性的穿孔。周围基质中的外源DNA可渗进
细胞，进而表达。
瞬间
细胞 -------- 细胞膜核膜通透性增加
高压脉冲
外源DNA渗入细胞
化学法
磷酸钙沉淀法：
目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA
微细颗粒，粘附于细胞表面，通过细胞内吞作
用被捕获，并整合到受体细胞基因组中，在适
当条件下得以表达。
磷酸钙+DNA → 混合微细颗粒
↓
沉淀反应20~30min
↓
细胞在沉淀物中暴露 5~24h
方法简单，但转化效率低。
微粒子轰击法

利用金属钨和金的亚微粒能吸附DNA，并将
其包裹起来形成微粒，通过物理途径获得高速
度，微粒瞬间既可进入靶细胞，达到转移目的
基因的目的，而不损伤靶细胞。

该方法可使目的基因在皮肤、肝、胰、胃及乳
腺等细胞中表达。
适合基因转移的靶细胞
在目前条件下，基因治疗仅限于体细胞。为了防
止给人类自身可能造成永久性损害，国际上严禁
进行生殖细胞的基因治疗操作。
适合基因转移的体细胞有：
造血细胞 皮肤成纤维细胞
肝细胞
血管内皮细胞
淋巴细胞
肌肉细胞
肿瘤细胞
其他细胞（心肌细胞、脾细胞）
靶细胞的选择
靶细胞是指接受外源Gene的体细胞，选择靶细胞
的原则是：

易于由人体分离又便于输回体内；

便于体外培养和进行遗传技术操作；

易于受外源遗传物质转化；

具有增殖优势，生命周期长（能存活几月至几年，或整个
生命周期）。
体细胞的基因治疗

正常基因转移至体外培养的体细胞，有效表达后，再回输
到体内。

正常基因导入靶细胞，定位整合到染色体上，准确的替换
异常基因，是理想的措施。

随机整合，非特定座位，只要有效的表达即可达到治疗的
目的。

体细胞基因治疗理论上不必矫正所有的体细胞。
三. 基因治疗策略和技术方法

基因置换 （gene replacement )：缺陷基因进行精确原位修复
是指将特定的目的基因导入特定的细胞，通过定位重组，以
导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因。目的是矫正
缺陷基因，不涉及基因组任何改变。
•
•
•
•
•
必要条件：
对导入的基因及其产物有详尽的了解；
外来基因能有效地导入靶细胞；
导入基因能在靶细胞中长期稳定存在；
导入基因能有适度水平的表达；
基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全无害。
定位重组（homologus recombination）:
外源基因和染色体上的基因在同源序列间发
生重新组合而将外源基因定位插入细胞的染
色体上。
通过定位重组插入珠蛋白基因
δ
β
正常基因座位
BstXI
Xba I
XbaI
BstXI
Xba I
△β
带有珠蛋白基
因的质粒
neo
δ
Δβ
neo
β
重组后，插入外源基因片段带有——neo基因（新霉素抗性基
因），重组后的细胞在含有neo 的培养基中生长，没有插入外源
基因的细胞死亡，将有重组的细胞筛选出来。

基因添加（gene augmentation )：通过导入外
源基因使靶细胞表达原来不能表达的蛋白。
有两种类型：
一. 是针对特定的缺陷基因导入其相应的正常基
因，并使之整合到基因组中，而细胞内缺陷基因
并未去除，通过正常基因的表达产物，补偿缺陷
基因的功能；
二. 是向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，
利用其表达产物达到治疗疾病的目的 。

基因干预 （gene interference )
是指采用特定的方式抑制某个基因的表达，
或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表
达，以达到治疗目的。
例如反义核酸、干扰RNA或核酶技术等。
基因干预技术
基因干预技术主要用于干扰特定细胞的
mRNA转录和翻译，在调控基因表达、特别是
在抑制一些有害基因的表达或失控基因的过度
表达方面取得了很大进展。干预基因表达作用
得到证实，但体内应用还存在许多技术难点，
目前仍以体外实验研究为主。
基因干预采用方法
反义RNA技术（antisense RNA)：
要将合成的反义RNA用于体内基因治疗，必须解
决两个关键问题：


专一性转移问题 即如何专一性地对病变细胞进
行调控，而不影响其他正常细胞。
反义RNA进入靶细胞前的降解问题 反义 RNA
抗RNase能力不强，易被降解。
受体介导的反义RNA转移技术是解决上述两个问
题的一条很有希望的途径。
核
酶
的
作
用
机
制
与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳定的空间结构，
不易受到RNA酶的攻击。更重要的是，核酶在切断
mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切
割其它的mRNA分子。
核酶技术用于基因治疗
可以基因治疗为目的设计核酶；核酶切割特定mRNA
而产生更强的基因干预效应。
三链DNA技术可用于基因治疗
一类含10bp±的DNA单链（脱氧寡核苷酸，ODN）,
它们可以识别并结合到染色体双链DNA的特定位点,
形成一段三链DNA（Ts-DNA ）。若将此ODN连接
到核酸内切酶上，ODN可将核酸内切酶携带到DNA
的特定位点上，借形成Ts-DNA从而对DNA进行选择
性剪切。阻止基因转录或DNA复制。
RNA干扰技术（RNA interference, RNAi)
外源性
siRNA（Small interfering
RNA ）:
是一种小RNA分子（
21-25核苷酸），由
Dicer（RNAase Ⅲ家
族中对双链RNA具有
特异性的酶）将外源
的dsRNA加工而成。
siRNA激发与之互补的
目标mRNA的沉默。
内源性
miRNA（micro RNA）：
由高等真核生物基因组编码的，含有茎环结构的miRNA前
体（pre-miRNA），经过Dicer加工之后的一类非编码的
小RNA分子，类似于siRNA的分子，miRNA通过和靶基
因mRNA碱基配对引导沉默复合体（RISC）降解mRNA
或阻碍其翻译，在调控发育过程中有重要作用。
RNAi研究的一般技术路线

siRNA可用于有异常基因表达的恶性肿瘤
如用siRNA可以阻碍肿瘤发生所必须的Kras蛋白表达而抑制肿瘤。
siRNA可用于病毒性疾病的基因治疗
如用siRNA抑制HIV某些基因表达，阻碍
HIV在细胞内复制。
自杀基因（suicide
gene）技术：
导入基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢产
物，诱导细胞产生自杀效应，清除肿瘤细胞。
旁观者效应
自杀基因的作用机制
四. 基因治疗的应用研究
背景知识：
世界上第一个正式被批准用于基因治疗的
病例是：先天性腺苷脱氨酶（ADA)缺乏症
1990年9月美国 Dr. Blaese 成功将正常人
的ADA基因植入ADA缺陷病人的淋巴结内，
完成了世界上首例基因治疗试验。
（一）遗传病的基因治疗研究
人类遗传病4000多种，发病率为40-50%，必须符
合以下要求的遗传病才可考虑开展基因治疗研究：
（30余种）





在DNA水平上明确其发病原因及机制；
单基因遗传病，而且属隐性遗传；
该基因的表达不需要精确调控；
该基因能在一种便于临床操作的组织细胞中表达
并发挥其生理作用；
该遗传病不经治疗将有严重后果。
几种已经或可望在临床进行基因治疗的
人类单基因遗传病


腺苷脱氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶（PNP)
缺乏症；
血友病B：针对凝血因子Ⅸ基因；
中国科学家薛京伦等1991年12月成功进行了血友
病B的基因治疗。
将携带凝血因子Ⅸ基因的巨细胞病毒载体导入患
者自身皮肤的成纤维细胞—— 经体外培养---再植入患者皮下----患者血浆中凝血因子Ⅸ浓度
上升，凝血活性改善。
 苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢性缺陷病：
肝内苯丙酮酸羟化酶（PAH)缺乏；
 箂纳（Lesch-Nyhan)综合征
又称自毁容貌综合
征：次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)缺乏；
 家族性高胆固醇血症：因低密度脂蛋白（LDL)受
体基因突变所致。
1. 联合免疫缺陷综合征的基因治疗
（首例人类基因治疗成功例子）
ADA缺乏症-——致死性疾病，患者由于腺
苷酸脱氨酶（ADA）缺乏。
ADA-Gene + vector （逆转录病毒）
重组分子
患者T淋巴C
导入
细胞生长分裂
10天
Gene表达
回输患儿体内
1~2月治疗一次, 10个月
患儿体内ADA水平达正常人的25%
IL-2刺激C分裂
2. 乙型血友病
XR ，临床表现，易出血，凝血时间长，轻伤、小
手术后常出血不止。发病率为1/30000。患者凝血因
子Ⅸ缺乏，Ⅸ因子基因定位在Xq26.3~q27.2。
例如：我国学者薛京伦实施的FⅨ的基因治疗。
逆转录病毒载体 + FⅨcDNA
重组体
5`
LTR
FⅨ
neo
SV
PSO
LTR
3`
①导入仓鼠细胞（CHO ）→FⅨ表达；
②导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）
→FⅨ表达；
③91年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外
培养）→回植病人皮下→FⅨ基因表达，FⅨ基表达
水平达正常人的5%。
是我国基因治疗成功的例子。
（二）恶性肿瘤基因治疗研究
 从基因操作角度，肿瘤基因治疗四大策略：
基因矫正、基因置换、基因失活、基因修饰
 从临床治疗角度，目前肿瘤基因基因治疗的策略



直接杀伤肿瘤细胞或抑制其生长；
增强机体免疫系统，间接杀伤或抑制肿瘤胞；
改善肿瘤常规治疗方法，提高疗效；
肿瘤基因治疗常用方法

基因干预技术

反义RNA技术：①封闭异常表达的癌基因； ②
作用癌基因的易位和重排部位；⑶抑制肿瘤细胞
的耐药性，提高化疗效果。

RNA干扰技术：用于阻断、抑制癌基因异常表达
的恶性肿瘤治疗。

反义基因技术：设计原癌基因启动子的竞争剂，
从而抑制原癌基因转录。
自杀基因治疗
前提条件是“自杀基因”的表达必须局限于肿瘤细胞中，而
不伤及正常细胞。
肿瘤的免疫基因治疗
 细胞因子或受体的基因治疗：如在肿瘤特异性TIL细胞（肿
瘤浸润淋巴细胞）中导入能增强其功能的TNF 、α-干扰素
和IL-2等基因，可提高治疗效果。该方法已被批准试用于临
床。
 MHC基因治疗：MHCⅠ类抗原在免疫识别及肿瘤特异性
杀伤中发挥重要作用。将同种MHCⅠ类基因转移至肿瘤细胞
后，可以明显降低肿瘤细胞的致瘤性，增强其免疫原性，有
效地激活机体抗肿瘤免疫反应。
提高化疗效果的辅助基因治疗
 药物增敏基因治疗：将某些药物增敏基因导入肿瘤细胞。
 耐药基因的相关治疗研究。
1. 黑色素瘤的基因治疗
肿瘤Gene治疗是人们十分关注的问题，进行了广泛
的探索。研究发现，肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），它
积聚肿瘤部位，并在该处持续存在而无副作用，利用
此特点协助治疗肿瘤。
例：细胞因子基因治疗和肿瘤坏死因子基因治疗
①IL-2 Gene
②TNF-Gene
（白介素2）
（肿瘤坏死因子）
逆转录病毒载体
导入
TIL（体外培养的自体细胞）
回植患者体内
TIL进入自体肿瘤部位，提高细胞因子杀伤肿瘤细
胞 的作用。
2. 自杀基因的基因治疗
原理：即用（逆转录）病毒载体将编码某种酶的
基因（自杀基因）转染到肿瘤细胞中，此酶可将
一种无害的药物前体转变为细胞毒复合物，进而
杀伤肿瘤细胞（肿瘤细胞不能复制而死亡）。这
种基因载体只能在特定的组织或肿瘤中表达，而
正常细胞中不表达。
自杀基因 + 病毒载体
转染
药物前体 无毒
Gene→酶→ ↓
重组载体
药物复合物 有毒
细胞死亡
例如：
单纯疱疹病毒
（TK不存在于哺乳动物细胞内）
HSV Gene-TK
（在肿瘤细胞中表达，正常细胞中不表达）
GCV（丙氧鸟苷，胸苷类似物，无毒性抗真菌药物）
P
GCV---p
抑制DNA合成
肿瘤细胞死亡
邻近细胞死亡/凋亡（旁观者效应）
3. 反义核酸基因治疗
反义技术：是指利用人工合成的反义RNA或
DNA导入靶细胞，阻断基因的转录或复制，
控制细胞的中间阶段使编码蛋白的基因不能
转录为mRNA 或阻断翻译相应蛋白质。
反义RNA基因治疗
DNA
DNA
mRNA
mRNA
反义RNA
阻断表达
（三）病毒性疾病的基因治疗研究

主要策略
诱导对病毒RNA的降解

用RNA干扰病毒受体或辅助受体在细胞中的表达

抑制病毒与宿主细胞结合

干扰病毒基因组的转录起始和调控

抑制病毒基因组的复制和蛋白质合成
（四）基因治疗存在的问题与伦理学
基因治疗的研究与实践中存在若干重要
问题，所以更多的是处于研究阶段，
临床应用还有待深入。
导入基因的持续性和高效表达
如何提高基因的持续高效表达，从下列几方面考虑：
1、选择高效的基因转移方法；
2、选择适当的受体细胞（生命周期长的细胞）
3、选择适当的载体（广泛表达或特异性表达的载体，
以使基因高效表达）
基因治疗与社会伦理道德

体细胞Gene治疗符合伦理道德，没有争议。

生殖细胞Gene治疗可能改变正常人的遗传特
征，存在某些争议。然而生殖细胞的基因治疗
又是一个不容回避的课题，因为它比体细胞基
因治疗更为彻底。所以，随着分子生物学技术
的发展，Gene治疗技术的成熟，将回答伦理
道德方面的问题，相信生殖细胞的基因治疗将
会被人们接受。
基因治疗一览图