Transcript 10基因诊断和基因治疗

基因诊断
基因改变与疾病





基因突变导致疾病: 遗传病, 肿瘤
外源病原体基因导致疾病: 肝炎, HIV病毒
基因异常表达 : 肿瘤等疾病
基因缺失导致: 遗传病,肿瘤
基因重排: 肿瘤, 白血病
这是目前 疾病基因诊断的分子基础
基因诊断

采用分子生物学方法，在 DNA 或 RNA 水平上
对某一或某些基因进行分析，从而对特定疾病
作出诊断。
基因诊断的特点



针对病因：直接了解致病因素，有利于作出明
确判断。
预见性：在个体未发病时发现致病的潜在因素。
确定胎儿是否携带致病基因、确定个体的易感
性、发现潜伏感染等。
适应性：诊断范围广，对待测样品无组织来源
的要求。
一、基因诊断的基本原理和方法


探测基因的改变，包括内源性基因改变与外源
性基因引入。
直接的基因突变检测：


间接的基因连锁分析：


在明确特定基因突变与疾病直接的因果关系，对其
分子机制有一定的了解时可以应用。
利用未知或难以检测的致病基因与特定已知序列间
的连锁关系，确认受检者是否携带致病基因。
外源性基因的检测：

主要用于感染性疾病或寄生虫等的检测。
（一）基因突变的诊断


基因突变检测的范围包括：
 基因的点突变。
 小片段的缺失或插入。
 大片段的缺失或插入。
 基因的易位、倒位、重排等。
检测的主要方法：
 PCR 与核酸杂交。
1.点突变或小片段基因改变的检测



基因的改变不造成基因长度的变化，或变化难
以检测。
在基因改变伴随有限制性内切酶识别位点改变
时检测较为简便，可用限制性酶谱分析。
家族性帕金森病的致病基因α-synuclein 发生点
突变 G209A，导致产生 Tsp45I 酶切位点。
等位基因特异性寡核苷酸探针杂交


等位基因特异性寡核苷酸（ASO）：设计针
对正常和突变序列的探针，通过 PCR 技术扩
增待测基因，在严格的杂交条件下分别进行
杂交。
主要应用于固定位点的固定突变类型的检测。
SSCP


单链构象多态性（Single Strand
Conformation Polymorphism):长度相同而
构象不同的单链DNA在非变性聚丙烯酰胺
凝胶电泳（PAGE）中表现出不同的迁移率，
称为SSCP。
相同长度的DNA，如果碱基序列不同，形
成的构象就不同。
PCR-SSCP


单链构象多态性是基于DNA构象差别检测点突
变的方法。在无法确定突变部位与突变类型时
可以采用。
在 PCR 扩增片段长度小于 200 bp 时，90％ 的
突变可以被检测出来。
直接序列测定

直接确定突变位置与类型的唯一方法。一般在
完成其他检测方法后可通过测序进行鉴定。

PCR 产物可直接用于测序。

PCR-SSCP-Sequencing
2. 大片段基因改变的检测



大片段的基因改变可以影响到基因的长度，相
对易于检测。
传统的检测方法：基因组 DNA 经酶切后通过
Southern 杂交方法检测。
直接的 PCR 扩增可简化检测过程。
多重PCR：杜氏肌营养不良的检测

DMD：Duchene muscular
dystrophy。
 X-染色体连锁，男婴发
病率为 1/3500。
 主要特征为横纹肌萎缩，
患者在 5 岁发病，12 岁
丧失行走能力，20 岁左
右因呼吸衰竭而死亡。
 由 dystrophin (抗肌萎缩
蛋白) 缺陷造成。
杜氏肌营养不良的检测



Dystrophin 基因跨度 2.4Mb，包含 79 个外显
子，是人类最庞大的基因之一。
约 60％ 的患者 dystrophin 基因发生了不同程
度的缺失。
多重 PCR 方法：同时扩增多个外显子。
3、基因重排的诊断

在已知重排基因和重排位点的情况下，设计3
条PCR引物进行PCR扩增。
P1
P2
P3
（二）多态性分析


限制性片段长度多态性：RFLP
DNA重复序列多态性：VNTR，STR
1、限制性片段长度多态性


利用限制性内切酶切割不同个体基因组 DNA
时，所获得的酶切片段数目和长度存在差别的
现象称限制性片段长度多态性。
 限制性内切酶酶切位点的有无，产生片段数
目差别。
 切点间发生插入或缺失，导致长度变化。
检测方法可采用酶切结合 Southern 或 PCR 结
合酶切。
RFLP

当DNA分子上发生突变、重排、核苷酸的插入
或缺失时可导致限制性酶切位点的增加、缺失
或位置改变，用限制性内切酶消化待测DNA和
野生型对照DNA，通过比较两者酶切片段的长
度、数量上的差异就可确定DNA的突变情况。
PCR-RFLP

Lener遗传性视神经病：
G
C
正常
A
T
突变
P1
P2
PCR
G
C
A
T
正常
突变
酶切
RFLP连锁分析


当某种 RFLP 与致病基因高度连锁，且连锁关
系存在于一定人群时可以采用。
正常西非人群β珠蛋白位于 HpaI 酶切 7.6 kb
片段，镰刀型贫血人群则出现 13.0 kb 片段。
2、 VNTR 与 STR


可变数目串联重复 (variable number of tandem
repeat，VNTR)，又称小卫星 DNA。
 2-70 bp 重复序列，重复次数几次到几十次
不等，高度可变且广泛存在。
短串联重复 (short tandem repeat，STR)，又称
微卫星 DNA。
 1-4 bp 重复，AC 与 TG 最常见，在重复次
数超过 14 时可变性非常高，且在分布非常
广，约 5-10 万个。
VNTR 与 STR 的检测


在 PCR 技术产生之前，VNTR 主要通过杂交
方式检测，STR 则难以检测。
当前可利用两翼序列设计引物，通过 PCR 方
法直接分析 STR 的重复次数。
VNTR 与 STR 的应用
 STR 高度的多态性和分布的广泛使其成为基因
连锁分析的主要方法。



目前已经确认了数万个 STR 位点，通过这
些位点可进行全基因组多态性分析，并用于
未知致病基因的定位。
替代 RFLP 用于家系连锁分析。
个体鉴别与亲缘关系鉴别。
（三）基因表达异常的诊断

mRNA的相对定量分析：RT-PCR，Northern
Blot，斑点杂交等方法。

mRNA的长度分析： Northern Blot。
二、基因诊断应用于遗传病检测


遗传性疾病是基因诊断的最初研究对象。
基本方法：
 基因突变的直接检测：
 大片段的缺失、插入、重排等。
 小片段的基因改变。
 基因连锁分析：
 等位基因连锁分析。
 家系连锁分析。
 RFLP、STR、VNTR 均可作为连锁标记。
二、基因诊断应用于肿瘤检测


肿瘤基因诊断的用途：
 肿瘤的早期诊断和肿瘤类型的鉴别。
肿瘤基因诊断的策略：
 检测肿瘤相关基因：癌基因、抑癌基因、转
移相关基因等的突变或表达异常。
 检测肿瘤相关病毒基因： EB 病毒、HPV、
HBV、HCV、HTLV-1 等。
 检测肿瘤标志物。
癌基因的检测



癌基因的变化主要包括癌基因的扩增、过量表
达、点突变等。
myc 在白血病、结肠癌、小细胞肺癌等过度扩
增。
 Southern 或定量 PCR 方法可以进行检测。
ras 基因是肿瘤中最常被激活的基因。其 12 位
密码子是点突变热点。
 可采用直接的点突变检测方法。
抑癌基因的检测


p53 是人类癌症中最常见的基因改变。
 点突变、缺失插入等均可发生。
 经常伴随有基因表达水平的改变。可以采用
RT-PCR 或 Northern 杂交方法检测。
抑癌基因是显性的，一般只有两个等位基因同
时发生突变才有意义。
 也存在突变产物对正常基因产物功能有抑制
作用的现象。
三、外源DNA的检测


只有已知病原体的 DNA 序列，就可以完成病
原体的基因诊断。
针对病原体特异性的 DNA 序列，通过 PCR 或
杂交的方法可以进行检测。
 疟原虫检测时可依据特异性中度重复序列设
计引物和探针。
 霍乱弧菌检测时可依据霍乱肠毒素基因设计
引物。
病原体基因诊断的特点



不依赖于病原体培养，直接自样品检测。
在检测培养条件复杂、生长缓慢的病原体时具
有优势。
克服表型变异，解决形态、生化、免疫等检测
方法的不足。
四、基因诊断应用于法医学

法医学鉴定的主要目的是个体识别与亲子鉴定。
 经典方法：ABO 血型。
 白细胞血型：人类白细胞抗原 (HLA)。
 DNA 指纹图：利用 RFLP、VNTR 与 STR
等多态性鉴定个体与亲缘关系。
DNA 指纹



VNTR 是当前鉴定 DNA 指纹的主要方法。
每一个 VNTR 位点具有数十种多态性，
结合多个位点，可达到鉴别个体的目的。
DNA 样品经过酶
切后与 VNTR 核心
序列探针进行
Southern 印迹杂交。
第十七章 基因治疗
基因治疗




通过在特定靶细胞中表达该细胞本来不表达的
基因，或采用特定方式关闭、抑制异常表达的
基因，达到治疗疾病目的的治疗方法。
基因治疗最初是针对遗传病的根治而提出的。
肿瘤与病毒性基因的基因治疗，导入特定基因
抵抗肿瘤生长或病毒侵袭。
基因治疗的基础：成熟的基因克隆技术以及基
因的导入与表达技术。
一、基因治疗的方法




基因治疗的前提是对疾病相关基因的克隆及其
分子机理的阐明。
有效的基因转移 (或称基因导入) 手段是基因治
疗的基础。
成功的基因治疗还需要高水平的基因表达与精
细的基因调控。
基因治疗必须保证安全性。
1. 基因治疗的策略



基因置换：通过同源重组的方式，以正常基因
置换缺陷基因。
基因添加：导入正常基因，矫正缺陷基因的功
能。或者引入本来不表达基因。
如引入 INF、TNF、IL 等基因，提高免疫力。
基因干预：采用特定的方式抑制特定基因的表
达，或者破坏某个基因使之不能表达。
 抑制癌基因表达治疗恶性肿瘤。
2. 基因导入的基本途径


Ex vivo 途径：体外转移后导入的途径。
 取实验对象体细胞进行体外培养，在体外完
成基因导入后将细胞注射回对象体内。
 目前大多数研究采用的方法。
In vivo 途径：活体直接导入。
 通过重组病毒载体，脂质体或裸露 DNA 直
接注射到体内。
 尚未成熟的方法，是基因治疗导入途径的最
佳选择。
Ex vivo 途径
In vivo 途径
3. 基因导入的方法



物理方法：裸露 DNA 直接注射、电穿孔方法
等。
化学方法：磷酸钙沉淀法、脂质体法等。
生物方法：主要是重组病毒介导的基因转移。
 病毒介导的方法具有效率高，更易应用于活
体转移，易获得稳定表达的细胞等优点。
生物方法：病毒介导的基因转移




反转录病毒载体：最广泛使用的载体，转移效率
高，且能介导基因整合。
腺病毒载体：较为安全的载体，具有更广泛的宿
主范围。
单纯疱疹病毒载体：可感染非分裂细胞，如神经
细胞。
腺相关病毒载体：具有安全性且能介导整合的双
重优点。
反转录病毒转移系统



常规的反转录病毒主要构建自小鼠 Mo-MLV
(Moloney murine leukemia virus) 。
特点：
 高效率，可达 10－100％。
 稳定性，可介导整合，不发生丢失。
 选择性，只感染分裂细胞。
Lentivirus，基于 HIV 的一种载体，具有感染
非分裂细胞的能力。
反转录病毒转移系统的组成

病毒载体：包含反转录病毒的框架的质粒。
 LTR：病毒复制、转录、整合等必须。
 ψ：包装信号。
r
 外源基因与选择基因：以外源基因与 neo
等抗药性基因取代 gag-pol-env 区域。长度
不大于 8 kb。
反转录病毒转移系统的组成

包装细胞：提供 gag、pol、env 等基因产物，保证
重组病毒的包装。
反转录病毒转移系统的流程
反转录病毒宿主范围的改变

野生型 Mo-MLV 只感染小鼠细胞，无法应用于
人类细胞的基因转移。


宿主特异性由 env 基因决定。以 env 突变株
替代，成为嗜双性病毒 (amphotropic)，可感
染人类细胞。
猿白血病病毒 env 替代，可感染人类细胞。
Lentivirus 转移系统


Mo-MLV 只感染分裂细胞，在用于肿瘤杀伤时
较为有利，但无法用于治疗大多数遗传病。
Lentivirus (慢病毒) 系统，既可以感染分裂细
胞也可以感染不分裂细胞，如神经细胞。



逆转录病毒无法透过核膜，在细胞分裂时核膜解体，
因此只能感染分裂细胞。
HIV 能够穿过核膜，可感染不分裂细胞。
来源于 HIV，构建方式类似于 Mo-MLV。
4. 基因治疗的靶向性



将目的基因选择性导入特定靶细胞，以达到最佳
治疗效果。
特定基因只有在特定细胞中表达才有效果，错误
的表达部位可能是有害的。
 治疗地中海贫血要求基因在红细胞表达。
 治疗囊性纤维化要求基因在肺上皮细胞表达。
在运用基因治疗手段杀伤肿瘤细胞时，更需要保
证靶向性。
反转录病毒的靶向



Env 基因替换，增加病毒的宿主范围。
病毒本身基因感染分裂细胞的特性。
通过配体 - 受体的识别介导病毒靶向转移。
受体介导的基因转移


通过特异性受体介导的内吞作用可以完成基因
转移。
偶联腺病毒，可促进内吞小泡的裂解，防止外
源 DNA 被溶酶体降解。
组织特异性启动子


在基因转移时无靶向性，但利用组织特
异性启动子，使外源基因只在特定组织
表达。
肝细胞特异性表达的启动子：



磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶启动子。
甲胎蛋白基因启动子。
乳腺特异性表达的启动子：


β-酪蛋白基因启动子。
乳清酸性蛋白启动子。
基因转移的安全性



安全性是基因治疗首先必须考虑的问题，特别
是反转录病毒载体介导的基因转移。
野生型病毒产生的可能性：
 目前的载体和包装细胞系统最大限度地降低
了同源重组的可能性。
导致细胞恶性转化的可能性：
 逆转录病毒与其他理化方法介导的基因转移
均有随机整合的可能，存在一定危险性。
二、基因治疗的靶细胞


在基因治疗用于肿瘤杀伤时，靶细胞往往是肿
瘤细胞本身。
 肿瘤的基因治疗必须是 in vivo 途径。
在基因治疗用于遗传病时，靶细胞则可能有多
种选择。
 可以有 in vivo 或 ex vivo 途径。不同途径选
择靶细胞时要求不同。
1. 造血干细胞途径

骨髓细胞是造血干细胞的来源，是研究最多的
基因体外转移的靶细胞。
 和多种遗传病有关，可作为直接的靶细胞。
 基因产物随血液循环全身，可以补偿其他细
胞的基因缺陷。
 具有分裂、分化潜能。可形成多种血细胞。
 易于获得、易于体外培养、易于植回。
 表达的稳定性存在一定问题。细胞的分化往
往导致外源基因表达的关闭。
造血干细胞途径



造血干细胞途径的主要流程：
骨髓→造血干细胞→体外培养→
基因导入→筛选→植入
人β-珠蛋白基因导入小鼠造血干细胞并植入，
在骨髓和血液，基因可持续表达超过 4 个月。
在临床研究时，ADA 患者接受治疗后两年可
检测到表达 ADA 的骨髓细胞。
2. 皮肤成纤维细胞途径


成纤维细胞是分化细胞，可避免分化过程对基
因表达的影响。
易于获得、体外培养和植回。



逆转录病毒载体系统在体外培养的成纤维细胞可获
得 50％ 的导入效率。
ADA 患者的皮肤成纤维细胞，经 neo-ADA 基因导
入，可检测到有活性的 ADA。
表达 NGF 的成纤维细胞植入小鼠大脑，可阻止胆
碱能神经元的退化。表达 Tyr 羟化酶的细胞植入可
缓解帕金森病症状。
3. 肝细胞途径




肝脏是人体代谢的中心，可作为治疗各种代谢
缺陷疾病的靶细胞。
正常肝细胞不分裂，对逆转录病毒不敏感。
活体转移的方法：
小鼠→肝部分切除→再生→ Ⅸ因子基因-逆
转录病毒→注射于门静脉→表达。
离体转移的方法：
高胆固醇血症患者→肝部分切除→体外培养肝
细胞→逆转录病毒导入 LDL 受体基因→门静
脉输回→患者体外 LDL 降低。
三、遗传病的基因治疗



目前已经发现数千种遗传性疾病，其中 20
多种是目前基因治疗研究的主要对象。
ADA 缺乏症、囊性纤维化、家族性高胆固
醇血症、血友病 B、血红蛋白病等。
这些疾病往往致病基因与致病机理清楚、疾
病症状严重、且无有效的预防和药物治疗手
段。
1. ADA 缺乏症


腺苷脱氨酶缺乏，T 细胞因代谢产物积累而死
亡，产生严重联合免疫缺陷症 (SCID)。
首例基因治疗临床研究的对象。
 1990 年和 1991 年，两名儿童分别接受了基
因治疗。
 T 细胞外培养→逆转录病毒导入 ADA→输回。
 T 细胞水平恢复，患者恢复正常。
 其后的多次临床实验未能取得理想效果。
2. 囊性纤维化



CFTR 基因缺陷导致离子跨膜转运的异常，临床
表现为呼吸衰竭。
靶细胞为呼吸道上皮细胞，载体主要可选择腺病
毒、AAV 或脂质体。途径为活体转移。
由于靶细胞的限制，转移效率往往不理想。
 1993 年有应用腺病毒载体进行治疗的报道，
研究报告宣传患者离子转运缺陷得到纠正。
 事实上效果的评估可能存在误差。
 其后的临床实验效果均不佳。
四、恶性肿瘤的基因治疗


治疗对象往往是恶性程度高，目前无适当治疗
手段的肿瘤。
途径：
 细胞因子转移于免疫细胞，提高其杀伤作用。
 特定基因转移肿瘤细胞，增强其免疫原性。
 抑癌基因转移。
 自杀基因或药物敏感基因的转移。
 耐药基因转移于造血干细胞，提高其对化疗
的耐受。
1. 细胞因子转移于免疫效应细胞




效应细胞包括：肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL)，细
胞毒性 T 细胞 (CTL)，淋巴细胞激活的杀伤细
胞 (LAK)。
在黑色素瘤的动物实验，TNF 或 IL-2 导入
TIL 后，经体外扩增输回，可取得明显的杀伤
效果。人体实验因靶向问题效果不佳。
CTL 具有更高的杀伤效果和特异性，IFNγ基
因导入可提高肿瘤杀伤活性。
LAK 杀伤力和特异性较低，但体外培养容易。
2. MHC 转移于肿瘤细胞




MHC 抗原 是T 细胞识别靶细胞所必须的。肿
瘤细胞往往 MHC 表达低，逃避了免疫系统的
监控。
MHC 的重新导入可增加肿瘤细胞的免疫原性。
小鼠 H-2 抗原导入肿瘤细胞，可促进小鼠免疫
系统对肿瘤的杀伤。
MHC 基因包埋于脂质体，注射到黑色素瘤患
者肿瘤部位，结果瘤体缩小。
3. 药敏自杀基因转移



HSV 胸苷激酶基因 (tk) 导入可提高肿瘤细胞
对核苷酸类似物对肿瘤细胞的杀伤。
旁观者效应：死亡的肿瘤细胞可通过细胞 细胞相互作用诱导邻近细胞发生凋亡，又称
kiss of death。
关键仍然在于靶向性。
4. 抑制原癌基因表达



抑制肿瘤细胞异常的原癌基因表达，诱导肿瘤
细胞逆转或发生细胞凋亡。
抑制方式大致有三种：
 反义 RNA、或寡核苷酸。前者往往由载体
转录而来，后者人工合成后导入。
 特异性核酶，选择性降解原癌基因 mRNA。
 RNA 干扰技术，双链或发卡状 RNA 可诱导
同源 mRNA 的降解。
IGF 反义基因导入大鼠胶质细胞瘤细胞，成瘤
率下降。
5. 抑癌基因的转移



肿瘤的形成往往与抑癌基因的失活有关，正常抑
癌基因的导入可补偿细胞的功能缺陷。
野生型 p53 转染肿瘤细胞可引发细胞凋亡。利用
腺病毒载体导入 p53 基因在治疗特定肿瘤时取得
了有限的疗效。
p53 是细胞凋亡途径的相关基因，凋亡的发生往
往存在旁观者效应。
四、病毒性疾病的基因治疗


艾滋病是基因治疗的主要研究对象。HBV、
CMV 等也有研究。
病毒性疾病治疗的方式：
 细胞内免疫：通过基因导入阻止病毒复制和
传播。
 药敏自杀基因：病毒感染诱导自杀基因表达。
1. 细胞内免疫




1988 年 Baltimore 首先提出细胞内免疫的概念，
其基本思路是赋予细胞特定基因以抑制病毒复
制或限制病毒传播。
细胞免疫的方式是多种多样的。
诱导体细胞产生游离 CD4 抗原，中和 HIV，
保护辅助性 T 细胞。
HIV tat 基因突变型可干扰正常 tat 基因的功能。
突变 tat 基因导入可抑制 HIV 复制。
细胞内免疫


反义 RNA：通过腺病毒导入 tat、rev 等的反义
基因，可以使 HIV 复制受到抑制。
核酶：针对 HIV tat、rev 等基因设计核酶，将
核酶基因导入 T 细胞，可一定程度抑制病毒复
制。
2. 药敏自杀基因



将 HSV-tk 基因构建于 HIV 的 LTR 序列下
游。LTR 序列具有 HIV 特异性启动子活性。
在 HIV 感染时 HSV-tk 表达并杀伤细胞。
胞嘧啶脱氨酶可将 5-F-胞嘧啶转变为 5-F-尿
嘧啶。
白喉毒素基因也可用作自杀基因。本身就具
有毒性作用，不需要添加其他药物。
要点

基因诊断、基因治疗的概念。

RFLP、SSCP的概念。