Transcript RNA在病原微生物检测中的应用

RNA在病原微生物检测
中的应用
摘要
主要分子检测技术原理及差异
RNA扩增技术用于病原体检测的优势
国内外病原体检测现状
RNA扩增技术在临床中应用
小结
摘要
主要分子检测技术原理及差异
RNA扩增技术用于病原体检测的优势
国内外病原体检测现状
RNA扩增技术在临床中应用
小结
病原体检测方法分类
 以看到“整个病原体”为基础的方法
• 镜检，培养
 以直接或间接看到“病原体组分－蛋白质”为基
础的方法
• 免疫学
» 胶体金，Elisa, 化学发光，etc
 以看到“病原体组分－核酸”为基础的方法
• 分子生物学
分子诊断概念和特点
 概念：利用标本中的核酸作为检测对象，对感染
性疾病、肿瘤、遗传性疾病等进行诊断和预后判
断的方法。
特点：
特异性高、灵敏度高
诊断范围广、适应性强
什么是核酸？
 链状分子
 DNA (脱氧核糖核酸)
贮存遗传信息
 RNA (核糖核酸)
遗传信息的传递途径
DNA
逆转录
转录
RNA
传递遗传信息
蛋白质
DNA vs. RNA（一）
DNA是双螺旋结构，RNA是单链结构
DNA很稳定，RNA很不稳定
DNA vs. RNA（二）
有些RNA在细胞中拷贝数很多
16S rRNA
23S rRNA
一个或几个拷贝DNA
104核糖体RNA (rRNA)
使用rRNA为靶标，可以大大提高了取样效率和检测灵敏度。
常见的RNA检测技术
NASBA（国外）
TMA（国外）
SAT（国内）
SAT技术原理
①
同一温度下，首先通过M-MLV
反转录酶产生靶标核酸（RNA）
的一个双链DNA拷贝。
②
然后利用T7 RNA多聚酶从该
DNA拷贝上产生多个（100～
①
1000个）RNA拷贝；
③
带有荧光标记的探针和这些
RNA拷贝特异结合，产生荧光。
②
该荧光信号可由荧光检测仪器
实时捕获，直观反映扩增循环
情况；
③
④
④
同时，每一个RNA拷贝再从反
转录开始进入下一个扩增循
环。
SAT与PCR技术原理比较
SAT
PCR
DNA
RNA
RT
cDNA
RT
T7
Taq
Taq
~1000
copies
DNA
RNA
30分钟内
扩增1010倍
SAT配套仪器(全自动工作站)
 样本---提取纯化RNA--- 酶反应混合液（一体化）
 全封闭
 生物安全性好
 快（48个样本/2.5小时）
摘要
主要分子检测技术原理及差异
RNA扩增技术用于病原体检测的优势
国内外病原体检测现状
RNA扩增技术在临床中应用
小结
DNA用于临床检验的不足
 “死菌检测也阳性”，与临床相关性差
 基因型与表型不吻合 (耐药检测)
 不能区分“潜伏感染”“活动性感性”
 易交叉污染
 反应易受抑制
SAT检测靶标为16SrRNA灵敏度更高
RNA在细胞中拷贝数很多，细菌中16s rRNA多达10000-20000个
一个或几个拷贝DNA
104 16s rRNA
SAT检测靶标为16SrRNA检测特异性高
- 16SrRNA具有高度保守性
- 不同来源MG的16SrRNA区域，PCR产物序列同源性100%，
准确区别不同病原体
Jensen, 1994
16SrRNA长度适中，适合做探针，检
测更准确
其编码基因长度约为1500bp, 包
含50个左右功能域
RNA诊断（TMA、SAT）具有非常高的灵敏度
和准确度
Gen-probe: RNA检测
罗氏:DNA检测
与DNA相比，RNA检测更利于疗效评估
及判愈
 DNA双链结构，较稳定，不易降解。治愈后仍有“死菌”
残留，人体内完全代谢需2-3周时间
<<中国性病诊疗指南>>中指出，如用PCR方法进行判愈，需在疗程结束后3-4周。
 RNA单链结构，易降解，病原体死亡后2-3天后完全降
解
与临床相关性好，=“培养” ，有利于疗效评估和及时判愈
 有些情况下，可以直接诊断“活动性感染”
活动性感染：指示RNA转录活跃
潜伏感染：指示RNA不转录
反应不易受抑制
能检测多种样本类型，比如尿液等，取样方便。
数据来源：M. Chernesky, D. Jang, K. Luinstra, et al. 2006. High Analytical Sensitivity and Low Rates of Inhibition May Contribute to
Detection of Chlamydia trachomatis in Significantly More Women by the APTIMA COMBO 2 Assay. J. Clin. Microbiology 44 (2): 400405.
SAT诊断技术对于病原体检测中的优势
SAT产品特点
SAT的优势
带给临床的益处
检测靶标：16SrRNA
灵敏度高,特异性更强
活菌检测
反映临床用药的疗效
结果准确度高
早期诊断检出率高
用药治疗后准确及时的判愈
扩增产物：RNA
产物易降解，减少实验室
污染风险
维护实验室质控水平
反应不易受抑制
检测样本多样化（拭子、
尿液）
取样方便
提高了医生的工作效率
减轻了病人取样带来的痛苦
扩增方式：42℃恒温
降低实验室设备要求
缩短检测时间
自动化操作更易实现
报告更快速、更准确
避免了人工操作带来的误差
摘要
主要分子检测技术原理及差异
RNA扩增技术用于病原体检测的优势
国内外病原体检测现状
RNA扩增技术在临床中应用
小结
为什么我们必须熟悉和了解RNA检测技术？（一）
 国内外RNA诊断产品监管机构认可情况
国外：FDA或CE 认证产品 （TMA）
......
国内：SFDA 认证 产品 （SAT）
沙眼衣原体（CT）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）
淋病奈瑟菌（NG）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）
解脲脲原体（UU）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）
生殖支原体（MG) 核酸检测试剂盒 （RNA恒温扩增）
结核分枝杆菌（TB）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）
肠道病毒71型（EV71）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）
柯萨奇病毒A16型（CA16）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）
肠道病毒（EV）通用型核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）
肺炎支原体（MP）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）
为什么我们必须熟悉和了解RNA检测技术？（二）
 国内外RNA诊断产品应用情况
血液筛查市场
有部分国产
传统技术
RNA诊断
RNA诊断
100%进口！
传统技术
中国
美国
其他传染病市场（优生优育：CT/NG为例）
传统技术
传统技术
RNA诊断
美国
中国
为什么我们必须熟悉和了解RNA检测技术？（三）
 RNA 用于CT/NG的检测（TMA）是目前行业公认的
“金标准”
TMA（APTIMA Combo 2） 被广泛的应用于CT/NG检测。
在美国， 85%的顶级医院使用TMA进行CT/NG检测
没有竞争对手可以超过TMA，是目前市场上最好的CT/NG检测产品
新方法学CT/NG的产品临床试验都必须选择TMA（ APTIMA Combo 2
）做参比试剂
数据来源于Internal training， Gen-probe
为什么我们必须熟悉和了解RNA扩增技术？（四）
RNA 用于TB的检测（TMA）进入多国诊疗指南
 2009：美国CDC更新NAAT法在TB实验室诊断中应用的指南 ——所有疑似
TB的初诊病人，除了做涂片之外，都必须用TMA检测至少一份样本。
（TMA获得FDA 认证可检测涂阴、涂阳标本，PCR只获得FDA 认证可检测涂阳标本）
Updated Guidelines for the Use of Nucleic Acid Ampflication Test in the
Diagnosis of Tuberculosis (2009) United States
摘要
主要分子检测技术原理及差异
RNA扩增技术用于病原体检测的优势
国内外病原体检测现状
SAT扩增技术在生殖道支原体检测优势
结论
国内唯一上市 MG诊断试剂
 结果准确
检测靶标—16SrRNA，灵敏度高，特异性强
 取样方便
女性：阴道拭子、宫颈拭子、尿液
男性：尿道拭子、尿液
 疗效判愈
检测靶标为RNA
只有“活菌”RNA才能被检测
治愈后2-3天，RNA在体内完全降解
 上市时间—2014年4月
SAT检测MG阳性的患者与测序基本一致
•
对女性尿液和宫颈拭子同时检测进行 SAT检测结果与测序结果分析如下
测序结果
合计
尿液和宫颈拭子
SAT结果
合计
阳性
阴性
阳性
43
0
43
阴性
5
249
254
48
249
297
阳性符合率=43/（43+5）*100%=89.58%
阴性符合率= 297/（297+0）*100%=100%
准确度=（43+249）/297*100%=98.32%
SFDA唯一批准可用于尿液检测的核酸
试剂
对女性同一患者的尿液样本和宫颈拭子样本同时检测与尿液和阴道拭
同时检测SAT检测结果对比分析如下
尿液和阴道拭子MG-SAT结果
合计
尿液和宫颈拭
阳性
阴性
阳性
39
4
43
阴性
5
249
254
44
253
297
子MG-SAT结
果
合计
女性同一患者样本一致性符合率=(39+249)/297*100%=96.97%
SAT检测利于用药监测与判愈
检测方法
可否监测
原因
镜检法
否
不能判断是否活菌
培养法
是
尽管活菌才能培养，但灵敏不足
金标法
否
假阴性率偏高
PCR
否
有效治疗后,细菌DNA至少需要3周降解
SAT
是
有效治疗后,细菌 RNA很快降解
用药监测和判愈
提高医院诊疗水平
降低患者诊治成本
SAT—MG检测给临床带来意义
特点
获益
兼顾拭子及尿液样本检
测
1扩大了患者类型（孕妇、未婚女性及未成年人）
2减轻病人痛苦，保护隐私（男性患者）
3降低了医生的工作量
4无创式取样，减少取样带来的风险
靶标为16SrRNA
灵敏度高、特异性强，保证了结果的准确性，提高了
医院的诊疗水平，避免了诊断错误带来的医疗纠纷
病原体死亡，RNA很快
降解: 与临床相关性好
1可以区分“死菌”、“活菌”
2避免了结果假阳性的过度治疗，减少了抗生素滥用
3降低了患者的治疗成本
4为医生临床判愈提供指导
2.5个小时出结果
为医生快速诊断提供依据，方便医生及时治疗，减轻
病人痛苦
结论
 取样方便、自动化操作、准确性高是病原体分子诊
断的发展趋势。
 RNA诊断技术，包括SAT，应用于病原微生物检测
具有明显的优势。
 我们预期，在接下来的十年里，RNA诊断技术将对
传染病的诊断带来革命性的变化。
谢谢！