Transcript 输血相关传染病的检测技术概述课件

输血相关传染病检测技术
概
述
甘肃省平凉市中心血站实验室
吴宏涛
输血相关传染病种类
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病毒性肝炎 乙、丙、丁、庚型肝炎
艾滋病
梅毒
巨细胞病毒
EBV感染
HTLV感染（美国、欧盟及我国的厦门血站开展）
疟疾
弓形体病等
输血相关传染病检测方法
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酶联免疫吸附试验ELISA*
免疫荧光法IFA
放射免疫法RIA
免疫印迹法WB*
重组免疫印迹法RIBA
颗粒凝集实验PA
病毒检测VT
病毒核酸检测NAT*
酶联免疫吸附试验ELISA
• 建于1971年。开创了运用酶标记免疫技术
进行液体标本中微量物质的测定，是检验
医学的里程碑式的发展。
• 特点：敏感性高，特异性强，操作简便，
即可测定抗原，也可测定抗体。
• 类型：间接法，直接法，双抗体夹心法，
竞争抑制法或竞争法。
免疫荧光法IFA
• 荧光抗体技术
• 荧光抗原技术
• 原理： 以特异抗原抗体反应为基础，利用荧光素作为
标记物标记已知抗原（或抗体），在一定条件下与被测标
本中相应的抗体（或抗原）结合，形成抗原抗体复合物，
此时荧光素起示踪物作用。再通过有紫外光源的荧光显微
镜就可以辨认出特异性抗原抗体复合物的存在。
放射免疫法RIA
• 一种用放射性同位素为标记物的免疫学测
定方法，具有很高的敏感性与特异性。其
原理与ELISA大致相同，所不同的是用放射
性同位素为标记物而不是用酶为标记物。
免疫印迹试验WB
• 又名蛋白印迹试验，其原理是在病毒裂解
后将不同分子量的病毒蛋白经十二烷基硫
酸钠（SDS）聚丙烯胺凝胶电泳（PAGE）
分离后，经过电转移将凝胶上的蛋白条带
转移到位硝酸纤维素膜上，以此作为抗原
进行病毒特异性抗体检测。
重组免疫印迹试验RIBA
• 原理：应用重组蛋白或合成肽（而不是直
接应用病毒裂解的蛋白）以条带形式吸附
在硝酸纤维素膜条上，当条上加入被测血
清标本温育后，如果标本中含有特异性抗
体时，则和相应抗原带结合形成抗原抗体
复合物。通过洗涤，去掉未结合的血清，
然后加入酶标IgG二抗，再温育，则酶结合
物就结合到抗原抗体复合物上，再洗涤，
加入底物。
颗粒凝集试验PA
• 是一种简便快速的筛检试验，其原理为病
毒裂解物或重组抗原包被于颗粒载体（红
细胞，乳胶颗粒，明胶颗粒），使之成为
致敏颗粒，再加入血清标本，如被测血清
中含有特异性抗体，则因抗体与抗原间桥
联作用，使致敏颗粒发生凝集。
病毒检测VT
• 可通过病毒的分离和培养后进行。培养可
通过动物培养，鸡胚培养和细胞培养进行，
其中以细胞培养方法最敏感、经济和最有
前途。病毒感染细胞后，多数病毒能引起
病变，可直接镜检观察，或通过血清学检
查作出鉴定。
病毒的核酸检测NAT
• 病毒核酸分子杂交
• 聚合酶链反应PCR
乙型肝炎的检测技术
1 乙肝病毒的生物学性状
–
–
–
–
–
形态与结构
基因结构与复制方式
抗原组成
动物模型与细胞培养
抵抗力
1.1 HBV形态与结构
• HBV结构为双层球形，
直径42nm，具有双
层衣壳。
1.2 HBV基因结构与复制方式
• HBV的DNA基因较小，仅含约3200个核苷酸，负股
DNA核苷酸序列含有4个开放读码框架（OPR）分别
称为S、C、P和X区。
• 基因及其编码的抗原：
S区基因
S基因→HBsAg
C区基因
C基因→ HBcAg
前S1 →Pre-S1
前C基因 → HBeAg
前S2基因→Pre-S2
P区基因
↓
DNA多聚酶
X区基因
↓
HBXAg
1.3 HBV抗原的组成
• 表面抗原HBsAg
– 三种形态 小球型颗粒、管形颗粒、Dane颗粒
– 亚型 各亚型均有共同抗原决定簇，称为a抗原，此外还有2组相
互排斥的亚型抗原决定簇（d/y和w/r）。按不同的组合方式构成
HBsAg四个基本亚型，即adr,adw,adr,ayw。亚型的分布有明显的
地区差异和种族相关性，汉族以adr，少数民族为ayw，欧美以
adw占优势，ayw主要分布在北非和西非。乙肝ELISA诊断试剂的
标准要求adr,adw, ayw三个亚型的最小检出量为0.5ng/L。
• 核心抗原HBcAg
– 为内衣壳部分，不易在血循环中检测，抗原性强。
• e抗原HBeAg
– 病毒复制和具有强感染性的指标。
1.4 HBV动物模型与细胞培养
• 黑猩猩是对HBV最敏感的动物。
• 目前采用的细胞培养系统是病毒DNA传染
系统。将病毒DNA导入肝癌等细胞后，病
毒可整合并复制，在细胞中表达HBV抗原。
1.5 HBV抵抗力
• HBV 的抵抗力较强，在30℃-32℃可存活6个月，
在-20℃可存活15年，对低温、干燥、紫外线
均有耐受。不能被70%乙醇灭活，因此不能用这
一常规方法来消毒。但65℃10 小时 、煮沸10 分
钟 或高压蒸气均可灭活HBV。含氯制剂、环氧乙
烷、戊二醛、0.5%过氧乙酸和碘伏等也有较好的
灭活效果。
• 消毒可以使HBV失去传染性，但是HBsAg的抗原
性仍可保留。
1.6 HBV markers during early infection
HBV
DNA
Anti-HBc
HBsAg
ALT
Infection
Infection
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
Infection
Infection
HBV
HBV DNA
DNA
Day
Day 00
Variable,
Variable, up
up to
to 31
31 days
days prior
prior to
to HBsAg
HBsAg by
by ID
ID
NAT(
NAT( 9-11
9-11 days
days by
by MP
MP NAT)
NAT)
HBsAg
HBsAg
Day
Day 59;
59; disappears
disappears Day
Day 120
120
2 乙型肝炎病原体检测
• 病毒直接标志物
– 病毒抗原：
• HBsAg、HBeAg、Pre-S1、Pre-S2
– 病毒核酸：
• HBV DNA
• 间接性标志物
– 抗病毒抗体：
• HBsAb、HBeAb、HBcAb
2.1乙肝抗原抗体的检测及结果分析
– HBsAg 阳性表示HBV 感染;抗-HBs 为保护性抗体;HBeAg阳性可作为
HBV 复制和传染性高的指标;抗-HBe 阳性表示HBV 复制水平低(但有前C
区突变者例外) ;抗-HBc 总抗体主要是抗-HBc IgG,只要感染过HBV ,无论
病毒是否被清除,此抗体均为阳性;抗-HBc IgM 阳性提示HBV 复制,多见于
乙型肝炎急性期。
– 近些年有许多实验室开展了乙肝前S1 抗原检测,前S1 抗原在病毒感染、
装配、复制和刺激机体产生免疫反应等方面起着十分重要的作用,被认为
是比HBeAg 更敏感的病毒复制标志,尤其适合无条件开展HBV DNA 检测
的医疗单位。
– 微粒子酶免分析法(MEIA) 及化学发光法虽然灵敏度更高, ,但由于价格昂
贵并未能广泛开展。
HBV 血清学标志物检测技术的发展趋势是从定性检测转
变为定量分析。
– HBV 血清学标志传统上包括HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗HBc 和抗-HBc Ig M。
2.2 HBV DNA 及其基因型、变异和cccDNA 的检测1
• HBV DNA 检测
– HBV DNA 定性和定量检测反映了病毒复制情况或水平,主要用于慢性
HBV 感染的诊断、血清HBV DNA 水平的监测,以及评价抗病毒疗效,多
使用各种PCR 技术。
• 基因型和变异的检测
– HBV 病毒可分为8 型,分别为A、B、C、D、E、F、G、H。HBV 基因
分型常用的方法有:多重PCR 法;限制性片段长度多态性分析法;线性探
针反向杂交法;全基因序列测定法等。全基因序列测序分型的结果准确
性高,尤其是能发现两种不同基因型的重组体感染,被公认为HBV 基因
分型的金标准,但比较昂贵繁琐,不适合常规应用。
– 目前的研发趋势是针对有重要临床意义的HBV 变异进行快速、定量的
多位点联合检测。
2.2 HBV DNA 及其基因型、变异和cccDNA 的检测2
• cccDNA（共价闭合DNA[covalent closed circular]） 的
检测
– cccDNA 是HBV 的原始复制模板,对乙肝病毒的复制及感
染状态的建立具有十分重要的意义。Southern blot 是检测
HBV cccDNA 的经典方法,但是该方法过程比较复杂,而且
灵敏度不高。实时荧光定量PCR 不需对PCR 反应产物进
行开盖检测,从而减少了PCR 产物污染的可能 ,可对
cccDNA 进行定量分析,多被实验室采用。
2.3 乙肝病毒微生物学检查法
• HBV感染宿主的免疫学监测
– HBV 感染的病程很大程度上取决于宿主的免疫机能,不
同病程时期的机体免疫特点、体内病毒水平和肝脏损
伤程度均不相同,临床免疫学检测对HBV 感染的各病程
阶段的免疫状态判断、指导治疗和评价疗效等方面都
有重要的意义。
– 流式细胞仪可以同时准确检测几种T淋巴细胞亚群的数
量,监控病人的免疫状态,被实验室广泛应用。
3 乙肝诊断试剂的研制进展
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•
•
抗-HBs诊断血清
血凝试验 反向被动血凝试验 RPHA
被动血凝试验PHA
放射免疫试验RIA
酶联免疫测定法（ELISA）试剂
DNA聚合酶链反应PCR
HBsAg全血金标检测试纸条
4 检测乙肝时常见问题1
• 阳性漏检的问题
– 一步法试剂的钩端效应，后带现象。试剂的标准中对一
步法试剂有3份1：64效价的HBsAg阳性血清，检测结果
要求为阳性。
– 灵敏度：灵敏度对于早期检出有利。
– 窗口期：
• 美国研究表明90%的HBsAg漏检是因为窗口期。
• 国内研究表明30%－40%是因为窗口期。
– 亚型问题
• ad型检出率要高于ay型
– 变异
• HBsAg变异类型有很多，50％－70％变异 株与抗野生株单
抗的免疫反应减弱或消失。 有部分变异株与野生株在立体
构型和抗原反应性上有明显的差异 ,因此防治困难。
4 检测乙肝时常见问题2
• 乙肝假阳性问题
– 类风湿因子RF与抗体结合，造成ELISA
和金标法的假阳性。
– 补体与IgG的Fc段结合，造成ELISA和金
标法的假阳性。
– 纤维蛋白原与酶结合物粘附于微板上洗
不掉，造成ELISA假阳性。
– 稀释液推进剂，金标法中应先加样品，
后加释释剂，否则易出现假阴性。
丙型肝炎的检测技术
1 丙肝病毒的生物学性状
– 形态与结构
– 基因结构与功能
– 丙肝病毒抗体的特点与临床
意义
– 丙肝病毒感染后ALT特点与意
义
– 丙肝病毒的生物学检测
丙肝病毒简介
• 1974年Golafield首先报告输
血后非甲非乙型肝炎。1989
年Choc等应用分子克隆技术
获得本病毒基因克隆，并命
名本病及其病毒为丙型肝炎
（HepatitisC）和丙型肝炎病
毒（HCV）。由于HCV基因
组在结构和表型特征上与人
黄病毒和瘟病毒相类似，
1991年， 国际病毒命名委员
会(ICTV)将其归为黄病毒科
丙型肝炎病毒属。
1.1 形态与结构
• HCV病毒体呈球形，直径小
于80nm（在肝细胞中为3640nm，在血液中为3662nm），为单股正链RNA
病毒，在核衣壳外包绕含脂
质的囊膜，囊膜上有剌突。
HCV体外培养尚未找到敏感
有效的细胞培养系统，但黑
猩猩对HCV很敏感。
1.2 HCV基因结构与功能
• 丙型肝炎病毒是单股正链RNA
病毒．其基因组含有一个大约
9033个核苷酸构成的大开放读
码框(0RF)，可编码3010—
3033个氨基酸的多蛋白前体，
多蛋白N端的1／4依次为核心
蛋白(c)和包膜蛋白(El和E2)等
结构蛋白，其余依次为NS2、
NS3、NS4和NS 5等非结构蛋
白 ，膜蛋白分布于病毒表面，
NS3蛋白具有蛋白酶的功能，
NS5蛋白为一依赖于RNA的
RNA多聚酶．
1.3 HCV抗体的特点与临床意义
• 1 抗核心区抗体
– 抗-C22-3核心区抗体，核心区基因保守性强，其
抗体出现较早（感染后8-10周），持续时间长，
与HCV RNA高度相关，其血液有较大的传染性。
– 抗-HCe被膜区抗体，被膜区基因（E1，
E2/NS1）变异程度高，其抗体可用于血清学分
型，用于感染的流行病学研究。
•
1.3HCV抗体的特点与临床意义
2 抗非结构区抗体
– 抗-C33C 编码C33C多肽的基因位于NS3中区，与HCV的复制有关，用于
HCV感染检测，抗-C33C 与抗-C22-3同时或稍早出现，两者对HCV感染具
有互补作用，但不能相互替代。
– 抗-C100-3 C100-3多肽编码基因位于NS4区，从感染后4-32周出现，最长可
达1年以上，对感染早期诊断意义不大，在鉴别急性、慢性感染和判断上
有一定价值。但假阳性比例较高，血清中类风湿因子，过氧化物歧化酶、
球蛋白、自身抗体等与多肽呈低亲和结合；标本放置过长或反复冻融也
可出现假阳性。
– 抗-NS5 抗-NS5 持续阳性者，ALT多明显升高，而持续阴性者，ALT多正
常或轻度升高，与疾病活动相关。
– IgM抗体 先于IgG抗体出现，对感染早期诊断及急、慢性感染具有重要意
义。
• HCV感染后标志物出现的次序：HCV RNA（2周）→ALT （4周）→
抗体-NS5 （6周）→抗-C22-3 （7周）→抗-C33C （8周）→抗-C100-3
（9周）
1.4丙肝感染后标志物的产生
2 丙肝病毒微生物学检查法
•
•
•
•
•
酶联免疫吸附实验ELISA
放射免疫测定法RIA
重组免疫印迹实验（确认实验）
血清HCV RNA检测
双抗体夹心法测HCV病毒抗原
2.1丙肝抗体ELISA检测
• 第一代抗-HCV试剂盒
采用的抗原C100-3 是HCV非结构
基因(NS3／NS4)和人超氧化物歧化酶基因嵌合后表达的融
合蛋白，灵敏度低，漏检率较高；
• 第二代抗-HCV试剂盒
在第一代基础上增加了核心区重
组蛋白C22-3和NS3区重组蛋白-C33C，虽然在灵敏度和特异
忡上有很大改善，但仍不能排除由于重组融合蛋白带来的
少数假阳性和极少数的漏检 。
• 第三代抗-HCV试剂盒
其包被抗原为HCV核心抗原、
NS3、NS4和NS5抗原，特异性超过99％，虽然目前缺乏
判断其敏感性的金标准，但对于免疫功能正常的HCV RNA
阳性感染者， 抗一HCV检出率也高于99％。
2.2丙肝病毒核酸RNA的检测
• HCV RNA检测包括定性和定量两种，定性PCR的灵敏度
高于定量PCR，因此定性PCR主要用于急慢性丙型肝炎
诊断，而定量PCR则用于疗效监测．但该方法在技术和
设备上要求较高，且费时，检出率较低，主要原因是：
HCV在血液和肝组织中的感染滴度很低，且有一定波动：
HCV RNA易被血细胞中的RNA酶降解，因此如果被检标
本保存不当(例如反复冻融)将影响检测结果：HCV RNA
还受进食的影响，易与血中脂质及脂蛋白结合，降低检
出率：另外，RT-PCR的多步骤实验中任何步骤的问题均
易影响其检出．该方法也容易因污染而出现假阳性。
• 为了使HCV RNA的规范化检测：对患者在空腹条件下抽
血，及早分离血清和进行检测，避免对标本反复冻融，
PCR的整个过程应避免RNA酶及DNA酶对标本的降解和
对模板的污染。
2.3丙肝病毒核心抗原的检测
• HCV核心抗原的检出比抗一HCV的检出约早
49 d，用双抗体夹心法定性或定量检测血清
样品中总的或游离的HCV核心抗原，方法简
单、时间短、对环境要求低以及假阳性率低
的特点。
• 用途：可用于HCV血清学转换前的早期急性
丙型肝炎诊断、抗一HCV阳性感染者的病毒
血症分析以及HCV感染者治疗前后病毒血症
追踪分析等。
• 局限性：由于方法敏感性的限制，HCV RNA
水平低于20 000 kTU／L时不适用。
3检测丙肝时常见问题
•
•
•
•
假阳性比较高
HCV基因组的变异较大
血清中抗-HCV出现较晚
不同厂家的试剂对同一标本检验结果存在
差异
梅毒螺旋体的检测技术
1 梅毒螺旋体的生物学性状
–
–
–
–
形态结构与染色
培养特性
抵抗力
梅毒螺旋体抗体
•
•
抗TP抗体
抗心磷脂抗体，称反应素
基本概念
• 1.病原性螺旋体
（Spirochetes）：是一群细长
而柔软、波状或螺旋状，运动
活泼的原核细胞微生物。主要
有钩端螺旋体，梅毒螺旋体，
雅司螺旋体和回归热螺旋体等。
• 2 .梅毒螺旋体（Treponema
pallidum）学名苍白密螺旋体，
梅毒病原体，对人有致病性的
密螺旋体中最重要的一种。
1.2 TP形态结构与染色
• TP直径0.1-0.2微米，长6-15微米，有8-14年致密
而规则的螺旋，两端尖直，运动活泼。电镜下菌
体内为轴丝，最外层为外膜，其内为胞质膜，二
者之间为鞭毛样结构。菌体有蛋白质、类脂及糖
类，外膜蛋白质中P47和轴丝P37抗原具有高度免
疫原性，在免疫学诊断和预防中可能起重要作用。
• TP用普通染料不易着色；病灶取材直接检查，可
用不染色新鲜标本在暗视野显微镜下观察形态和
运动方式。
1.3TP培养特性
• 人工体外培养尚未成功。
• 毒力株螺旋体能在家兔部分组织中繁殖，
并保持其对人及家兔的致病力，但因其分
裂繁殖缓慢，30-33小时才能分裂1次。
1.4TP抵抗力
•
梅毒螺旋体抵抗力极弱，对温度和干燥
特别敏感，离体后干燥1-2小时；血液中4℃
放置3天；加热50 ℃5分钟即灭活；对化学
消毒剂亦敏感，对青霉素、四环素、红霉
素或砷剂敏感。
1.5梅毒螺旋体抗体
• 1、抗TP抗体（P15，P17，P47）当补体存在时，可将螺
旋体杀死或溶解，也对吞噬细胞发挥调理作用。在梅毒潜
伏期即产生，一期梅毒时增高，主要是IgM型，二期梅毒
时达到高峰，有IgG和IgM型，三期梅毒略降低，主要是
IgG型，但不是保护性抗体，晚期梅毒或治疗后仍保持阳
性。
• 2、抗心磷脂抗体，称反应素reagin。同生物组织中的脂
质发生反应，反应素无保护作用，仅可用作梅毒血清学诊
断。一期梅毒时增高，二期梅毒时达到高峰，三期梅毒略
降低。
1.6TP抗原
主要为外膜蛋白抗原：p47、p45、p17、
p15。
p47具有强免疫原性，是梅毒螺旋体的主
要优势抗原，与另外两种密螺旋体有交叉反应。
p17也具有梅毒螺旋体抗原特异性，与人
类正常血成分无交叉反应。
2梅毒螺旋体检查法
• 梅毒螺旋体显微镜检查（直接查病原体）
• 主要梅毒血清学检查
– 非密螺旋体抗原试验
• 快速反应素试验RPR
• 甲苯胺红不加热血清试验TRUST
• 不加热血清反应素玻片试验USR
– 密螺旋体抗原试验
•
•
•
•
酶联免疫吸附实验ELISA
梅毒螺旋体血凝集试验TPHA
荧光密螺旋体抗体吸收试验FTA-ABS
金标快速试纸条法
2.1梅毒螺旋体检测方法的评价
• RPR：用于普查，适用于一、二期梅毒反应素检测，有假
阳性。
• FTA-ABS适用于诊断各期梅毒，敏感性和特异性都很高，
狼疮病有假阳性反应。
• TPHA：敏感性和FTA-ABS相似，但特异性更高。不用于
一期诊断，结缔组织病、麻风等可出现假阳性。
• WB：能检出其四种特异性抗体，作为确认试剂有较强的
可靠性；
• ELISA：灵敏度和特异性好；
• TRUST：同时存在较高的假阳性及假阴性问题。
3检测梅毒时常见问题
• 生物学真阳性反应
– 密螺旋体属的螺旋体均具有与梅毒螺旋体完全一样的类脂质抗原，
产生的反应素的生物学性状与梅毒一样。
• 生物学假阳性反应
– 其他非密螺旋体疾病的病原体和其他致病因素所引起的反应素反
应，如：疟疾、斑疹伤寒、猩红热、乙肝、麻风、红斑狼疮等。
• 人为假阳性反应
– 采集标本过程中注射器上有类脂质，标本运输保存不当，血液游
离出脂肪酸，人血白蛋白增高等；试剂中胆固醇含量增高；检验
人员技术水平和判断误差；反应时间过长。
艾滋病的检测技术
1 艾滋病毒的生物学性状
–
–
–
–
–
–
形态与结构
基因结构与功能
病毒复制
培养特性
抵抗力
HIV感染的免疫应答
HIV
HIV基因组包括了逆转录病毒所共有的3个
基因和6个调节蛋白基因以及5’LTR(long
terminal repeat 长末端重复序列)3’LTR，它们
从左至右分别为：
gag，pol，调节蛋白，env的顺序排列
HIV
gag基因编码的核心多肽有4个主要部分：
p25和p24、p7、p9、p17，其中p24的特异
性最高。
HIV
env基因编码糖基化的前体gp160。该蛋白
后来分为gp120和gp41。gp120为最外包膜上的
糖蛋白，gp41为跨膜蛋白。pol基因编码病毒
复制所需酶。HIV的免疫诊断使用的抗原决定
簇包括：gp41的包膜外侧区段。另外gp36为
HIV II型特异性包被抗原片断。
HIV Viremia during early infection
Peak viremia: 106-108 gEq/mL
HIV RNA (plasma)
Ramp-up viremia
HIV Antibody
DT = 21.5 hrs
HIV p24 Ag
p24 Ag EIA HIV MP-NAT -
1st gen
HIV ID-NAT -
“blip” viremia
0
11
10
Viral set-point:
102 -105 gEq/mL
2nd gen
3rd gen
16
20
22
30
40
50
60
70
80
90
100
艾滋病实验室检查法
• HIV1/2抗体检测（包括筛查和确证试验）
– 酶联免疫吸附实验ELISA
– 快速试纸条
– 明胶颗粒凝集试验PA
– 蛋白印迹实验WB
艾滋病实验室检查法
• 病毒载量检测
– 逆转录PCR系统RT-PCR
– 核酸序列依赖性扩增技术NASBA
– 分枝DNA信号放大系统bDNA
• CD4+T淋巴细胞检测
艾滋诊断试剂的研制进展
•
•
•
•
第一代抗-HIV试剂盒
第二代抗-HIV试剂盒
第三代抗-HIV试剂盒
第四代抗-HIV试剂盒
检测艾滋时常见问题
•
•
•
•
假阳性结果
假阴性结果
确证不确定结果
拖带污染