Transcript 重组DNA技术构建突变体研究蓝藻广西童装配合

利用重组DNA技术研究蓝藻叶绿素
合成、膜蛋白组装和光能传递
吴庆余
Wim Vermass
(清华大学生物科学与技术系）
(美国Arizona State Univ.光合作用研究中心)
一
1.
2.
3.
Introduction
光系统I和光系统II的组成与相关基因
叶绿素合成的两条途径与相关基因
研究目的:
• 建立Synechocystis的frxC (chlL)基因克隆和质粒
• 构建缺失 frxC (chlL)基因的突变体
• 确认frxC (chlL)基因的功能
• 利用frxC 基因突变体研究叶绿素的生物合成与光系统的装配
4. 为什么要用Synechocystis PCC6803为实验材料:
• 易于光系统I和光系统II的荧光光谱分析
• 已有PSI-less突变体
• 兼性异养
• 外源DNA自动转化和同源重组
二 实验和结果
三 结论
Light， LPOR途径
frxc
Dark，
DPOR途径
蓝藻（蓝细菌）
藻类等
被子植物
Chla
一
1.
2.
3.
Introduction
光系统I和光系统II的组成与相关基因
叶绿素合成的两条途径与相关基因
研究目的:
• 建立Synechocystis的frxC (chlL)基因克隆和质粒
• 构建缺失 frxC (chlL)基因的突变体
• 确认frxC (chlL)基因的功能
• 利用frxC 基因突变体研究叶绿素的生物合成与光系统的装配
4. 为什么要用Synechocystis PCC6803为实验材料:
• 易于光系统I和光系统II的荧光光谱分析
• 已有PSI-less突变体
• 兼性异养
• 外源DNA自动转化和同源重组
二 实验和结果
三 结论
蓝藻 blue-green algae
又称为蓝细菌 cyanobacteria
Synechocystis sp CPP 6803
原核生物
能进行光合作用
直径 为 2-3 m
二 实验和结果
1) PCR扩增1.5Kbde frxC (chlL)基因片断
2) frxC (chlL)基因的分子克隆-----构建pFQ2质粒
3) DNA体外重足构建 pFQ22质粒
4) 用pFQ22质粒转化Synechocystis野生型细胞和PSI-less,
筛选突 变体
5) 突变体DNA的PCR检测和Southern blot分析
6) 突变体生长测定和色素分析
7) 完整细胞77K荧光发射光谱
8) 光合放氧与电子传递动力学
三 结论
一
1.
2.
3.
Introduction
光系统I和光系统II的组成与相关基因
叶绿素合成的两条途径与相关基因
研究目的:
• 建立Synechocystis的frxC (chlL)基因克隆和重组质粒
• 构建缺失 frxC (chlL)基因的突变体
• 确认frxC (chlL)基因的功能
• 利用frxC 基因突变体研究叶绿素的生物合成与光系统的装配
4. 为什么要用Synechocystis PCC6803为实验材料:
• 易于光系统I和光系统II的荧光光谱分析
• 已有PSI-less突变体
• 兼性异养
• 外源DNA自动转化和同源重组
二 实验和结果
三 结论
一
1.
2.
3.
Introduction
光系统I和光系统II的组成与相关基因
叶绿素合成的两条途径与相关基因
研究目的:
• 建立Synechocystis的frxC (chlL)基因克隆和质粒
• 构建缺失 frxC (chlL)基因的突变体
• 确认frxC (chlL)基因的功能
• 利用frxC 基因突变体研究叶绿素的生物合成与光系统的装配
4. 为什么要用Synechocystis PCC6803为实验材料:
• 易于光系统I和光系统II的荧光光谱分析
• 已有PSI-less突变体
• 兼性异养
• 外源DNA自动转化和同源重组
二 实验和结果
三 结论
Questions:
Is frxC (chlL) gene in Synechosystis 6803 also
involved in the light-independent pathway of
chlorophyll biosynthesis?
What are the key factors to control the
biosynthesis of chlorophyll in two
photosystems?
How does the newly synthesized chlorophyll
regulates its assembly (binding) with
proteins.
结论
一. PCR 分子克隆 DNA体外重组 缺失 frxC (chlL)
基因突变体: (1) frxC (chlL) (2)PSI-less/ frxC
二. frxC (chlL)基因的表达产物: 不依赖于光的叶绿
素生物合成，删除frxC =设立叶绿素合成的光控开关；
三. 叶绿素合成速率与总量受两个光系统色素蛋白结合
位点控制；
四. 细胞中叶绿素合成受阻时, 两个光系统自然解体;
叶绿素重新再合成时, 进入PS有严格的顺序:
(1)PSII CP43
(2)PSI
(3)PSII CP47
色素与蛋白结合的亲和力不同
五. CP47最终完成装配时, 光合放氧功能恢复；
蓝细菌基因工程
药用基因,
降解有机毒物基因,
毒蛋白基因,
固氮基因,
光合基因等
1 生物膜
2 ATP酶
3 藻胆体
不同波长的光培养7天后的77K荧光发射光谱（激发
波长为440nm，激发光系统II）
4 1 0 nm
4 5 0 nm
6
R elative F luorescence A m plitude
4 8 0 nm
5 1 0 nm
5 3 0 nm
6 8 5 nm
4
2
0
600
650
700
W a ve le ng th(nm )
750
不同波长的光培养7天后的77K荧光发射光谱（激发
波长为580nm，激发藻蓝蛋白）
4 1 0 nm
4 5 0 nm
1 .2
R elative F luoresence A m plitude
4 8 0 nm
5 1 0 nm
1 .0
5 3 0 nm
6 8 5 nm
0 .8
0 .6
0 .4
0 .2
0 .0
600
650
700
W a v e le ng th(nm )
750
oxygen evolution
(mu mol/OD730 ml hour)
不同波长光培养下chlL-突变株的光合放氧活性（代表光
系统II活性）
4000
3000
2000
1000
0
410
450
480
510
wavelength(nm)
530
685
结论：
1.蓝细菌S.6803叶绿素合成的作用光谱
与高等植物相似之处：450nm（蓝光）和650nm（红光）
处叶绿素合成效率最高
与高等植物不同之处：450nm处叶绿素合成效率高于
650nm，而高等植物正好相反
2.红光照射下 藻蓝蛋白/叶绿素 比值增大，说明红光促使
藻蓝蛋白增多，但对叶绿素合成效率不高
3.蓝光和红光照射下藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的相对比值明
显不同，可能与蓝光下叶绿素合成效率的升高（或者红
光下叶绿素合成效率的降低）有关系。
4.红光对光系统II的活性最为有利
6
730
)
6
5
Chl(μ M/OD
Chl(μ M/OD 730 )
wild-type of cyanobacteria with frxC might have an ability to
make efficient use of little light to increase photosynthetic
efficiency for increase of biomass.
4
3
2
5
4
3
2
1
1
0
0
1
2
3
4
4 提高光合作用效率
5 DPOR分离纯化
6 frxC转基因
1
2
3
4
7 积累聚--羟基丁酸酯(PHB)的研究
PHB分子结构及性质简介
• Poly--Hydroxybutyrate
• Poly-3-Hydroxybutyrate (PHB)
•
•
•
•
•
•
•
CH3
O
 OC  CH2  C 
n
单体为：
CH3CH CH2 COOH
OH
n可取600-25,000
8 DPOR及光信号对叶绿素合成和光系统装
配的调控
信号传导研究
chlorophyll synthesis effectiveness
9、蓝细菌S.6803叶绿素合成的作用光谱
400
450
500
550
600
w a v e le ng th(nm )
650
700
750
450nm
图1 chlL-突变株（a）和ORF469-突变
株（b）的叶绿素合成作用光谱
a
80
60
40
20
0
400
100
450
500
550
600
650
700
Wavelength(nm)
450nm
Chlorophyll(rel.)(%)
100
b
Chlorophyll(rel.)(%)
Chlorophyll(rel.)(%)
100
650nm
80
60
40
20
80
0
400
60
450
500
550
600
650
700
Wavelength(nm)
40
20
0
400
图2 高等植物叶绿素合成作用光谱
450
500
550
600
Wavelength(nm)
650
700
Chlorophyll(g/OD730)
a
图3 Synechocystis 6803野生型（a），
chlL-突变株（b）和ORF469-突变株
（c）在不同光质下生长14天后单位细
胞叶绿素含量
3
2
1
0
white
450nm
530nm
660nm
Chlorophyll(g/OD730)
3
2
1
0
4
b
4
Chlorophyll(g/OD730)
>700nm
white
450nm
530nm
660nm
>700nm
c
3
2
1
0
white
450nm
530nm
660nm >700nm
Relative fluorescence amplitude
white light
450nm
530nm
660nm
>700nm
a
0.4
0.0
600
650
700
图4 Synechocystis 6803野生型（a），
chlL-突变株（b）和ORF469-突变株（c）
在不同光质下生长14天后77K荧光发射
光谱（lex=435nm）
750
b
white light
450nm
530nm
660nm
>700nm
0.4
0.0
600
650
700
Wavelength(nm)
750
Relative fluorescence amplitude
Relative fluorescence amplitude
Wavelength(nm)
0.4
0.0
600
c
white light
450nm
530nm
660nm
>700nm
650
700
Wavelength(nm)
750
94
66
94
66
43
43
30
30
20
20
47kDa
17kDa
14
14
kDa
1
2
3
A
4
5
1
2
3
4
5
kDa
B
图7 在不同光质的光照下生长时蓝细菌Synechocystis 6803
野生型和chlL-突变株类囊体膜12% SDS-PAGE结果
A. 野生型
B. chlL-突变株
1.白光 2. 450nm光（蓝光） 3. 530nm光（绿光）
4. 660nm光（红光） 5. >700nm光（远红光）
Relative fluorescence amplitude
0.5
1
0.0
600
wt
chlL
ORF469
650
700
750
Wavelength(nm)
图8 三种藻株在200mol s-1 m-2光照培养下的77K荧光发射光谱
（lex=435nm）
Pigments Concentration(g/OD730)
0.6
chlorophyll
protochlorophyllide
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0h
6h 12h/0h 3h
6h
greening
12h 24h 48h 72h
darkening
Time
图9 叶绿素消失的chlL-突变株细胞转绿12h及再次遮黑过程中
单位细胞色素含量
Relative fluorescence amplitude
0.25
0.20
0h
6h
12h
24h
0.15
0.10
0.05
0.00
600
650
700
750
Wavelength(nm)
图10 转绿过程chlL-突变株完整细胞的77K荧光发射光谱（lex=435nm）
Relative fluorescence amplitude
0.9
0h
3h
6h
12h
24h
48h
72h
0.6
0.3
0.0
600
650
700
750
Wavelength(nm)
图11 光系统部分装配chlL-突变株细胞遮黑过程中77K荧光发射光谱
（lex=435nm）
10 蓝细菌Synechocystis sp PCC 6803
糖原合成调控
（一） agp 缺失突变株的构建
-1
(units g fresh wt)
AGPase activity
AGPase酶活性
70
60
50
40
30
20
10
0
wild-type
mutant
wg
w
ag
5
OD730
4
3
a
2
1
0
0
24
48
72
96
120
144
Time (h)
S.6803 wt和agp-突变株在不含和含glucose的培
养液中的生长曲线
C aroten oid /C h l a
P C /C h l a
WT
0.18 (100)
0.40 (100)
agp -
0.15 (83)
0.16 (40)
类胡罗卜素和藻蓝素分别与叶绿素的比率
d ry w t)
60
-1
( g m g
S u c ro s e
90
30
0
WT
ag p-
WTs
ag p -s
S u crose con ten ts b efore an d after a salt sh oc k of
0.9 M N aC l of 96 h in th e agp d eletion m u ta n t
an d w ild -ty p e cells
研究的意义
选择合适的藻及合适的水环境大量培养和
收集用于工农业生产，具有很大的意义。
Cyanobacteria as sources of biomass : oil, gas, ethanol
Information on the organic solubles produced by
cyanobacteria as osmotica may facilitate the choice of
suitable cyanobacterial strains for mass culturing or other
biotechnological uses in specific ecosystems
生物工程前沿（吴庆余授课部分）
考题与参考文献
思考题：
1.
利用蓝细菌进行分子生物学研究和生物技术（生物工
程）研究有哪些优点？
2.
根据课堂讲授内容，参考有关文献，利用已经构建的
frxC-蓝细菌突变体，提出一个新的有意义的科学问题，并拟定
一个解决该问题的实验技术路线。
3.
根据课堂讲授内容，参考有关文献，提出一个蓝细菌生
物技术产品的开发思路。
4.
利用蓝细菌和重组DNA技术构建一个转基因突变体一般包
括哪些实验步骤？
参考文献
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地点：
3教3200
7:20-9:00
生物技术
展望与预测