Transcript RNA的转录后加工
第二节 RNA的转录后加工 • RNA成熟 转录后加工（post-transcriptional processing） 一 原核生物中RNA的加工： （一）原核生物 rRNA前体加工： pppA 6500nt （二）原核生物 tRNA前体加工： 1. tRNA前体两侧切断(cutting)及修剪(trimming) ： 1）5’ tRNA成熟酶 ——RNase P 蛋白：20 kDa RNase P RNA（M1RNA）：ribozyme • RNase P是识别RNA特定空间结构而非一级结构的 核酸内切酶 2）tRNA 3’-端：切割 —— RNase F 成熟 —— RNase D 2. tRNA 3’-末端CCAOH 结构的形成： （1）自身含有-CCAOH结构， 经过修剪后暴露。 （2）由tRNA核苷酰转移酶催 化形成-CCAOH ： tRNA + 2CTP+ATP tRNA -CCAOH +3PPi 3. tRNA分子中核苷酸修饰 和异构化： 例如：假尿嘧啶（）的 形成（U糖苷键移位， N1 C5） 切除tRNA前体两端多余的序列： 5’—端切除几到10个核苷酸。 RNAaseF RNAaseF RNAaseP RNAaseP RNAaseD A RNAaseD C b、末端添加：3’-端添加CCA序列。 C c、修饰：形成稀有碱基如DH 2 。 核酸内切酶的作用 核酸外切酶的作用 核苷酰转移酶的作用 异构化酶的作用 （三）原核生物 mRNA前体加工： • 细菌的mRNA大多数不需要加工，边转录边翻译。 • 少数如核糖体蛋白L10和L7/L12和RNA聚合酶的和’亚基 组成多顺反子转录产物，需要经RNase III切割后分别翻译 • 细菌mRNA的特点： ①多顺反子：一个mRNA可以翻译出不止一个蛋白产物 ②半衰期短： mRNA降解在转录开始后1min就开始了 mRNA平均半衰期为2min（脊椎动物3hr) ③ 5’端无帽子结构， 3’端只有较短的polyA结构 ④ 起始密码上游7~12bp处有一个SD序列（Shine-Dalgarno sequence)，与核糖体小亚基16S rRNA 3’端互补 二 真核生物 RNA的一般加工： （一）真核生物 rRNA前体加工： • 真核生物 rRNA前体合成、加工及核糖体装配都在核仁中 进行。受核仁小分子RNA（snoRNA）指导 • 真核生物 rRNA基因无内含子，有也不被转录。 • 真核生物 rRNA基因成簇排列： 6） 28S (1.7 10 32S (2.1 106） 45S 41S 5.8S (5 10 4） 由RNA聚合酶I转录 20S (0.9106） 18S（0.65 106 ） 5S rRNA基因簇 RNA聚合酶III转录 加工 5S （二）真核生物 tRNA前体加工： • 真核生物 tRNA基因也是成簇排列，由RNA聚合酶III转录。 • 真核生物tRNA基因：约1300个 果蝇tRNA基因：约850个 大肠杆菌tRNA基因：约60个 • 5’- tRNA成熟酶类似于原核生物RNase P（但其中的RNA不 是ribozyme），3’- 端需要多种酶。 • 真核生物tRNA自身不含有-CCAOH结构，全部由tRNA核苷 酰转移酶催化合成。 • 甲基化、假尿嘧啶化 加工 内切酶 外切酶 连接酶 tRNA的初级产物 (4.8S，100Nt) 成熟 tRNA (4S，70-80Nt) （三）真核生物 mRNA前体加工： 1. 真核生物基因是断裂基因（interrupted gene） • 1977年Roberts和Sharp提出， 1993年Nobel医学/生理学奖 • 真核生物mRNA为单顺反子，含有内含子。 • 内含子（intron) ：在RNA拼接时被切除的序列，不表达 也称为间隔序列（intervening sequence, IVS) • 外显子（exon)：成熟RNA中出现的序列部分 • 真核编码蛋白的mRNA内含子基因结构特征：GT-AG规律 即： mRNA内含子的 5’ –端都是GU；而3’ –端都是AG •核内不均一RNA（heterogenous nuclear RNA， hnRNA)： 核内加工过程中mRNA前体形成的分子量 大小不一的中间物。也称为D -RNA。 • hnRNA半寿期多数很短，几分钟至几小时。而 细胞质中的mRNA寿命较长，1~10hr 2. 真核生物mRNA加工的一般步骤： （1） 5’ 帽子的形成（capping）: 5’ 帽子：真核生物mRNA 5’ –末端特征结构，是在mRNA 5’ –末端反向接上的一个甲基化的鸟苷酸。 • 典型5’ 帽子结构：m7GpppNpN…（Cap 0） m7GpppNmpN…（Cap I） m7GpppNmpNmpN…（Cap II） m7G：G碱基7位甲基化；Nm：核糖2’-OH甲基化 • 5’ 帽子功能：稳定mRNA，不被5’ 核酸外切酶水解； 翻译起始的识别功能； 有助于mRNA转运 • cap I 结构 RNA三磷酸酶 加 5’ 帽 子 的 方 法 鸟苷酰转移酶 鸟嘌呤7-甲基转移酶 2’-O-甲基转移酶 （2） 3’ 尾巴的形成（tailing）: • 3’ 尾巴： 真核生物mRNA的3’–端大都有20 – 200个腺苷酸构 成的polyA长链。形成于核内加工时期。 • 作用：稳定3’-端，mRNA 的polyA尾巴越长，可供降解的 时间越长，寿命越长。 与核内向细胞质转移有关。 • 不是所有真核生物蛋白mRNA都有polyA尾巴，如组蛋白 RNA聚合酶II • mRNA 3’ 尾巴的形成: • 真核生物的mRNA在3’– 端存在保守的加尾信号 （AAUAAA） • RNase III识别加尾信号， RNase III 在其下游10~30 Nt处切断， mRNA脱落。 多聚腺苷 酸聚合酶 • 由多聚腺苷酸聚合酶加 上20~200Nt的polyA尾巴。 （3） mRNA的内部甲基化： m6A，在hnRNA加工中起识别作用，不是翻 译所必需。 （4）内含子的切除及RNA拼接： 核内小分子RNA与拼接体 三 . RNA拼接： • 真核RNA的内含子切除以及拼接等方式是多样化的 是基因表达调控的一个重要方面 1）类型I自我拼接 (group I self-splicing) 2）类型II自我拼接 (group II self-splicing) 3）核mRNA的拼接体的拼接 (nuclear mRNA spliceosomal) 4）核内tRNA前体的酶促拼接 (nuclear tRNA enzymatic) 5）反式拼接（trans- splicing ) 6）选择性拼接（alternative splicing ) 1） 类型I自我拼接（group I self-splicing)： • 1983年，Cech T 发现。1989年获得Nobel化学奖 • 嗜热四膜虫26s rRNA前体（413Nt），在成熟过程中无 需酶的催化，但需5’-GMP 和Mg2+ , 是由其IVS(内含子） 自我催化完成的。 G Mg 2+ 5’ 3’ 5’ 5’ OH 3’ 5’-GMP L19-IVS (395nt) 3’ Mg 2+ G (G-IVS) 2） 类型II自我拼接（group II self-splicing) • 1982，Altman S。1989年获得Nobel化学奖 • II型内含子（RNAase P的M1RNA)在催化剪接反应时不需 要鸟苷酸，但需要Mg2+ A2’-OH 5’ 3’ A2’-OH Mg 2+ 3’ 5’ A2’-OH 3’OH OH 3’ + 5’ 3’ 3’ 3) 核mRNA拼接体拼接 （nuclear mRNA splicesomal splicing) • 真核生物 hnRNA的拼接是由核内小分子RNA （snRNA）来承担。 • snRNA：100-300个Nt的RNA，U含量高的称为U系列 snRNA。 其中除了U3以外，U1 – U6都参与 hnRNA的加工。 • 拼接体（splicesome）：snRNA与蛋白构成核糖核蛋白 （snRNP），并组装成为50-60S的椭球体。 拼接体 U1 5’ CAUUCAU GUAAGUA U2 AUGAUGU UACUACA 3’ AG 外显子2 外显子1 内含子 分支点 • 拼接体 （splicesome） • 真核生物mRNA的拼接过程 • 拼接体识别、结合 hnRNA内含子5’及3’ 区域 • 外显子靠近，形成套 索RNA (lariat RNA) • 两步转酯反应，切去 内含子，连接外显子 4) 核内tRNA前体的酶促拼接 （nuclear tRNA enzymatic splicing ) 外显子1 内含子 外显子2 • 催化酵母tRNA前体 拼接的酶识别的不是 内含子的序列，而是 特定的二级结构 核酸内切酶 2’, 3’环磷键 +5’-OH 2’ 3’ P OH 环磷酸二酯酶 2’ 3’ 2’ 3’ P OH 激酶+ ATP A-P-P 连接酶 P P 磷酸酯酶 3’ P 5） 反式拼接 ： • 顺式拼接：分子内的拼接 • 反式拼接：生物体内存在的分子间的拼接方式。较少见 例如：锥虫的多种mRNA 前导序列 左侧内含子 -GU -A-AG mRNA 右侧内含子 GU | -A-AG 6）选择性拼接（alternative splicing ) ： • 选择性拼接（alternative splicing ) ： 在不同发育阶段或不同组织器官中，mRNA以不同的 方式拼接。 • 同源蛋白：经选择性拼接得到的不同蛋白产物。 例如：降钙素 和 降钙素基因相关肽 polyA polyA exon1 2 脑中 1-2-3-4（降钙素 ） 3 4 5 6 肾上腺 1-2-3-56（降钙素基因相关肽） 5’ 四 RNA编辑（ RNA 3’ editing）与化学修饰： U-OH U UUU 第一次转酯 • RNA编辑：改变RNA编码序列的方式 5’ OH • RNA编辑类型：多种 ① U的插入与删除： 3’ U U U 指导RNA (guide RNA, gRNA)为模板的转酯反应。例如： U 锥虫线粒体mRNA插入4个U，校正了基因-1移码突变 U 第二次转酯 • ② 哺乳动物载脂蛋白B （Apo B）： 5’ U 3’ 在肝脏正常合成Apo B 100。而在小肠中，CU，导致 终止密码UAA出现，肽链合成提前终止，合成Apo B 48。 ③ 脑Glu受体亚基mRNA： AI， 多个Gln Arg • RNA编辑意义：修正有害基因突变； 增加基因产物多样性； 与组织发育与分化的有关的调控方式 五 RNA再编码（RNA recoding) • RNA再编码： 对RNA编码序列阅读方式的改变 • 主要方式：利用校正tRNA。 （校正tRNA：是变异的tRNA，反密码子环碱基发生改 变，或是决定tRNA特异性即个性的碱基发生改变，从 而改变了译码规则，使错误的编码信息受到校正。消 除错义、无义和移码突变的影响。） ① 改变反密码子或决定tRNA特异性的碱基 ② 阅读二联体或四联体密码子方式，修正移码突变 第三节 RNA指导下的 RNA和DNA的合成 一 RNA复制 (RNA replication)： • 主要存在于RNA病毒中 • 以RNA为模板，合成互补RNA的过程。 • 条件： RNA复制酶催化（ RDRP ，专一性极高） 需要RNA模板、4种核糖三核苷酸和Mg2+ 复制进行的方向5’ 3’。 1. 噬菌体Q RNA的复制： • 噬菌体Q RNA： 4500Nt, 可编码3-4个蛋白。基因有重叠。 • 外壳蛋白在转录时发生通读， 则产生A1蛋白。 • 噬菌体Q RNA本身(+链) 是mRNA，可以直接翻译。 • 只有一个起始密码是开放的 复制酶亚基合成后，利用 宿主的成分装配复制酶。 2 噬菌体Q复制酶组成： 亚基 来源 功能 I（） 宿主核糖体蛋白S1 与噬菌体Q RNA结合 II（） 噬菌体编码、合成 聚合反应活性中心 III（） 宿主细胞EF-Tu因子 与底物结合，识别模 板并选择底物 IV（） 宿主细胞EF-Ts因子 稳定和亚基 • 噬菌体Q复制酶专一性极高，只作用于自身RNA，对 宿主RNA 及其它RNA无反应。并且强烈抑制核糖体与 RNA结合。 • 首先酶吸附在Q RNA3 ’端，以Q正链为模板合成负链；再 以负链为模板合成大量正链，并合成成熟所需要的蛋白。 需要HFI和HFII 速度35Nt/s 不需HFI和HFII • Q噬菌体复制特点： （1）尽可能利用宿主成分，简化自身基因组。 （2）各种蛋白成分效率高，兼具多种功能： Q复制酶: 复制专一性极高；蛋白合成阻遏物 外壳蛋白：结构蛋白；复制酶合成的调节蛋白 （3）基因表达采用时序调控方式 3 病毒RNA复制的主要方式： （1）含正链RNA的病毒：噬菌体Q、灰质炎病毒 先合成复制酶及相关蛋白 RNA复制 蛋白合成装配 （2）含负链RNA及复制酶的病毒：狂犬病病毒 利用自身携带的复制酶 合成正链RNA 合成病毒蛋白 （3）含双链及复制酶的病毒：呼肠孤病毒 以双链为模版 不对称转录出正链RNA 合成病毒蛋白 RNA复制 （4）致癌RNA病毒：一般含有两条相同正链RNA（二倍体） 先经过逆转录 合成DNA mRNA 蛋白 二 RNA 逆转录（reverse transcription） • 逆（反）转录：以RNA为模板合成DNA 1 逆转录酶 (reverse transcriptase)： • 依赖RNA的DNA聚合酶 (RNA-dependent DNA polymerase, RDDP)、 • RNA指导的DNA 聚合酶 (RNA-directed DNA polymerase) • 1970年Temin H.等发现逆转录酶 ， 证实前病毒学说。 1975年，获得诺贝尔医学/生理学奖 2 逆转录酶的性质： • 需引物（tRNA)、模板和Mg2+等二价阳离子。 • 按照5’3’合成 • 是多功能酶： （1）具有RNA指导的DNA聚合酶活力（RDDP) （2）具有DNA指导的DNA聚合酶活力(DDDP) （3）具有核糖核酸酶H(RNase H，核酸外切酶)活性 (专一水解RNA-DNA杂交分子中的RNA) • 以mRNA为模板(具有poly A尾巴，可以 poly dT为引物)合 成的互补DNA —— cDNA • cDNA的 合成 5 DDDP 3 逆转录的基本过程： 以RNA为模板（无翻译功能）→RNA-DNA杂交体→ RNase H水解去除RNA →以cDNA为模板复制DNA双链 → 利用自身长末端重复序列（long terminal repeat, LTR）整 合到宿主DNA →前病毒（provirus） → 转录 → 翻译 3 两种不同的逆转录病毒（逆病毒）： （1） 逆转录RNA病毒：HIV、致癌病毒 • 以RNA为基因携带者： 两条+链，5’端以氢键结合，有 5’帽子、3’-polyA尾巴，5’端附近带有一个宿主tRNA引物 • 生活周期： RNA（+） 逆转录 DNA(-) RNA(+) 蛋白 • 负链DNA合成的引物：tRNA （2）乙型肝炎病毒（HBV）： • 以DNA为基因携带者（带缺口的双链环状DNA） • 生活周期： DNA() 转录 RNA（+） 逆转录 DNA(-) DNA () • 负链DNA合成的引物：蛋白 两种病毒颗粒都携带逆转录酶 三 逆转座子（retroposon) • 逆转座子：转座需要以RNA为中间体，经逆转录再分散 到基因组中的可移动因子，为真核基因组特有。 1 逆转座子类型：两大家族 (1) 逆转录转座子（ retrotransposon) ： 自身编码逆转录酶和/或整合酶，包括病毒型和非传染性转 座因子，带/不带有LTR，某些有3’poly A 。 (2) 自身不编码逆转录酶的转座子： 无长末端LTR，无内含子，但有3’poly A，为RNA聚合酶II 或III的转录后完全加工的产物，经逆转录产生的逆假基因。 2 生物学意义：影响基因表达；介导基因重排；生物进化 第四节 RNA功能多样性： （1）RNA自身是遗传信息的携带者：RAN病毒 （2）RNA在遗传信息表达中起着决定性的作用: mRNA的信息中介作用、rRNA参与组成核糖体、 tRNA搬运氨基酸 （3）RNA具有催化功能：M1RNA等ribozyme （4）多种小分子RNA （snRNA、scRNA）及其蛋白复合物 参与RNA的加工和修饰；参与转录水平调节 （5）对基因表达和细胞功能具有调节作用： • 反义RNA(antisense RNA): 含有与靶mRNA序列互补而与之结合，对基因表达有 调节功能的RNA片段。因为是由基因的反义链转录形 成而得名。 因可与mRNA结合抑制翻译过程从而表现出对基因 的抑制。也称为干扰mRNA的互补RNA（interfering complementary RNA，mic RNA） 见：P569，P490 • tmRNA: 一半结构类似tRNA，并携带一个Ala；另一半可作为 mRNA翻译出一个十肽，兼有tRNA和mRNA的功能。 识别3’端残缺的mRNA，使其翻译产物带上标志 （异常十一肽尾部）。 • RNA干扰 (RNA interference, RNAi ): 一些小RNA（双链）能关闭有关基因的表达，导致基 因沉默（gene silence) （6）RNA在生物进化中具有重要意义： RNA起源学说