Transcript V第七章微生物的遗传变异与菌种（挂网）

第七章 微生物遗传变异与育种
第一节 遗传变异的物质基础
第二节 基因突变与诱变育种
第三节 基因重组与杂交育种
第四节
原生质体融合
第五节
基因工程
第六节 菌种的衰退、复壮和保藏
 本章教学目标：
 1.掌握微生物基因突变的类型、特点和机制。
 2.掌握微生物分离纯化的方法步骤。
 3.掌握营养缺陷型突变菌株的筛选方法和具体应用。
 教学重点与难点：质粒、营养缺陷型、野生型和
原养型菌株、菌种衰退、饰变和杂菌污染的区别；
优良食品发酵特性菌株的筛选；微生物分离纯化的
方法步骤。
 教学课时：7.5学时
 教学方法：多媒体教学
本章详细知识点
微生物遗传变异的基本原理
☀ 微生物遗传变异的物质基础及其存在形式。
☀ 微生物基因突变的基本原理（类型、特点和机制）。
☀ 微生物基因重组的基本原理（方式和特点）。
微生物菌种的选育
☀ 野生型微生物菌菌株分离、筛选与纯化。
☀ 微生物的诱变育种的工作程序和方法步骤。
☀ 营养缺陷型突变菌株的筛选方法和具体应用。
☀ 原生质体融合育种技术的操作程序。
☀ 基因工程育种技术的操作步骤和取得的成就。
☀ 微生物菌种退化的原因；掌握菌种复壮的方法、防止
菌种退化的措施以及菌种保藏的方式和原理。
概

述
微生物加工制造和发酵生产各种食品的过程
中，想有效大幅度提高产品产量、质量和花色品
种,首先必须选育优良的生产菌种。而优良菌种
的选育是在微生物遗传变异的基础上进行的。遗
传和变异是相互关联，同时又相互矛盾对立的两
个方面，在一定条件下，二者是相互转化的。认
识和掌握微生物遗传变异的规律是搞好菌种选育
和关键。
第一节
遗传变异的物质基础
 一、证明核酸是遗传变异物质基础
的经典实验
 二、遗传物质在细胞中的存在方式
 三、核酸的结构与功能
 四、微生物的基因组
第一节
遗传变异的物质基础
 一、证明核酸是遗传变异物质基础
的经典实验
 1. 肺炎双球菌的转化实验
 2. 噬菌体的感染实验
 3. 烟草花叶病毒的拆开与重组实验
Streptococcus pneumoniae (肺炎双球菌）
 一般很多菌株形成荚膜的是具致病性的，菌落表
面光滑（smooth），称S型，不形成荚膜的，无
致病性，菌落外观粗糙，称R型，一般由S型突
变而来 。
1.注射R 型活菌
2.注射S 型灭活
菌
3.注射S 型活菌
4.注射R型活菌
+S 型死菌
细菌培养
1.热致死S 型菌
2.R 型活菌
3.热致死S 型菌
+R 型活菌
4.R 型活菌 +S
菌抽取提物
肺炎双球菌的转化实验
肺炎双球菌的转化实验（证实转化因子存在）
转化因子的确定
 1944年，O. T.Avery等做了一个实验：

从S型活菌中分离提取荚膜多糖、脂类、
蛋白质、DNA和RNA等可能的转化因子，
分别与R型活菌混合后，注射到小鼠体内，
结果只有DNA引起R型转化，将无毒的R
型转化成有毒的S型，导致小鼠死亡。
证实了决定生物遗传变异的物质是DNA。
加S菌的RNA和RNA酶
噬菌体的感染实验
 1952 年，A. Hershey和M. Chase)利用
示踪元素对大肠杆菌及T2 噬菌体进行
了这类实验。
 用含35S 和32P 两种元素的培养基培养大肠
杆菌，然后让T2噬菌体侵染培养后的大肠
杆菌，使T2 噬菌体分别打上35S 和32P 的标
记。
噬
菌
体
的
感
染
实
验
让这两种T2 噬菌体
侵染不含标记元素
的大肠杆菌，并在
T2 噬菌体完成吸附
和侵入后，强烈搅
拌洗涤，使吸附在
菌体外表的T2 噬菌
体蛋白质外壳脱离
细胞并均匀分布，
再进行离心沉淀，
分别测定沉淀物和
上清液中的同位素
标记。
噬菌体的感染实验
 结果发现，几乎全部 35S 都在上清液中，
而几乎全部 32P 和细菌一起出现在沉淀物
中。 蛋白质外壳根本不可能进入宿主细
胞，进入宿主细胞的只有噬菌体的DNA，
且子代噬菌体例子具有同亲代一样的蛋白
质外壳。
 实验证明，有且仅有DNA携带有全部
的遗传信息。
烟草花叶病毒的拆开与重组实验
 将烟草花叶病毒拆成RNA(该病毒不含DNA)和蛋白质，并
分别对烟草进行感染实验；
 结果，只有RNA能感染烟草，且感染后的寄主，可分
离到完整的具蛋白质外壳的烟草花叶病毒。
 而后将烟草花叶病毒和霍氏车前花叶病毒拆开，在体外
分别将两种病毒的RNA和蛋白质分别结合，进行重组。
再把这些经重组的病毒分别感染烟草。
 结果从寄主分离所得的病毒蛋白质均取决于相应病毒的
RNA。
 证明了核酸(RNA)是烟草花叶病毒的遗传物质基础。
植物病毒的拆开与重组实验
1.用表面活性剂处理标
准TMV，得蛋白质；
2.用弱碱处理TMV
的变种HRV（霍氏车
前花叶病毒），得RNA；
3.重建获得杂种病毒；
*用标准TMV和HR抗血
清证实杂种病毒的外壳
来自标准TMV株。
RNA是此
病毒的遗
传物质基
础
二、遗传物质在细胞中的存在方式
（一）细胞水平
 从细胞水平看，遗传物质存在于细胞核；此外，细胞质中存在
能自我复制的遗传物质，即质粒。
 （二）亚细胞核水平
 核内DNA与组蛋白结合在一起构成染色体。
 （三）分子水平
 DNA（RNA）－－→在DNA大分子上存在着决定某些遗传性状的特
定区段，即所谓基因－－→一个基因含若干核苷酸碱基组成的
三联密码。
 四种核苷酸，按其排列组合方式的不同，可编出三联密码 43＝
64个，用于决定组成蛋白质的20种氨基酸顺序（详见课本
P121）。起始密码（AUG）和终止密码（UAA、UGA和UAG）。
三、核酸的结构与功能
S-脱氧核糖 P-磷酸 A-腺嘌呤 G-鸟嘌呤 C-胞嘧啶 T-胸腺嘧啶
DNA的结构和复制方式
DNA RNA
和
含氮碱基
碱基对
糖磷酸骨架
的
结
构
比
较
DNA的一级结构
 是指四种核苷酸(dAMP、dCMP、dGMP、
dTMP)按一定顺序排列，通过磷酸二酯键
连接形成的多核苷酸，由于核苷酸之间的
差异仅是碱基的不同，故又可称为碱基序
列。
DNA
双螺旋结构模型(double helix model)
DNA的三级结构与功能——
DNA超螺旋
 双螺旋DNA进一步扭曲盘绕则形成其三级结
构，超螺旋是DNA三级结构的主要形式。
 研究发现，所有的DNA超螺旋都是由DNA拓
扑异构酶产生的。
四、微生物的基因组
1. 基因（Gene,Mendelian factor）：是指携带有遗
传信息的DNA或RNA序列，也称为遗传因子，
是控制性状的基本遗传单位。
2. 基因组（genome）是指存在细胞或病毒中的所
有基因。
3. 真核微生物有两套基因，又称为双倍体(diploid)，
其基因组指细胞中单套染色体及其上的基因；
一个基因一般为1000bp ~ 1500bp;细菌一般是一
套基因，即单倍体（haploid）。
几种微生物与几种代表生物的基因组
（一）真核生物基因组结构特点
 包括：染色体DNA和染色体外DNA，分别存在
于细胞核内和线粒体、叶绿体中。
（二）原核生物基因组结构特点
 包括：核基因组DNA和染色体外DNA，分别存
在于细胞质和质粒中。
质粒的类型：抗药性质粒（R因子）、致育因子
（F因子）、产细菌素质粒、降解性质粒、其他
质粒
第二节 微生物的基因突变与诱变
育种
一、基因突变
（一） 几个基本概念
（二）基因突变的类型
（三） 基因突变的特点
（四）基因突变自发性和不
对称性的实验证明
（五）基因突变的机理
（六）自然界突变菌株的分
离与筛选
二、微生物的诱变育
种
（一）从自然界中分
离筛
选菌种的方法步骤
（二）诱变育种一般
步骤和方法
（三）变异菌株的初
步筛选
一、基因突变
（一） 几个基本概念
突变
基因突变
突变率
回复突变
自发突变
诱发突变
（二） 基因突变的类型
按突变体表型不同，可分以下几种类型：
（1）形态突变型（细胞、菌落、噬菌斑等形态突变）
（2）条件致死突变型（如，温度致死条件突变型）
（3）生化突变型（如营养突变型）
（4）抗性突变型
（5）产量突变型
（6）其他突变型
如，毒力突变、糖发酵
突变 、产品突变
（1）形态突变型
细胞形态突变、菌落形态突变、噬菌斑形态突变
体细胞突变
花
色
体
突
变
（2）条件致死突变型
温度敏感型突变（Ts突变株）
E. coli的某些菌株：37℃
下正常生长，不能在42℃下
生长
某些T4噬菌体突变株：
25℃下可感染其E. coli宿主，
在37℃却不能感染
（3）营养缺陷型（生化突变型）
如（组氨酸缺陷型）
his1c- 缺陷型
hisc+ 野生型
（生长谱法）
A
G
B
F
C
E
基础培养基
D
(1) 菌液1ml注入灭菌培养皿中，倒入
融化冷却至40℃～50℃的基本培养
基，摇匀放平待凝固，共做两只培
养皿。
(2)将2只培养皿等分7格并标记(如左
图)，依次放入混合氨基酸(包括核
苷酸)、混合维生素和脯氨酸(加量
要很少，否则会抑制菌的生长)，
37℃恒温箱培养24～48h，观察生
长圈，某一格内出现圆形混浊的生
长圈时，即说明是某一氨基酸、维
生素或核苷酸的缺陷型。
（4）抗性突变型
 strs表示对链霉素敏感；
 strr表示对链霉素有抗性；
penr 青霉素抗性突变
（5） 产量突变型
 产量显著高于原始菌株者，称为“正变株”
（高产株）；产量低于原始菌株者，即称
“负变株”。
筛选高产正变株的工作对生产实践极其重
要（在育种实践上）：诱变育种、重组育种、
遗传工程育种。
饰变
 饰变，微生物在不同生理阶段或在不同外界
环境条件下，在形态学和生理学方面往往出
现未涉及遗传型改变的表型变化。不属变异
范围。
 如，醋酸杆菌，37℃时，菌体形态较短，
相互连接；培养温度升高时，菌体细胞伸长；
温度降低时，菌体细胞呈柠檬型。
（三） 基因突变的特点
由于生物界遗传变异的物质基础是相同的，因此在遗传
变异的本质上都具有相同规律，这在基因突变水平上尤
其突出。
（1）不对应性
（2）自发性
（突变性状与原因无直接对应关系）
（3）稀有性
（自发突变率10-6～10-9）
（5）诱变性
（可在无人为的诱变因素处理下自发地产生 ）
（4）独立性
（某一基因突变对其他基因的突变无影响，如抗性突变）
（6）稳定性
（可通过物理、化学处理提高<10～105>突变率）（可稳定地遗传）
（7）可逆性
（突变基因相对稳定，个别细胞中可出现回复突变）
（四）基因突变自发性和不
对称性的实验证明
 1.变量彷徨试验：
实验过程：取噬菌体T1的敏感大肠杆菌对数期肉汤培养物
，用新鲜培养液稀释成浓度为103／m1的细菌悬液，然
后在甲、乙两试管内各装10m1。
把甲管中菌液分装50支小试管(每管装0.2m1)，保温24～
36h，再把各小管菌液分别倒入50个预先涂有T1的平板
上，经培养后分别计算各皿上所产生抗T1的菌落数；
乙管中的10ml菌液不经分装先整管保温24～36h，才分成
50份加到同样涂有Tl的平板上，经适当培养后，同样分
别计算各皿上产生的抗性菌落数。
1. 变量
实验
结果，来自甲管的50皿中，各皿间抗性菌落数相差极大，而来
自乙管的则各皿数目基本相同。这说明大肠杆菌抗噬菌体性状的突
变，不是由所抗环境因素——噬菌体诱导的，而是在接触噬菌体前
，某次细胞分裂过程中随机自发产生的。这一自发突变发生越早
，抗性菌落越多，反之则越少。噬菌体在此仅起着淘汰原始的未
突变的敏感菌和甄别抗噬菌体突变型的作用。
1. 变量实验
对噬菌体T1敏感
结论：1)抗性细胞的出现，在接触噬菌体之前；
2)喷上噬菌体，淘汰野生型和鉴别抗性株；
3)由于甲管高度彷徨，说明突变是随机的。
2. 涂布实验
实验过程：在12只培养皿平板上各涂以数目相
等(5×104)的噬菌体Tl的敏感大肠杆菌细胞，经
5h培养，约繁殖12.3代，在平板长出大量微菌
落(每个菌落约含5100个细菌)。取其中6皿直
接喷上Tl噬菌体，另6皿先用灭菌玻棒把微菌
落重新均匀涂布一遍，然后同样喷上相应的T1
。经培养过夜后，计算这两组培养皿板上所形
成的抗噬菌体菌落数。
结果发
现，经
涂布的
长出抗
性菌落
353个，
未经涂
布的仅
28个菌
落。
这意味
该抗性
突变发
生在未
接触噬
菌体之
前。
2. 涂布实验
结论：
 1）突变与噬菌体无关；
2）涂布使抗性菌株均匀分布；
3）抗性突变可在任何时间发生，与
噬菌体存在无关。
以上实验用统计学原理间接证明。
基本过程：把长有
数百个菌落的母
种培养皿倒置于
包有灭菌丝绒布
的木质圆柱上，
使其上沾满来自
培养皿平板上的
菌落。然后把这
一“印章”的菌
落一一接种到不
同选择性培养基
平板上。
培养后，对各平板
相同位置上菌落
作对比，即可选
出适当突变型菌
株。
3.平板影印培养试验
结果证明
：微生物
抗药性在
未接触药
物前自发
产生，这
一突变与
相应药物
环境毫不
相干。
（五） 基因突变的机理
诱发突变及其机理：
1. 碱基对的置换（例如，A-T→ G-C）
⑴ 直接引起置换的诱变剂（亚硝酸、羟胺和各种烷化剂 ）
⑵ 间接引起置换的诱变剂（碱基类似物，部分烷化剂 ）
2. 碱基颠换（例如，T-A→ A-T）
3. 移码突变 （核苷酸的增添或缺失，打乱该部位以后
的全部密码）（诱变剂为吖啶类染料，如吖啶黄、吖啶橙等）
1.碱基对的置换
 碱基对的置换可分成两个亚类：一类是DNA 链上
的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧
啶所置换，称为转换；另一类是DNA 链上的一个
嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所置
换，称为颠换
 A：T
T：A
A
T



C：G
G：C
C
G


双链DNA
单链DNA
 （实线代表转换，虚线代表颠换）
由碱基置换引起的突变型
诱变剂
物理诱变剂：紫外线、射线、γ-射线。
诱变机理：紫外线照射下，发生光化学反应，产
物主要是嘧啶二聚体和嘧啶水合物，引起DNA结
构改变，导致微生物死亡。或由于碱基转换或移
码突变，引起微生物发生突变。
偶尔，T会以烯醇式出现；C会以亚氨基形式出现
酮基
氨基
正
确
碱
基
配
对
形
成
的
氢
键
 化学诱变剂：碱基
类似物、烷化剂、
亚硝酸盐及吖啶
类
 ①碱基类似物的
置换作用
 （胸腺嘧啶T的类
似物5-溴尿嘧啶
<BU>和5-溴脱氧
尿苷<BD> ，
 腺嘌呤A的类似物
2-氨基嘌呤<AP>）
5-BU酮式与A配对
5-BU烯醇式与G配对
碱基类似物的作用是通过
活细胞代谢活动掺入
DNA 分子中，引起碱基
对置换，是间接的。
5-BU是T 的代谢类似物。
5-BU 以酮式状态时可替
代T，与A配对；5-BU 以
烯醇式状态时替代C，与
G配对；
5-BU 可通过烯醇式和酮式
结构的变化，引起碱基
对置换。
亚硝酸可直接诱发含氨基
的碱基对发生转换。
先使碱基中的氨基氧化脱
氨，从而使腺嘌呤（A）
变成次黄膘呤（H），而
后由于H 和C 配对，因
此当DNA 再次复制时，
A:T 转换为 G:C。
H:C
↗
H:C-→G:C
↗
H:C→G:C
↗
A:T→ H:T-----→A:T
亚硝酸类引起
的碱基对置换
烷化剂的诱变作用
烷化剂的化学结构都带一个或多个活性烷基，
能转移到核酸分子中电子密度极高的位置上，通
过烷化磷酸基形成烷化嘌呤和烷化嘧啶作用于正
常的DNA ，特别是经常形成烷化鸟嘌呤。
一般认为，烷化作用导致基因突变的机制：
（目前尚未定论）
① 与碱基类似物相似，引起碱基配对的错误。
② 烷基在鸟嘌呤引起脱嘌呤作用，使鸟嘌呤从
DNA 链上脱落下来，进而引起DNA 复制时碱基对
的缺失和置换。
 烷化剂的诱变作用（其活性烷基能转移到核酸
分子中电子密度极高的位置上。）
烷化
R（烷基）
7
糖
胸腺嘧啶T
烷化
R
7
烷化剂引起的碱基转换：G-C
A-T
移码突变 一种诱变剂引起DNA分子中一个
或少数几个碱基插入或缺失，使该部位后
全部遗传密码发生转录错误的一类突变。
有效诱变剂有吖啶类染料及其化合物，如:三
氨基吖啶、吖啶黄、吖啶橙、5-氨基吖啶。
普遍认为诱变机制是：吖啶类化合物的平面
型三环分子结构与一个嘌呤:嘧啶碱基对相
似，因此能嵌入两相邻DNA碱基对之间，
造成双螺旋部分解开，在DNA复制过程中，
会使链上插入或缺失一个碱基，引起移码
突变。
吖
啶
类
染
料
移
码
突
变
丫啶类化合物诱发的移码突变图示：
吖啶类
化合物
2. 自发突变的机制
1 背景辐射和环境中多因素低剂量的诱变效应
（高温、强辐射）
2 微生物自身代谢产物的诱变效应（过氧化氢）
3 互变异构效应 （G、T第六位上的<酮基烯醇式>和
A、C<亚氨基形式>的出现，导致T-G, C-A的配对错误，
造成自发突变）
4 环状突出效应（某一单链偶尔产生一小环，其上的
基因越过复制发生遗传缺失，造成突变。）
（六）自然界突变菌株的分离与筛选
调查研究，设计实验方案
1．采样
选择培养基，检出
2．增殖培养
典型菌落的选择
3．分离培养
淘汰80%-90%
4．菌落选择
再淘汰80%-90%
5．筛选
采集生态环境的确定
最适条件富集培养
选1-3株
平板划线分离或平板倾注分离
摇瓶培养，一株一瓶
一株 3-5瓶
摇床或小型发酵罐培养
全面测定和生产试验
二、 微生物的诱变育种
 微生物育种主要包括以下四方面：

① 菌种分离筛选：挑选符合生产要求的菌种，
这是选种工作的任务。

② 菌种培育：改良已有菌种生产性能，使产品
的质和量不断提高，或使之更适于工艺要求，这是
育种工作的任务。

③ 菌种的保藏： 要使生产菌种避免死亡和生
产性能的下降，这是菌种保藏工作的任务。

④ 退化菌种的复壮： 设法恢复生产性能下降
的菌种，这是菌种复壮工作的任务。
（一）从自然界中分离筛选菌种的方法步骤
采
样
增 殖 培 养
纯 种 分 离
纯
培
方法、地点、时间和周围环境记录
纯种分离就是使培养物获得单个菌落：
1．稀释分离法
2．平板划线分离法
⑴ 涂菌
⑵ 划线分离：①分步划线法
②一次划线法
3．组织分离法
养
生产性能测定
测定代谢产物或其它目的性状
①确定出发菌株
②菌种的纯化选优
↓←出发菌株的性能鉴定
③同步培养
④制备单细胞（或单孢子）悬
液
↓←活菌浓度测定
⑤诱变剂的选择与确定诱变剂
量的预试验
⑥诱变处理
⑦平板分离
↓计形态变异的菌落数，计算突变率
⑧挑取疑似突变菌落纯培养
⑨突变体的初步筛选
↓←用简单快捷的方法
⑩重复筛选
↓←摇瓶发酵试验
⑾选出突变体（根据情况进行
生产试验或重复诱变处理）
（二）诱变育种一般步
骤和方法
出发菌株
同步培养
使菌细胞处于相同或接近的生理
状态
单细胞（或单孢子）菌悬液制备
单细胞或单孢子的意义
酵母或霉菌孢子106/ml 、细
菌108/ml
诱变剂的选择及其剂量的确定
以致死率为70％～75％ 为宜
诱变处理
① 物理诱变剂
② 化学诱变剂
（
三
）
变
异
菌
株
的
初
步
筛
选
纸片培养
显色法
透明圈法
琼脂块
培养法
（
三
）
营
养
缺
陷
型
的
筛
选
及
其
应
用
1 筛选用培养基
⑴ 基本培养基：凡能满足某野生型菌株营养要
求的最低成分合成培养基；以‘[-]’表示；
⑵ 基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素
及含氮碱基之类的天然有机物质如蛋白胨、
酵母膏等，以满足该微生物的各种营养缺陷
型菌株都能生长繁殖的培养基，称完全培养
基，‘[+]’表示；
⑶ 基本培养基中有针对性地加入某一或某几种
营养缺陷成分，以满足相应营养缺陷型生长
的培养基，称补充培养基，可按所加营养成
分相应用‘[A]’、‘[B]’等来表示。
2．营养缺陷型菌株筛选的一般
方法
（1）诱变剂处理
（2）淘汰野生型菌株
① 抗生素法
② 菌丝过滤法
（3）检出营养缺陷型
（4）鉴定营养缺陷型
3.检出营养缺陷型
①点植法
② 限量补充培
养法
③ 影印接种法
4.鉴定营养缺陷型
20种氨基酸的排列编组
① 含营养缺陷型菌株的基本培养基平板的制备。
② 营养缺陷型营养类别的鉴定。
③ 缺陷型菌株单一营养因素的鉴定。
第一组 第二组 第三组
第四组 第五组
第六组
丙氨酸
精氨酸
天冬酰氨
天冬氨酸
半胱氨酸
第七组
谷氨酸
谷氨酰氨
甘氨酸
组氨酸
异亮氨酸
第八组
亮氨酸
赖氨酸
蛋氨酸
苯丙氨酸
脯氨酸
第九组
丝氨酸
苏氨酸
色氨酸
酪氨酸
缬氨酸
 将多种营养因子编组， 如：

一组：1

二组：2

三组：3

四组：4

五组：5
2
6
7
8
9
3
7
10
11
12
4
8
11
13
14
5
9
12
14
15
第三节 微生物的基因重组与杂交育种
 一、原核微生物的基因重组与育种




（一）转化（transtormation）
（二）转导（transduction ）
（三）接合（conjugation ）
（四）溶源性转变
 二、真核微生物的基因重组与育种
 （一）有性杂交
 （二）准性生殖
第三节
微生物的基因重组与杂交育种
基因重组又称遗传重组，指把两个不同性状个
体内的遗传基因转移到一起，经遗传分子重新组
合，形成新遗传型个体（重组子）的过程。
 重组是分子水平上的概念，可理解为遗传物质
分子水平上的杂交；
 一般说的杂交是细胞水平上的概念。
 杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交
一种形式。

基因重组的类型
 真核微生物中有性杂交，准性生殖；
原核微生物中有转化、转导、接合和
溶源转变等都是基因重组在细胞水平
上的反映。
一、原核微生物的基因重组与育种
（一）转化（transtormation）
 概念：受体菌（receptor）直接吸
收来自供体菌（donor）的DNA
片段，通过交换，把它整合到自
身基因组中，获得供体菌部分遗
传性状的现象。
 转化后受体菌称转化子。
特点：
1. 可使营养缺陷型和原养型、抗性菌株和
敏感菌株之间互换，还可引入新的基因。
2. 低频率发生。
3. 不同菌株间，种间或属间都可能引起转
化。
4. 受体菌必须处于感受态（最易于接受外源
DNA片段并能实现转化的生理状态）。
过程：① 从供体菌提取
转化因子的双链DNA片
段；② 转化因子与感受
态受体菌表面特定位点结
合；③ 结合位点上，转
化因子的一条单链逐步降
解，而另一条链逐步进入
受体细胞。④ 进入受体
细胞的单链与受体菌染色
体组上同源区段配对，受
体菌染色体组相应单链片
段被切除并被取代，形成
杂种DNA 区段；⑤ 受体
菌染色体复制，杂种区段
一分为二，一个恢复，一
个形成转化子。
利用转化进行育种
 操作程序：供体菌培养至对数期
离心，取上清液
供体DNA备用
加95%乙醇使DNA絮状沉淀
 培养感受态受体菌
离心，收集菌体
溶解菌体
加新鲜培养基振荡培养0.5—2h
加入供体菌DNA溶液
继续培养0.5—2h后
转化子检出
（二）转导（transduction ）
 概念：通过缺陷体为媒介，
把供体DNA片段携带进受体细
胞，通过交换与整合，使受
体菌获得供体菌这部分遗传
性状的现象，称转导。
 转导噬菌体的来源：
 1.噬菌体裂解敏感菌后释放出来；
 2.溶源性菌内的原噬菌体被诱导而释放出
来，出现几率10-6～10-5。
 特点：
 供体菌和受体菌并不直接接触，通过
转导噬菌体感染过程，把供体菌DNA
带入。
转导类型
完全缺陷型噬菌体（完全不含自身
DNA的缺陷型噬菌体）为媒介，把供体菌DNA部分片
 （而非整合）
通过缺陷型噬菌体或温和型噬菌体为媒介，将供
段误包
，当它感染受体菌时携至受体
体细菌细胞中DNA 片段携带到受体细菌细胞中，从而
细胞，使后者获得这部分遗传性状的现象，称普
使受体细菌获得供体细菌的某些遗传性状的现象，称为
遍性转导，转导频率为
10-5～10-8。（又分完全普遍
1．普遍性转导
转导。
性转导和流产普遍转导）

根据媒介噬菌体的不同，转导分普遍性转导和局限
2．局限性转导
性转导两类。 由部分缺陷的温和噬菌体侵染把
供体菌少数特定基因携至受体菌，并与后者基因
组整合、重组，获得表达的转导现象，称局限性
转导，转导频率为 10-6。
完全普遍性转导
流产普遍性转导
转导噬菌体转导后
特点：转导的遗传物质
呈单线遗传。单线转导
可保持数代，很少为稳
定性重组子。
外源DNA只位于受体细胞染色体组的同源区段，不进行
交换、整合和复制，只进行转录、转译和性状表达。
感染
开环，整合
局限性转导
部分缺陷噬菌体
不正常切离
特点：1.只能转导供体菌的个别特
定基因（一般为噬菌体整合点两
侧的基因）；2.该基因由部分缺
陷的噬菌体携带；3.缺陷噬菌体
形成过程是因为发生了“误切”或
双重溶源菌的裂解形成。
（三）接合（conjugation ）
四种接合型E. coli菌株 F因子
存在方式及其相互关系
F-（♀）
与F+接合
F+（♂）
分离或消除
F’
与
因
子
接
合
分
离
或
消
除
脱
离
与
核
染
色
体
组
整
合
不正常分离
F’（♂）
F’因子与染
色体组整合
Hfr（♂）
 概念：指供体菌通过
性菌毛与受体菌相接
触，前者传递不同长
度的单链DNA给后者，
并在后者细胞中进行
双链化或进一步与核
染色体发生交换、整
合，从而使后者获得
供体菌遗传性状的现
象。
F因子
 细菌接合现象中，细菌有
性别分化，决定因子为F因
子，凡有F因子的细胞，就
有相应的性菌毛存在。
供体F+菌株
F因子
新链合成
受体F-菌
+ 与 F- 杂 交

⑴
F
细菌染色体
 过程：①F因子的一条DNA单链在
特定位置上断裂；②断裂后的单链
逐步解开，并以另一留存的环状单
链做模板，通过模板滚动，一方面
把解开的单链以5’-端为先导通过性
菌毛推入F-细胞中；③另一方面，
第一条链的转移
供体细胞内，以滚动的环状DNA单
链做模板，重新合成一条互补的环
状单链<滚环模型>；④F-细胞中，
新双链合成外来供体DNA线状单链上也形成一
条互补的新DNA单链，随后恢复成
一环状的双链F因子；
⑤使F-菌株变成F+菌株。
F+菌株
过程：
① Hfr与F- 菌株接合，性菌毛
使两细胞相连，前者染色体
双链中一条单链在F因子连接
处发生断裂，由环状变线状，
F因子位于线状单链DNA末
端，整段线状染色体（单链）
以5’-末端引导，等速转移至
F-细胞（耗时约100min）；
②长的线状单链DNA常在转
移过程中断裂，使F-成为一
个部分双倍体，可双交换产
生稳定接合子；
⑵
Hfr与F 杂交
注意：
 越处于Hfr染色体前端的基因，进入F-的
概率越高，此性状出现在接合子中的时间
就越早。
 DNA在转移过程存在严格顺序性，每隔一
定时间利用强烈搅拌（如组织捣碎器）可
使接合中断，以获得不同数量Hfr性状的
F-接合子。
乳糖
操纵子
精
氨
酸
半胱氨酸
组氨酸
接合中断法：
选用几种特定整
合位置的Hfr菌
株与F-菌株接合，
在不同时间中断
接合，可根据F中出现的Hfr菌
株中各种性状的
时间早晚（用分
钟表示），画出
一幅比较完整的
环状染色体图。
⑶ F’ 与 F+ 杂 交
F+
F5’
Hfr
大肠杆菌接合（杂交）示意
 过程：①Hfr的F因子不正常切离
脱离染色体组时，重新形成游离但
携带一小段染色体基因的特殊F因
子(F’因子)。②携带F’因子的菌株，
其选择性状介于F+与Hfr之间，称
初生F’ 菌株；③通过F’菌株与F-菌
株接合，使后者变成F’菌株，称次
生F’ 菌株，同时获得来自初生F’
菌株的若干新遗传性状。次生F’细
胞是一个部分双倍体。
 以F’质粒传递供体菌基因的方式，
称F因子转导（F-duction）。
三种接合的结果：
F+ + F2 F+
F′ + F2F′
不同情况
Hfr + FHfr + FHfr＋F-（多数情况下）
Hfr + FHfr＋Hfr（少数情况下）
利用接合进行育种 的过程：
①两个亲本菌株的选择，一般用Hfr和F-杂交；
②Hfr和F-菌株混合培养，发生接合；
③接合子的检出。
（四）溶源性转变

宿主菌在感染温和噬菌体后，由于噬菌体
DNA整合到核DNA后，导致宿主菌某些新的遗
传性状表达，即为溶源性转变。
 溶源转变与转导在本质上的不同：
 首先温和噬菌体不携带任何供体菌的基因。
 其次噬菌体是正常的完整的，不是异常情况
下产生的缺陷型噬菌体。
溶源转变的典型例子
不 产 毒 素 的 白 喉 棒 状 杆 菌
（Lorynebatcerium diphthariac）菌株被噬
菌体侵染发生溶源化时，会变成产毒素的
致病菌株。
 其他如沙门氏菌、红霉菌、链霉菌等也具
有溶源转变的能力。
二、真核微生物的基因重组与育种
（一）有性杂交
 定义：微生物有性繁殖过程中，不同性细
胞间的接合，随之发生染色体重组，从而
产生新遗传型后代的现象，称有性杂交。
 凡能产生有性孢子的酵母菌和霉菌，都能
进行有性杂交。
生产实践举例
 有性杂交在被广泛用于优良品种的培育：
 如酒精发酵的酵母菌和用于面包发酵的酵母菌同属一种
啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的两个不同菌株，
面包酵母的特点是对麦芽糖及葡萄糖的发酵力强，产生
CO2多，生长快；而酒精酵母是产酒率高而对麦芽糖、
葡萄糖的发酵力弱，所以酿酒厂生产酒精后的酵母，不
能供面包厂作引子用。
 两者杂交，就可得到既能生产酒精，又能将其残余菌体
用作面包厂和家用发面酵母的优良菌种。
二、真核微生物的基因重组
（二）准性生殖
 类似有性生殖，但更原始。
 定义：两个非异配型核的细胞接合后，
形成异核体细胞，两核能发生低频率的
接合与交换，产生具新性状的个体的生
殖过程，叫准性生殖。
基本过程：
 1.菌丝联结
形态上无区别，但遗传性状上有差别的两个
同种亲本体细胞（单倍体）之间形成联结。
 2.形成异核体
两单倍体细胞经联结后，细胞膜和细胞
质发生融合，形成双相异核体。异核体能独立生活。
 3.核融合
异核体中的双核融合，产生双倍体杂合子核。
核融合后产生杂合子核的频率极低，如构巢曲霉和米曲霉的
为 10-5～10 -7 。
 4.体细胞重组和单倍体化
双倍体杂合子极不稳定，
有丝分裂过程中，极少数核中染色体会发生染色体交换和单
倍体化，形成极个别的具新遗传性状的单倍体杂合子。
准性重组的过程
单倍体
（A）
选择互补优良性状亲本
菌，将其孢子混合培养
单倍体
（B）
两种缺陷型亲本的
孢子都不能萌芽
细胞质融合
异核体
核融合
其分生孢
子能在基
本培养基
上生长
杂合
二倍体
体细胞重组
二倍体
分离子
多在孢子萌发
初期，孢子培养基
使孢子萌发，
用时1—2周
分离
异核体
其分生孢
子不能在
基本培养
基上生长
单倍体
体细胞重组
稳定杂合
二倍体
单倍体
分离子
检出、分离
、培养，纯
化、再鉴别。
紫外线、γ射线处理，促其染色体交换、染色体在子细胞中分配不均，染色
体缺失或畸变以及各种不同基因组合形成的单倍体杂合子，使分离子进一步增加新性状
变异的可能性。
用准性重组进行育种
 广泛用于霉菌
 ①亲本菌的选择；
 ②异核体的形成与分离；
 ③杂合二倍体的形成与分离；
 ④分离子的诱发、检出和测定。
第四节 原生质体融合育种
 一、原生质体融合原理

具不同遗传性状的两个细胞，除去细
胞壁后，其原生质体之间能在诱导剂聚乙
二醇的作用下大大提高融合的频率和重组
率（一般可达10-3—10-1）。
二、原生质体融合育种
亲本细胞，考虑单倍体，营养和抗性双重标记。
预处理，甘氨 细胞（A+B-）
酸、EDTA-Na2、
脱壁
巯基乙醇
原生质体（A+B-）
酶解时温度、稳定剂
混合
的性质和浓度对激活
酶的活性和控制原生
质体数量有影响
细胞（A-B+） 细菌C’用青霉素或溶
菌素；霉菌、酵母菌
用裂解酶、纤维素酶
脱壁
脱壁。
+
原生质体（A B ）
加融合剂（ 30%-40%PEG，分子质量6000）
（+Ca 2+）
原生质体融合
再生培养基：高渗的CM或MM 涂平板（原生质体再生：细胞壁重建、细胞质分裂至生长）
形成菌落
检出重组子菌落（A+B+）
第五节 转基因工程菌株的构建过程
1．提取目的基因
密度梯度离心法
分别提取：
①供体细胞中分离；
②通过反转录酶，由mRNA→cDNA（互
补DNA）；
③化学方法合成特定功能基因。作为载体
的细菌质粒或噬菌体核酸也可用此法。
2．处理目的基因
 根据 “设计蓝图”的要求，目的基因用专
一性很强的限制性核酸内切酶处理，获得
带特定基因并暴露出粘性末端的DNA单链
部分。必要时这种粘性末端可人工合成。
 作为载体的细菌质粒或噬菌体DNA也可用
同一种限制性核酸内切酶处理，使其形成
并暴露与目的基因相应的粘性末端。
3．体外重组 分别处理好的目的基因和细
菌质粒DNA片段（或噬菌体核酸）放入试管，
较低温度（5～6℃）下混合，用同种限制性
核酸内切酶处理的两种DNA具相同粘性末端，
相互间能形成氢键，即“褪火”。
相邻核苷酸在DNA连接酶作用下形成磷酸二
酯 键 ， 目 的 基 因 与 质 粒 DNA（ 或 噬 菌 体
DNA）完成重组，得到完整的具复制能力的
环状DNA重组体，即“杂种质粒”（或杂种
噬菌体）。
4．载体传递
 通过载体将供体遗传基因导入受体细
胞内。载体必须具有自我复制的能力。
 一般利用质粒的转化或噬菌体的转导，
将供体基因带入受体细胞内。
5．复制、表达
理想情况下，进入受体细胞内的杂种质粒
（或杂种噬菌体），可通过自我复制到扩
增，并使受体细胞表达出作为供体细胞所
固有的部分遗传性状，成为“工程菌”。
6．筛选、繁殖
分离纯净的基因功能单位还很困难，重组后
“杂种质粒”的性状是否都符合原定“设
计蓝图”，能否在受体细胞内正常增殖和
表达等，都需仔细筛选，找出所需性状个
体，才可加以繁殖和利用。
第五节
微生物菌种的保藏和复壮
一、菌种的退化与复壮
（一）常见菌种退化现象
菌体变异、孢子数量减少、孢子颜色变化
（二）菌种退化的原因
基因的负突变
回复突变
环境变化
（三）防止菌种退化的措施
1．控制传代次数
2．创造良好培养条件（抑制退化菌株）
3．利用不同类型细胞进行移种传代（单核孢子）
4．采用有效菌种保藏方法
（四）退化菌种的复壮
1.
2.
3.
4.
纯种分离
通过寄主体内生长进行复壮
淘汰已衰退的个体
改变营养条件
二、菌种的保藏
 1．低温保藏法 斜面接种，置0～4℃下
保藏，保存时间一般1～6个月；-20℃以下
超低温或干冰、液氮（-195℃）冻结保藏，
达数年。
 2．干燥保藏法 把菌种接种到适当载体，
干燥条件下保藏。主要适于细菌芽胞和霉
菌的孢子。细菌放线菌芽胞用沙土管保藏；
霉菌的孢子多用麸皮管保藏。
 3．隔绝空气保藏法
固体石蜡或15%-50%
甘油密封试管口隔绝空气。
 4．真空冷冻干燥保藏法
基本过程：培
养菌种→加菌种保护剂（食品工业用的菌
种多用牛乳作保护剂）制成菌悬液→分装、
预冻→真空、冻干→真空熔封
 5．寄主保藏法
用常规方法保藏的动植
物病原菌和病毒，例如动物和昆虫体内，
或鸡胚中。
蛋白质的合成（补充）
思考题：
 什么是微生物的遗传与变异？他们的物质基础是什么？
如何证明？
 DNA是如何复制的？
 3. 微生物有几种RNA？他们各有什么作用？
 4. 微生物微生物变异的实质是什么？微生物的基因突变
的类型有哪几种？
 5. 什么叫做杂交、转化和转导？各有什么实践意义？
 6. 自然界微生物菌种的筛选程序是什么？
 7. 诱变育种关键步骤有哪些？
 8. 什么是营养缺陷型菌株？他们的研究意义是什么？
 9. 什么叫“工程菌”？如何获得？
 10. 微生物菌种保藏方法有哪些？举例说明。
预习提示：
 重点内容：
 微生物分类单位与命名原则；
 进行菌种鉴定需要的条件及其方
法。
THE END
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