Transcript 微生物遗传学

第七章微生物遗传学
• 第一节
• 第二节
• 第三节
• 第四节
• 第五节
• 第六节
• 第七节
• 第八节
遗传的物质基础
微生物的基因组结构
质粒和转座因子
基因突变及修复
细菌基因转移和重组
真核微生物的基因重组
诱变育种
菌种保藏
遗传：
亲代与子代相似
变异：
亲代与子代、子代间不同个体不完全相同
遗传（inheritance）和变异（variation）是生命的最本质特性之一
遗传型：
生物的全部遗传因子及基因
表型（表现型）：
具有一定遗传型的个体，在特定环境条件
下通过生长发育所表现出来的形态等生物
学特征的总和。
表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。
表型饰变：
表型的差异只与环境有关
特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为
橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳。
遗传型变异（基因变异、基因突变）：
遗传物质改变，导致表型改变
特点：遗传性、群体中极少数个体的行为
（自发突变频率通常为10-6-10-9）
微生物是遗传学研究中的明星：
 微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。
 很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖。
 对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。
微生物的独特生物学特性：
（1）个体的体制极其简单；
（2）营养体一般都是单倍体；
（3）易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁
殖；
（4）繁殖速度快；
（5）易于积累不同的中间代谢产物或终产物；
（6）菌落形态特征的可见性和多样性；
（7）环境条件对微生物群体中各个个体作用的直
接性和均一性；
（8）易于形成营养缺陷型；
（9）各种微生物一般都有相应的病毒；
（10)存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方
式；
第一节 遗传的物质基础
一、证明核酸是遗传物质基础的三个
经典实验
• （一）经典转化实验（transformation）：
F.Griffith，
• 研究对象：Streptococcus pneumoniae（肺炎
双球菌）
• SIII型菌株：有荚膜，菌落表面光滑，有致
病性
• RII型菌株：无荚膜，菌落表面粗糙，无致
病性
• 1928年，Griffith进行了以下几组实验：
• （1）动物实验
对小鼠注射活RII菌或死SIII菌 ————小鼠存活
• 对小鼠注射活SIII菌 ————————小鼠死亡
• 对小鼠注射活RII菌和热死SIII菌 ———小鼠死亡
抽取心血
•
分离
活的SIII菌
Griffith
转化试验
示意
RII型活菌
SIII型活菌
健康
健康
健康
病死
健康
健康
健康
病死
健康
病死
SIII型热死菌
RII型活菌
混合培养
SIII型活菌
（2）细菌培养实验
平皿培养
热死SIII菌—————不生长
活 RII 菌—————长出RII菌
-6S 菌
热死SIII菌—————长出大量R
菌和10
II
III
+活R 菌
II
（3）S型菌的无细胞抽提液试验
活R菌+S菌无细胞抽提液——长出大量R菌
和少量S菌
以上实验说明：加热杀死的SIII型细菌细胞内可
能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入RII型
细胞并使RII型细胞获得稳定的遗传性状，转变为SIII
型细胞。
1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty从热死S
型S. pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，
并在离体条件下进行了转化试验：
•①加S菌DNA
•②加S菌DNA及DNA酶以外的酶
活R菌 •③加S菌的DNA和DNA酶
•④加S菌的RNA
•⑤加S菌的蛋白质
•⑥加S菌的荚膜多糖
长出S菌
只有R菌
只有S型细菌的DNA才能将S. pneumoniae的R型转化为S
型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转
移给R型菌株的，是遗传因子。
（二）噬菌体感染实验
• A. D. Hershey和M. Chase， 1952年
吸附
10分钟后
用捣碎器
使空壳脱离
上清液中含
15%放射性
离心
沉淀中含
85%放射性
沉淀细胞进一步培
养后，可产生大量
完整的子代噬菌体
（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中
以32S标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验
吸附
10分钟后
用捣碎器
使空壳脱离
上清液中含
75%放射性
离心
沉淀中含
25%放射性
沉淀细胞进一步培
养后，可产生大量
完整的子代噬菌体
• （2）含35S-蛋白质的一组：放射性
75%在上清液中
（三）植物病毒的重建实验
• 为了证明核酸是遗传物质，H. FraenkelConrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒
（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。
• 将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能
将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后
的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感
染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中
还能分离出正常病毒粒子。
选 用TMV和霍氏车前花叶
病毒（HRV），分别拆分
取得各自的RNA和蛋白质，
将两种RNA分别与对方的
蛋白质外壳重建形成两种杂
MTV
HRV
合病毒：
• （1）RNA（TMV） 蛋白质（HRV）
•
• （2）RNA（HRV） 蛋白质（TMV）
用两种杂合病毒感染寄主：
•
（1）表现TMV的典型症状病分离到
正常TMV粒子
•
（2）表现HRV的典型症状病分离到
正常HRV粒子。
•
上述结果说明，在RNA病毒中，遗传的物
质基础也是核酸。
HRV
MTV
二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式
（一）核酸存在的七个水平及质粒
细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或多核
细胞核水平: 原与真核生物的细胞核结构不同，核外DNA
染色体水平: 倍性(真核)和染色体数
核酸水平：在原核中同染色体水平、存在部分二倍体
DNA或RNA，复合或裸露，双链或单链
基因水平：具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信息量，
转录——翻译
密码子水平： 信息单位,起始和终止,
核苷酸水平： 突变或交换单位，四种碱基
第一节 遗传的物质基础
三、朊病毒的发现与思考
（参见 P191 和 P195）
亚病毒的一种：具有传染性的蛋白质致病因子，迄今为止尚未
发现该蛋白内含有核酸。
其致病作用是由于动物体内正常的蛋白质PrP c改变折叠状态为
PrP sc所致，而这二种蛋白质的一级结构并没有改变。
羊搔痒症(scrapie)
牛海绵状脑病(spongiform encephalopathy)
人的库鲁病(kuru)、克雅氏病(Creutzfeldt Jakob disease, CJD)等
第二节 微生物的基因组结构
（参见 P197）
一、概念
基因组（genome）：
一个物种的单倍体的所有染色体及其所包含的遗传信息的总称
原核生物（如细菌），多为单倍体（在一般情况下只有一条染色体）
真核微生物，多条染色体，例如啤酒酵母有16条染色体。有时为双倍体
第二节 微生物的基因组结构
（参见 P197）
二、微生物与人类基因组计划
人类基因组计划 （Human Genome Project）
1985年提出；
1990年正式开始实施；
2001年2月，测序工作完成；
后基因组时代（Postgenome Era）
第二节 微生物的基因组结构
二、微生物与人类基因组计划
（参见 P197）
微生物基因组测序工作是在人类基因组计划的促进下开始的，
最开始是作为模式生物，后来不断发展，已成为研究微生物学
的最有力手段。
http://www.tigr.org/tdb/mdb/mdb.html
截止到2001年4月：
43种微生物完成了全基因组测序；
100多个正在进行之中；
第二节 微生物的基因组结构
二、微生物与人类基因组计划
（参见 P197）
被选择进行全基因组测序的微生物：
1、人类基因组计划中的模式生物
a）从技术上从低等入手，建立技术、积累经验。
通过对基因组结构相对简单生物，特别是微生物基因组的测序，对大规模
测序的策略及技术进行检验，积累经验；
b）理论上利用基因组在进化上的连续性进行比较研究
通过对不同进化程度的基因组的分析、比较揭示更多的基本生物学信息。
通过研究较为简单的基因组而解答复杂的人类基因组问题。
第二节 微生物的基因组结构
二、微生物与人类基因组计划
（参见 P197）
被选择进行全基因组测序的微生物：
1、人类基因组计划中的模式生物
2、与人类生活关系密切的微生物
重要的致病菌及一些工业生产菌
3、对阐明生物学基本问题有价值的微生物
例如一些古生菌：如Methanococcus jannaschii (詹氏甲烷球菌)等，它们是微生
物世界多样性的代表，它们的序列比较有助于找出其进化关系。
第二节 微生物的基因组结构
（参见 P197-200）
三、微生物基因组结构的特点
1、原核生物（细菌、古生菌）的基因组
1）染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）；
例外：布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)的染色体是线状的
链环状的染色体在细胞中以紧密缠绕成的较致密的不规则小体形式
存在于细胞中，该小体称为拟核(nucliod)，其上结合有类组蛋白蛋
白质和少量RNA分子，使其压缩成一种手脚架形的致密结构。
第二节 微生物的基因组结构
三、微生物基因组结构的特点
（参见 P197-200）
1、原核生物（细菌、古生菌）的基因组
1）染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）；
2）基因组上遗传信息具有连续性；
基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数
一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。
参见表8-1（通常以1000bp～1500bp为一个基因进行计算）
微生物基因组DNA绝大部分用来编码蛋白质、RNA；用作为复制
起点、启动子、终止子和一些由调节蛋白识别和结合的位点等信
号序列。
第二节 微生物的基因组结构
三、微生物基因组结构的特点
（参见 P197-200）
1、原核生物（细菌、古生菌）的基因组
1）染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）；
2）基因组上遗传信息具有连续性；
3）功能相关的结构基因组成操纵子结构；
4）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝；
5）基因组的重复序列少而短；
操纵子（operon）：
古生菌的基因组在结构上类似于细菌。但是信息传递系统(复制、
功能相关的几个基因前后相连，再加上一个共同的调节基因和一组
转录和翻译)则与细菌不同而类似于真核生物。
共同的控制位点（启动子、操作子等）在基因转录时协同动作。
第二节 微生物的基因组结构
三、微生物基因组结构的特点
（参见 P197-200）
2、真核微生物（啤酒酵母）的基因组
1）典型的真核染色体结构；
啤酒酵母基因组大小为13.5×106bp，分布在16条染色体中。
2）没有明显的操纵子结构；
3）有间隔区（即非编码区）和内含子序列；
4）重复序列多；
第三节 质粒和转座因子
（参见 P200）
质粒（plasmid）：
一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，
主要存在于各种微生物细胞中。
转座因子（transposable element）：
位于染色体或质粒上的一段能改变自身位置的DNA序列，
广泛分布于原核和真核细胞中。
质粒和转座因子是细胞中除染色体以外的另外二类遗传因子
第三节 质粒和转座因子
（参见 P201）
一、质粒的分子结构
1、结构
通常以共价闭合环状(covalently closed circle，简称CCC)的
超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；
也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒；
质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb；
（细菌质粒多在10kb以内）
对于由于三种构型同时存在时造成的多带现象（提取质粒时造成
第三节 质粒和转座因子
或自然存在），可以进行特异性单酶切，使其成为一条带。
（参见 P201）
一、质粒的分子结构
2、质粒的检测
 提取所有胞内DNA后电镜观察；
 超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；
特定的质粒提取方法和
后处理使染色体和RNA
 对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点，
均被除掉。
如抗药性初步判断。
第三节 质粒和转座因子
（参见 P201）
二、质粒的主要类型
质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；
在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，
从而使宿主得到生长优势。
第三节 质粒和转座因子
二、质粒的主要类型
（参见 P202）
致育因子（Fertility factor，F因子）
抗性因子（Resistance factor，R因子）
质粒所编码
的功能和赋
予宿主的表
型效应
产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid）
毒性质粒（virulence plasmid）
代谢质粒（Metabolic plasmid）
隐秘质粒（cryptic plasmid）
第三节 质粒和转座因子
（参见 P202）
二、质粒的主要类型
1、致育因子(Fertility factor，F因子)
又称F质粒，其大小约100kb，这是最早发现的一种与大肠杆菌
的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。
F因子能以游离状态(F+)和以与染色体相结合的状态(Hfr)存
在于细胞中，所以又称之为附加体(episome)。
有关内容在讲细菌的接合作用
（conjugation）时具体介绍
携带F质粒的菌株称为F+菌株
（相当于雄性），无F质粒的
菌株称为F-菌株（相当于雌性）。
第三节 质粒和转座因子
二、质粒的主要类型
（参见 P202）
2、抗性因子（Resistance factor，R因子）
包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。
抗性质粒在细菌间的传递是细菌
产生抗药性的重要原因之一。
第三节 质粒和转座因子
（参见 P202）
二、质粒的主要类型
3、产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid）
细菌素
抗生素
抑制或杀死近缘，甚至同种不同株的细菌
较广的抗菌谱
通过核糖体直接合成的多肽类物质
一般是次级代谢产物
编码细菌素的结构基因及相关的基因一般位
一般无直接的结构基因，相关酶的基因多在
于质粒或转座子上
染色体上
细菌素结构基因、
涉及细菌素运输及发挥作用（processing）的蛋白质的基因、
赋予宿主对该细菌素具有“免疫力”的相关产物的基因
一般都位于质粒或转座子上，因此，细菌素可以杀死
同种但不携带该质粒的菌株。
第三节 质粒和转座因子
二、质粒的主要类型
（参见 P202）
3、产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid）
细菌素一般根据产生菌的种类进行命名：
大肠杆菌（E. coli）产生的细菌素为colicins（大肠杆菌素），
而质粒被称为Col质粒。
由G+细菌产生的细菌素或与细菌素类似的因子与colicins有所不同，
但通常也是由质粒基因编码，有些甚至有商业价值，例如一种乳酸
细菌产生的细菌素NisinA能强烈抑制某些G+细菌的生长，而被用于
食品工业的保藏。
第三节 质粒和转座因子
二、质粒的主要类型
（参见 P203）
4、毒性质粒（virulence plasmid）
许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒
具有编码毒素的基因，其产物对宿主（动物、植物）造成伤害。
产毒素大肠杆菌是引起人类和动物腹泻的主要病原菌之一，
其中许多菌株含有一种或多种肠毒素编码的质粒。
苏云金杆菌含有编码δ内毒素(伴孢晶体中)的质粒
根癌土壤杆菌所含Ti质粒是引起双子叶植物冠瘿瘤的
致病因子
第三节 质粒和转座因子
二、质粒的主要类型
（参见 P203）
5、代谢质粒（Metabolic plasmid）
质粒上携带有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基质
的酶，进行共生固氮，或产生抗生素（某些放线菌）等。
降解质粒：
将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用
的简单形式，环境保护方面具有重要的意义。
假单胞菌：
具有降解一些有毒化合物，如芳香簇化合物(苯)、农药
(2,4
dichlorophenoxyacetic acid)、辛烷和樟脑等的能力。
第三节 质粒和转座因子
二、质粒的主要类型
（参见 P203）
6、隐秘质粒（cryptic plasmid）
隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理的
方法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。
它们存在的生物学意义，目前几乎不了解。
在应用上，很多隐秘质粒被加以改造作为基因工程的载体
（一般加上抗性基因）
第三节 质粒和转座因子
二、质粒的主要类型
（参见 P203）
高拷贝数(high copy number)质粒
（每个宿主细胞中可以有10-100个拷贝）
———————松弛型质粒(relaxed plasmid)
低拷贝数(low copy number)质粒
（每个宿主细胞中可以有1-4个拷贝）
———————严谨型质粒(stringent plasmid)
窄宿主范围质粒(narrow host range plasmid)
（只能在一种特定的宿主细胞中复制）
广宿主范围质粒(broad host range plasmid)
（可以在许多种细菌中复制）
第三节 质粒和转座因子
（参见 P203）
三、质粒的不亲和性
自学！
质粒之间的不亲和性、以及质粒拷贝数的多少、能适应的
宿主范围的宽窄等特性均与质粒的复制控制类型有关，欲
了解详细内容请选修“微生物遗传学”。
第三节 质粒和转座因子
（参见 P204-206）
四、转座因子的类型和分子结构
五、转座的遗传学效应
自学！
概念及应用对分子生物学均十分重要，具体内容的学习请选修
“微生物遗传学”、“分子遗传学”
第四节
基因突变：
基因突变及修复
（参见 P 206）
一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变
第四节
基因突变：
基因突变及修复
（参见 P 206）
一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变
DNA损伤修复机制
基因突变
前突可以通过DNA复制而成为真正的突变，也可以重新变为原来的结构，
这取决于修复作用和其它多种因素。
基因突变是重要的生物学现象，它是一切生物变化的根源，连同
基因转移、重组一起提供了推动生物进化的遗传多变性。
自发突变
突变
诱变
环境因素的影响，DNA复制过程的偶然错误等
而导致，一般频率较低，通常为10-6-10-9 。
某些物理、化学因素对生物体的DNA进行直接
作用，突变以较高的频率产生。
第四节
基因突变及修复
一、基因突变的特点
1、特点
1）非对应性
2）稀有性
3）规律性
4）独立性
5）遗传和回复性
6）可诱变性
（参见 P 209）
一、基因突变的特点
2、实验证据
如何证明基因突变的非对应性？
三个经典实验
变量实验、涂布实验、影印实验
证明突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系！
变量实验（fluctuation analysis）Salvador Luria and Max Delbruck（1943）
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969
Newcombe的涂布实验（1949）
影印实验（replica plating ）Joshua Lederberg and Esther Lederberg（1952）
J. Lederberg is awarded the Noble Prize in
Medicine and Physiology in 1958
第四节
基因突变及修复
二、常见的微生物突变类型
基因型
（参见 P 207-209）
表型
这里主要介绍几种常用的由于基因突变而造成微生物表型变化
的突变型及其分离
第四节
基因突变及修复
二、常见的微生物突变类型
（参见 P 207-209）
1）营养缺陷型（auxotroph）
一种缺乏合成其生存所必须的营养物（包括氨基酸、维生素
、碱基等）的突变型，只有从周围环境或培养基中获得这些
营养或其前体物（precursor）才能生长。
表型判断的标准：
在基本培养基上能否生长
营养缺陷型是微生物遗传学研究中重要的选择标记和
育种的重要手段
第四节
基因突变及修复
二、常见的微生物突变类型
（参见 P 207-209）
1）营养缺陷型（auxotroph）
特点：
在选择培养基（一般为基本培养基）上不生长
负选择标记
突变株不能通过选择平板直接获得
1
）
营
养
缺
陷
型
（
auxotroph
）
实
验
步
骤
见
影印平板（Replica plating）法是Lederberg夫妇在1952年建立
P 208
第四节
基因突变及修复
二、常见的微生物突变类型
（参见 P 207-209）
1）营养缺陷型（auxotroph）
营养缺陷型的表示方法：
基因型：
所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示：hisC
（组氨酸缺陷型，其中的大写字母C同一表型中不同基因的突变）
表型：
同上，但第一个字母大写，且不用斜体：HisC
在具体使用时多用hisC-和hisC+，分别表示缺陷型和野生型。
第四节
基因突变及修复
二、常见的微生物突变类型
（参见 P 207-209）
2）抗药性突变型（resistant mutant）
基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性。
特点：
正选择标记
（突变株可直接从抗性平板上获得-----在加有相应抗生素的
平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。）
表示方法： 所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”表示
strr 和 strs 分别表示对链霉素的抗性和敏感性
第四节
基因突变及修复
二、常见的微生物突变类型
（参见 P 207-209）
3）条件致死突变型（conditional lethal mutant）
在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死
效应的突变型。
常用的条件致死突变是温度敏感突变，用TS（temperature sensitive）
表示，这类突变在高温下（如42℃）是致死的，但可以在低温（如
25-30℃）下得到这种突变。
特点：
负选择标记
这类突变型常被用来分离生长繁殖必需的突变基因
第四节
基因突变及修复
二、常见的微生物突变类型
（参见 P 207-209）
4）形态突变型（morphological mutant）
造成形态改变的突变型
特点：
非选择性突变
突变株和野生型菌株均可生长，但可从形态特征上进行区分。
举例：
产蛋白酶缺陷突变株的筛选
菌落颜色变化
形成芽孢缺陷菌株
细胞水平上的形态突变，突变株的检出更加困难。
第四节
基因突变及修复
二、常见的微生物突变类型
（参见 P 207-209）
5）其它突变类型
毒力、生产某种代谢产物的发酵能力的变化等在实际应用
中具有重要意义突变类型一般都不具有很明显或可直接检测
到的表型。其突变株的获得往往需要较大的工作量。
第四节
基因突变及修复
三、诱变剂与致癌物质——Ames试验
（参见 P 212）
很多种化学物质，能以各种机制导致DNA的突变
a）利用各种诱变剂获得各类遗传突变，进行诱变育种；
b）对有害微生物进行控制；
c）危害人类自身的健康
“生物化学统一性”法则：
人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，
能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于
人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其
他不良的后果。
诱变剂的共性原则：
化学药剂对细菌的诱变率
与其对动物的致癌性成正比
超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用
90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用
美国加利福尼亚大学的Bruce Ames教授于1966年
发明，因此称为Ames试验
具体操作：检测鼠伤寒沙门氏菌
(Salmonella typhmurium)组氨酸营养缺陷型菌
株(his-)的回复突变率
回复突变(reverse mutation或back mutation)：
突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变
得到恢复，这种第二次突变称为回复突变。
Ames试验
证明Ames试验重要性的应用实例：
国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停”，由于其
药效显著，在60-70年代十分流行
但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，而且生产畸形儿的
妇女大多曾服用“反应停”，后来采用Ames试验发现这种物质的确
具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用
但如果能在这种药物上市之前就进行Ames试验检测，那么这种大
量出生畸形儿的悲剧完全可以避免
第四节
基因突变及修复
三、诱变剂与致癌物质——Ames试验
（参见 P 212）
由于生物体内、体外可能存在的差异，可在体外加入哺乳
动物（如大鼠）微粒体酶系统，使待测物活化，使Ames试
验的准确率达80-90%。
第四节
基因突变及修复
有关基因突变及修复的其它内容自学！
第五节 细菌基因转移和重组
（参见 P 215）
细菌的三种水平基因转移形式
接合
转导
自然转化
接合 (conjugation)：
细胞与细胞的直接接触（由F因子介导）
转导(transduction)：
由噬菌体介导
自然遗传转化(natural genetic transformation)：
游离DNA分子 + 感受态细胞
一、细菌的接合作用(conjugation)
（参见 P 215）
通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传
信息的转移和重组过程
1
1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm
细菌的多重营养缺陷型杂交实验
参见P 216
中间平板上长出的原养型菌落
是两菌株之间发生了遗传交换
和重组所致！
证实接合过程需要细胞间的直接接触的
“U”型管实验（ Bernard Davis，1950 ）
参见P 216
2. 机制
参见P 217
(大肠杆菌的接合机制)
接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导
F因子的分子量通常为5×107，上面有编码细菌产生性菌
毛（sex pili）及控制接合过程进行的20多个基因。
含有F因子的细胞：“雄性”菌株（F+），其细胞表面有性菌毛
不含F因子的细胞：“雌性”菌株（F-），细胞表面没有性菌毛
F因子为附加体质粒
既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上
F因子的四种细胞形式
(参见P202)
a）F-菌株， 不含F因子，没有性菌毛，但可以通过 接合作用接收
F因子而变成雄性菌株（F+）；
b）F+菌株， F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。
c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。
d）F′菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，
形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因
子。 细胞表面同样有性菌毛。
1） F+×F-杂交
（参见P 215）
F+菌株的F因子向F-细胞转移，但含F因子的宿主细胞
的染色体DNA一般不被转移。
杂交的结果：给体细胞和受体细胞均成为F+细胞
理化因子的处理可将F因子消除而使F+菌株变成F-菌株
（参见P 217）
2）Hfr ×F-杂交
Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移
过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重
组，由此而得名为
高频重组菌株。
染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会
就越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。
F因子不易转入受体细胞中，故Hfr×F杂交后的受体细胞（或称接合子）大多
数仍然是F-。
（参见P218）
细胞基因的这种转移过程又常称为性导（sexduction）、F因子转导
3）F′×F-杂交
（参见P218）
（F-duction），或F因子媒介的转导（F-mediated transduction）。
Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，
形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，
特称为F′因子。
F′×F-与F+×F-的不同：给体的部分染色
体基因随F′一起转入受体细胞
a）与染色体发生重组；
b）继续存在于F′因子上，形成一种部分二倍体；
二、细菌的转导（transduction）
（参见P218）
由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式：
一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中
能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA
带到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体
细菌转导的二种类型：
普遍性转导
局限性转导
1、普遍性转导（generalized transduction）
（参见P218）
噬菌体可以转导给体染色体的任何部分到受体细胞中的转导过程
(1) 意外的发现
1951年，Joshua Lederberg和Norton Zinder为了证实大肠杆菌以外
的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型
的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验：
用“U”型管进行同样的实验时，在给体和受体细胞
不接触的情况下，同样出现原养型细菌！
沙门氏菌LT22A是携带P22噬菌体的溶源性细菌
另一株是非溶源性细菌
（参见P218）
基因的传递很可能是由可透过“U”型管滤板
的
P22噬菌体介导的
一个表面看起来的常规研究却导致
一个惊奇和十分重要发现的重要例证！
（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）
(2)
转
导
模
型
（参见P219）
转导噬菌体为什么“错
”
将宿主的DNA包裹进去?
噬菌体的DNA包装酶也能识别染色体DNA上类似pac的位点
并进行切割，以“headful”的包装机制包装进P22噬菌体外壳，
形成只含宿主DNA的转导噬菌体颗粒（假噬菌体）。
因为染色体上的pac与P22 DNA的pac序列不完全相同，
利用效率较低，这种“错装”机率一般仅约10-6-10-8
普遍性转导的基本要求：
（参见P219）
形成转导颗粒的噬菌体可以是温和的也可以是烈性的，但必须
具有能偶尔识别宿主DNA的包装机制并在宿主基因组完全降解
以前进行包装。
DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA，
普遍性转导的三种后果：
而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。
特点：在选择培养基平板上形成微小菌落
转导DNA不能进行重组和复制，但其
携带的基因可经过转录而得到表达。
流产转导（abortive transduction）
进入受体的外源DNA通过与细胞染色体
的重组交换而形成稳定的转导子
外源DNA被降解，转导失败。
2、局限性转导（specialized transduction）
（参见P219）
温和噬菌体感染
整合到细菌染色体的特定位点上
宿主细胞发生溶源化
溶源菌因诱导而发生裂解时，
在前噬菌体二侧的少数宿主
基因因偶尔发生的不正常切
割而连在噬菌体DNA上
部分缺陷的温和噬菌体
把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中
2、局限性转导（specialized transduction）
温和噬菌体λ裂解时的
不正常切割：包含gal或bio基因
（几率一般仅有10-6）
2、局限性转导（specialized transduction）
（参见P219）
局限性转导与普遍性转导的主要区别：
a）被转导的基因共价地与噬菌体DNA连接，与噬菌体DNA一起
进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而普遍性转导包装的
可能全部是宿主菌的基因。
b）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因
导入受体，故称为局限性转导。而普遍性转导携带的宿主基
因具有随机性。
溶源转变（lysogenic conversion）：
一个与转导相似又不同的现象
温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌体的基因
整合到宿主染色体上，而使后者获得了新性状的现象。
溶源转变与转导的不同？
a）不携带任何供体菌的基因；
b）这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的；
三、细菌的遗传转化（genetic transformation）
（参见P220）
定义：同源或异源的游离DNA分子(质粒和染色体DNA)被自然
或人工感受态细胞摄取，并得到表达的水平方向的基因转移过程
感受态细胞：具有摄取外源DNA能力的细胞
（competent cell）
自然遗传转化（natural genetic transformation）
人工转化（artificial transformation）
自然感受态与人工感受态的不同？
（参见P220）
自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，
受细菌自身的基因控制；
人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有
摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内。
（该过程与细菌自身的遗传控制无关！）
1、自然遗传转化（简称自然转化）
（参见P220）
1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）
的转化现象
目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力
进行自然转化，需要二方面必要的条件：
建立了感受态的受体细胞
外源游离DNA分子
自然转化过程的特点：
a）对核酸酶敏感；
b）不需要活的DNA给体细胞；
c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化（DNA）
给体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系；
d）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多；
提高质粒的自然转化效率的二种方法：
1）使质粒形成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有
活性的质粒的机率大大提高；
2）在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或将质粒转
化进含有与该质粒具有同源区段的质粒的受体菌-------重组获救
转染(transfection)：
（参见P222）
噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒
特点：
提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入细胞
并表达后产生完整的病毒颗粒。
现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染
自然遗传转化的进行涉及到细菌染色体上几十个
基因的功能及彼此间的相互协调，因此被认为是
名副其实 的细菌水平基因转移途径。
目前的研究热点：
1）细菌为什么要耗费如此多的染色体遗传资源来进行自然转化，
即该过程的生物学意义到底何在？它对细菌自身有什么好处？
（人们已提出了一些假说，但均不圆满）
2）自然转化过程的很多细节仍不清楚，包括细菌如何协调感受态
的建立，外源DNA进入和重组的具体过程等等
3）细菌中具有自然转化能力的范围，到底有那些菌具有自然
转化能力？
4）转化DNA的来源和在自然环境中发生的自然转化
接合 (conjugation)：
细胞与细胞的直接接触（由F因子介导）
转导(transduction)：
由噬菌体介导
自然遗传转化(natural genetic transformation)：
游离DNA分子 + 感受态细胞
“接合” “转导” 及“自然转化”这三种在自然界
存在的细菌遗传重组过程各自的特点：
a）外源DNA的来源及进入途径有差异；
b）决定因素也各有不同；
如何设计实验对三种途径进行区分？
2、人工转化
（参见P222）
在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，
是基因工程的奠基石和基础技术。
不是由细菌自身的基因所控制；
用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一
种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。
用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。
质粒的转化效率高；
四、基因定位和基因组测序
（参见P223）
基因定位：通过遗传重组等手段确定不同的基因在染色体上的
位置及相对距离，从而获得遗传图谱。
细菌基因转移的三种方式（接合、转导、转化）都可以用来
进行细菌基因组作图。
基因组测序：测定待测生物基因组的所有碱基排列顺序，并
在此基础上对遗传信息进行研究和分析。
四、基因定位和基因组测序
（参见P224）
1、中断杂交（interrupted mating）技术
利用Hfr×F-的接合过程，在不同时间取样，并把样品猛烈搅拌以
分散接合中的细菌，然后分析受体细菌基因型，以时间(分钟)为
单位绘制遗传图谱，该图谱是细菌染色体上基因顺序的直接反映。
四、基因定位和基因组测序
（参见P224）
1、中断杂交技术
大肠杆菌基因组很大（全部转移
需要100分钟），其遗传图谱须用
多株F因子整合在不同位置的Hfr
菌才能完成
四、基因定位和基因组测序
（参见P224）
2、基因连锁
接合作用（中断杂交）作图只能判断相距较远的基因间的相对位置；
转导、转化则可用于对相隔很近的基因进行定位；
连锁的二基因间的距离与其共转化，或共转导的频率成反比，因此，
可根据二个基因被共转化或共转导的频率判断它们在染色体上的相
对距离。
四、基因定位和基因组测序
（参见P224）
3、遗传图谱
目前对大肠杆菌的染色体已定位了1000多个基因
四、基因定位和基因组测序
4、基因组测序
（参见P225）
“全基因组鸟枪测序”（whole genome shotgun sequencing）
5、基因组序列的注释和意义
借助计算机对基因组序列进行分析
第六节 真核微生物的遗传学特性
第七节 微生物育种
自学！
酵母菌的有性杂交育种
（一）酵母菌的生活史（复习）
（二）酵母菌有性杂交技术
酵母菌有性杂交程序一般为：
亲本的单倍化
↓
有性杂交
↓
杂交后代的检出
↓
筛选优良性状个体
酵母菌有性杂交的方法：
1.
亲本的单倍化
1) 杂交亲本单倍体细胞的分离
A. 子囊孢子的形成
a.
形成子囊的条件
b. 一般方法
B. 单倍体子囊孢子的分离
a.
显微操作器分离单倍体子囊孢子法
b. 酶法
c.
机械研磨法
C. 单倍体菌株的确定
a.
单倍体细胞与二倍体细胞在形态方面的区别
b. 生孢子能力的测定
c.
单倍体细胞结合型的确定
2) 杂交亲本单倍体细胞遗传标记的制作
1. 可口可乐
2. 酵母菌有性杂交
（1）孢子杂交法
（2）群体交配法
（3）单倍体细胞杂交法
3. 杂交后代的检出
4. 筛选优良性状个体
S. Cerevisiae 的双倍体和单倍体细胞
的比较
•
•
•
•
项
目
双倍体
单倍体
细
胞
大，椭圆形
小，球形
菌
落
大，形态均一
小，形态变化较多
液体培养
繁殖快，细胞较分散
繁殖较慢，细胞常聚
子囊孢子发芽
集成团
接合
• 在产孢子培养基 形成子囊及子囊孢子 不形成子囊
自 或
然 人
破 工
壁 破
壁
减数分裂
（二）准性生殖（parasexual
hybridization）
定义和意义：
类似于有性生殖但更原始的生殖方式，是通过同一物
种两个不同菌株的体细胞发生融合，不经过减数分裂
而导致低频率基因重组并产生重组子。为半知菌育种
提供了一个重要手段。
存在范围：常见于一些真菌尤其是半知菌中
准性生殖的过程：
准性生殖的过程：
①菌丝联结
②异核体形成（质配）
③核配形成杂合二倍体
④体细胞交换和单倍体
化。
异核体：同一菌丝有不同遗传性状的核在同一
细胞质中生长。
同核体：同一菌丝中只有一种核。
异核体的特点：
1）具有感受性的两种菌丝间才可形成异核体；
2）具有野生型性状，可在基本培养基上生长 ；
（基因互补功能）
3）大多数异核体的分生孢子不能在基本培养基
上生长；如能生长，则为异核体、或为杂合
二倍体（重组子）。
体细胞交换和单倍体化
杂合体细胞中有极少数细胞核在进行有丝分裂
的过程中，能发生体细胞染色体间的交换、分离
（单倍体化）而产生具有新性状的单倍体杂合子、
双倍体及非整倍体。
A
B
（同核体）
（异核体）
A+B
AB
AB
A B
A
B
A B
（杂合二倍体）
单倍体杂合子
准性生殖与有性生殖的比较
•
项
•
参与接合的亲本细胞
•
独立生活的异核体阶段
•
接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同
•
双倍体变单倍体的途径
•
目
接合发生的几率
有性生殖
形态相同的体细胞
有
通过有丝分裂
偶然发现，几率低
准性生殖
形态或生理上有分化的性细胞
无
与单倍体明显不同
通过减数分裂
正常出现，几率高
准性杂交：
选择亲本：以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本
强制异合：将两菌亲株的分生孢子（106~107 ）混合涂[-]平板，
并做各单亲本对照， [-]平板上长出的菌落是异核体或杂合二
倍体
移单菌落：纯化菌落，并将纯化后的菌落移入[-]斜面
验稳定性：在[-]夹层平板上培养后，再倒上一层[+]，再培养
后若出现大量新菌落，说明是不稳定的异核体，反之是杂合
二倍体
促进变异：用诱变剂进行处理，以促进染色体发生交换、染
色体在子细胞分配不均、染色体缺失或畸变、点突变等，使
分离后的子代提高增加新性状的可能
筛选：
Penicillum urticae 的准性杂交步骤
第七节 诱变育种
诱变育种：是用物理或化学的诱变剂使诱变对
象内的遗传物质（DNA）的分子结构发生改变，
引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌
株的一种育种方法。

诱变育种具有极其重要的实践意义。当前发酵工
业和其它微生物生产部门所使用的高产菌株，几
乎毫无例外地都是通过诱变育种而明显提高其生
产性能的。
诱变育种的步骤：
原始菌种
原菌种特性鉴定
纯化
斜面/肉汤培养
单孢子/单细胞悬液
诱变剂处理
计算存活率
复筛
平板分离
观察形态变异，
小试
挑单菌落
移至斜面
初筛
良种保藏
中试
诱变育种的基本过程：
选择选择合适的出发菌株
↓
制备待处理的菌悬液
↓
诱变处理
↓
筛选
↓
保藏和扩大试验
1、出发菌株的选择：
出发菌株———用来育种处理的起始菌株
◆出发菌株应具备：
①对诱变剂的敏感性高；
②具有特定生产性状的能力或潜力；
◆出发菌株的来源；
①自然界直接分离到的野生型菌株：
②历经生产考验的菌株：
③已经历多次育种处理的菌株：
2、制备细胞悬液
要求：
①菌体处于对数生长期，并使细胞处于同步生长；
②细胞分散且为单细胞，以避免表型迟延现象
（phenotypic lag）;
方法：
①玻璃珠打散10-15min;
②加０.3%吐温80（表面活性剂）
③用无菌脱脂棉过滤
制备：
物理诱变剂——生理盐水（0.85%NaCl)
化学诱变剂——缓冲液
浓度：
细菌、放线菌
108个/ml
霉菌、酵母菌
106个/ml
表型迟延现象:指某一突变在DNA复制和细胞分裂后，才
在表型上显示出来，造成不纯的菌落。
产生原因：
①分离性迟延现象
②生理性迟延现象
3、诱变处理：
诱变剂的作用：
①提高突变的频率
②扩大产量变异的幅度
③使产量变异朝着正突变或负突变移动
剂量的表示法：不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变
剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先
作诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适
的处理剂量。—致死率是最好的诱变剂相对剂量的表
示方法。
最适剂量的选择：产量性状的育种中多倾向于低剂量（致
死率在70-80%）

选择诱变剂的种类：在选用理化因子作诱变剂时，在同样
效果下，应选用最方便 的因素；而在同样方便的情况下，
则应选择 最高效 的因素。在物理诱变剂中，尤以紫外线
为最方便，而在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为
显著的“超诱变剂”，如NTG。

简便有效的诱变方法：紫外线的照射最为方便。
化学诱变剂的种类、浓度和处理方法尤其是中止反映
的方法很多，实际工作时可参看有关书籍。一种较有效的
简易处理方法的大致操作步骤是：先在平板上涂上出发菌
株细胞，然后在平板上均匀地放上几颗很小的诱变剂颗粒
（也可放吸有诱变剂溶液的滤纸片），经培养后，在制菌
圈的边缘挑取若干突变菌落，分别制成悬浮液，然后将其
涂在一般平板表面使长出许多单菌落，最后可用影印培养
法或逐个检出法选出突变种。
诱变处理方式：
单一因子处理：
复合因子处理：
两种以上因素
先后使用
同时使用
单一因子重复使用
4、 菌种筛选
筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤.
筛选方案：
 实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为
初筛和复筛两步进行。
 初筛的目的：删去明确不符合要求的大部分菌株，把生
产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良性状的菌株不
至于漏网；因此，初筛以工作量为主，测定的精确性还
在其次；初筛手段应尽可能快速、简单。
 复筛的目的：确认符合要求的菌株；——复筛以质为主，
应精确测定每个菌株的生产指标。
第一轮：
初筛
诱变处理
一个出发菌株→→→选出200个菌株→→→选出50株
（每瓶一株）
复筛
→→→选出5株
（每瓶四株）
40株
第二轮：
诱变处理
5个出发菌株→→→
40株
初筛
复筛
40株→→ → 选出50株 →→ →选出5株
（每瓶一株）
40株
40株
（每瓶四株）
变异菌的一般筛选方法
平皿快速检测法

变色圈法

透明圈法

生长圈法

抑菌圈法

梯度平板法
摇瓶培养法
第八节 菌种保藏
（参见P19）
性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则
生产或科研都无法正常进行。
影响微生物菌种稳定性的因素：
a）变异；
b）污染；
c）死亡；
一、菌种的衰退与复壮
菌种衰退的特点：
大量群体中的自发突变
菌种的复壮：
1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有
原有典型性状的菌种。
a）纯种分离；
b）通过寄主体进行复壮；
2）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种
维护工作中不断筛选“正变”个体。
二、防止衰退的措施
1）减少传代次数；
2）创造良好的培养条件；
3）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；
4）采用有效的菌种保藏方法；
三、菌种保藏
（参见P19）
基本要求：
在一定时间内使菌种不死、不变、不乱
培养基传代培养 斜面、平板
生活态
基本方法：
休眠态
寄主传代培养
冷冻
液氮、低温冰箱
干燥
沙土管、冷冻真空干燥
三、菌种保藏
（参见P20）
由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有
不同的适应性，迄今为止，尚没有一种方法能被证明对所有的微
生物适宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特
性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比
较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行
保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。
思考题：
1、 如果二个不同营养缺陷标记（a - b - c + d + 和 a + b + c - d - ）的
菌株经混合后能产生在基本培养基平板上生长的原养型重组菌
株，请设计一个实验来决定该遗传转移过程是转化、转导还是
接合?
2、 自然遗传转化与人工转化之间有什么关系?为什么在一般情况下
它们转化质粒的成功率有如此大的差别?