Transcript 第二章-04节- 基因工程在食品科学中的应用

第二节 基因工程研究

第一个重组体的构建
1972年，美国斯坦福大学P.Berg等在PNAS上发表
了题为∶“Biochemical methode for inserting new
genetic information into DNA of Simian Virus
40:circular SV40 DNA molecules cotaining lamda
phage genes and the galactose operon of Escherichia
coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2904-2909, 1972”，
标志着基因工程技术的诞生。
体外
操作
与细
胞内
表达
（基因工程技术包括下列过程）
分—获取目的基因和载体
接—目的基因与载体的连接
转—重组DNA导入宿主细胞
筛—重组DNA的筛选
鉴—重组DNA的鉴定
可用以上五个字表示
（一）目的基因的分离（分）
目的基因：是指所要研究或应用的基因，也是需要克隆或表
达的基因。
(一) 目的基因的分离
1、基因分离的策略
一般分离基因的策略要满足以下几个基本特性中的至少
一个：
（1）具有特定的核苷酸序列；（2）存在于基因组中某一特
定位置；（3）编码mRNA；（4）大多具有一定的功能。
2、基因分离的注意事项
（1）以基因表达产物蛋白质的纯化或表型突变体的分离；
（2）通过植物细胞工程、物理和化学诱变等技术，获得植
物基因；
（3）可在cDNA文库中随机取一个克隆；
（5）采用染色体步移(chromosomal walking)方法分离基因
出来；
（6）许多植物基因可以根据其与细菌和酵母突变互补能力
来分离；
（7）许多有潜在利用价值的植物基因。
（二）目的基因的制备
化学合成方法
制备方法
生物制备法
需要克隆的DNA片段
化学合成法 cDNA文库
聚合酶链式反应
基因组DNA文库
1）化学合成法
根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其
核苷酸顺序再进行人工合成。适应于合成小分子多肽的基因
全基因合成：合成40-60bp片段，再连接
合成思路
基因的半合成：合成末端间有10-14bp个互补碱基的
片段，再利用DNA聚合酶催化合成
目前，常用DNA自动合成仪合成。
化学合成思路模式图
连接
目的基因全长
重叠区
重叠区
合成目的基
因的引物
用途：
PCR引物
测序引物
定点突变
核酸杂交探针
2、基因组文库（Genomic DNA Library）
基因组文库(gene library)：是指汇集某一基因组所有DNA序列
的重组DNA群体
从生物组织细胞提取出基因组DNA ，用限制性酶法将DNA降解成
预期大小的片段，并电泳分离，然后将这些片段与适当的载体（噬
菌体）体外重组，进行体外包装系统将重组体包装成完整颗粒，转
入受体细菌（大肠杆菌），形成大量噬菌斑，从而形成整个基因组
DNA的重组DNA克隆群体，称为基因组DNA文库。
具备了基因组文库，就可以用目的基因片段作探针，利用菌落
原位杂交技术，从大量的菌落中筛选出含有目的基因的重组体的菌
落，再经过扩增，提取其中的重组体，最后即可获得所需要的目的
基因片段。
基因组DNA文库法示意图
Genome DNA
Digest with restriction enzyme
DNA recombination
Packaging and assembly
Transformation
Genome DNA
3、cDNA文库法
cDNA文库(cDNA library)：是指汇集以某生物成熟mRNA
为模板逆转录而成的cDNA序列的重组DNA群体
操作流程：提取出组织细胞的全部mRNA，在体外反转录成
cDNA，与适当的载体，常用噬菌体或质粒载体连接后转化受
体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含
着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合就形成了该组织细胞
的cDNA文库。
实际为不包含内含子的基因组文库。
分离目的基因
的mRNA
逆转录生成cDNA单链
水解去除mRNA，
合成cDNA双链
水解回折处单链
得到平端双链cDNA
导入宿主细胞克隆,构建cDNA文库
（三）聚合酶链反应( PCR)
在模板DNA、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶等条件下，
体外经94℃变性、54℃退火及72℃延伸3个步骤的反复多次循
环（2530次），扩增目的基因
引物
5’
5’
3’
5’
引物
基因组
二、 目的基因与载体的重组（接）
（一）质粒DNA的分离和纯化
（二）目的基因与载体的连接
1、粘性末端连接
2、平头末端连接
3、人工接头法
4、同源多聚尾连接法
（一）质粒DNA的分离和纯化
载体的本质是DNA，所以其分离纯化类似于DNA的分
离纯化
纯化步骤：
溶菌酶
质粒载体宿主菌
释放出质粒DNA、多聚核糖体、
可溶性蛋白质、tRNA等细胞内大分子
DNA
酚
除去蛋白
线性DNA分开
EB，CsCl
离心
离心
质粒DNA 与核内环性和
（二）目的基因与载体的连接
1、粘性末端连接
将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生相同
粘性末端，再通过DNA连接酶作用将两者连接起来，构成
重组DNA分子。
2、平头末端连接
某些限制酶只能将目的基因和载体DNA切割成平
端，此时在T4DNA连接酶的作用下同样能连接起来。
基因和载体用同一种限制酶酶切（粘性末端连接）
3、人工接头法
人工接头是合成的寡核苷酸，在其上人为地安置了限制性内切酶
的识别序列。将人工接头连接到载体和目的基因上，即有可能使用同
一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。
4、同源多聚尾连接法
也称作人工接尾连接法
当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无
法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。
此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核
苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的
基因的3'-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上
添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由
DNA连接酶连接。
同
源
多
聚
尾
连
接
法
三、将重组体导入受体细胞 (转)
根据受体生物，可将重组体导入受体细胞的方法主要分为大肠
杆菌转化法、酵母转化法、植物细胞转化法及动物细胞转化法
(一) 大肠杆菌转化法
1、氯化钙转化法(狭义的转化)或转染
感受态细胞（Competent Cell）的制备：用特殊方法处理，使细胞
膜通透性增加，从而具有摄取外源DNA的能力。
转化流程：感受态细胞和重组DNA混合，使DNA与钙离子形成复合
物，吸附于细胞表面，经42℃短暂（90s）的热处理，促进外源DNA
进入感受态细胞。
50-100mmol/L
CaCl2
感受态
细菌
重组体转
入细菌
CaCl2感受态细胞的制备实验步骤
前夜接种受体菌（DH5或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养
过夜（约16小时）；

取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3
小时（250-300rpm）；


将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作；

吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；

4℃下3000 g冷冻离心5分钟；
弃去上清，加入100l预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细
胞重新悬浮，在冰放置20分钟；


4℃下3000 g冷冻离心5分钟；
弃去上清，加入100l预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细
胞重新悬浮；

细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温
冷冻贮存备用（－70℃）。

几个概念：

狭义的转化(transformation)是感受态的大肠杆菌细胞接受
及表达质粒DNA分子的生命过程——氯化钙转化法；

转染(transfection)是感受态的大肠杆菌细胞接受及表达噬菌
体DNA分子的生命过程。
狭义的转化得到的是转化子菌落；而转染得到的是噬菌斑

广义的转化是指将外源DNA引入受体生物细胞的过程。
2、转导(transduction)
将重组的λ噬菌体DNA或柯斯质粒DNA体外包装成具有感染
能力的λ噬菌体颗粒，然后经受体细胞表面的λ噬菌体接受器位点使
这些重组体DNA注人大肠杆菌宿主细胞。
转染的效率较低，在基因工程中，λ噬菌体DNA等的直接转染
并不常用。因此，常用λDNA体外包装技术。即首先将λ噬菌体
DNA或柯斯质粒DNA体外包装成具有感染能力的λ噬菌体颗粒，
然后再以其转导受体细胞
基因重组
噬菌体
体外包装
转导
噬菌体体外包装
λ噬菌体体外包装的基本原理：
λ噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的。头部基因发生了
突变的噬菌体只能形成尾部，而尾部基因发生了突变的噬菌体只
能形成头部。将这两种不同突变型的噬菌体提取物混合起来就能
在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。
一般只要为重组DNA提供高浓度的噬菌体前体，包括包装蛋
白、头部、尾部，就有可能形成完整的噬菌体颗粒。
λ噬菌体头部外壳蛋白包装DNA的容量控制在野生型λDNA长
度的75％一105％。
(二) 酵母转化法
1、完整细胞转化法
首先利用乙酸锂或氯化锂处理对数生长期的酵母细胞，
然后在运载DNA(鲑精DNA、小牛胸腺DNA)、二甲基亚砜
(dimethylsulfoxide，DMSO)和聚乙二醇存在下，重组DNA
经热冲击进入酵母细胞
在转化过程中，PEG（聚乙二醇 ）的作用非常重要，
因为PEG能将大分子DNA沉积于受体细胞表面
2、原生质体转化法
酵母细胞经过用适当水解酶酶解消化细胞壁等处理后，
也像大肠杆菌一样能够接受外源DNA重组体的导入。
操作方法：
该法首先利用蜗牛酶处理对数生长期的酵母细胞，然后
将经酶解去除了细胞壁的原生质体悬浮于山梨醇及氯化钙的
溶液中，在运载DNA的存在下，用聚乙二醇使重组DNA分
子进入酵母细胞。
(三) 植物细胞转化法
1、农杆菌质粒介导法

农杆菌介导法是目前双子叶植物基因转移的常用方法。

它是利用根癌农杆菌的Ti (Tumor induce)质粒和发根农杆
菌的Ri (Root induce)质粒上的一段T-DNA区在农杆菌侵染
植物形成肿瘤的过程中,T-DNA可以被转移到植物细胞并插
入到染色体基因中。利用Ti质粒的这一天然的遗传转化特性,
可将外源基因置换T-DNA中的非必需序列即可使外源基因整
合到受体染色体而获得稳定的表达。
迄今所获得的近200种转基因植株中80％以上是利用根癌农
杆菌转化系统产生的。
crown gall or tumor
一般流程如下：
根癌农杆菌的培养、纯化→根癌农杆菌工程菌侵染液的
制备→植物外植体的预培养→将根癌农杆菌工程菌接种到植物
外植体的损伤切面→植物外植体与根癌农杆菌的共培养→植物
外植体的脱菌培养→转化体的选择培养。
农杆菌的活化
挑单克隆进行
培养、纯化
收集细胞
用液体MS培养基重悬细胞
工程菌
预培养的植物
外植体
将预培养的外植体放入菌液中共培养
共培养
在含有选择压力的培养基上诱导细胞分化，
形成转化芽（脱菌培养）
转化体的诱导芽生长
生根，形成转化植株
2、基因枪法
基因枪法首先将外源DNA黏附在微小的金粒或钨粒的表
面，然后在高压的作用下，将微粒高速射入受体细胞或组织，
使微粒上的外源DNA进入受体细胞，整合于染色体上
基因枪转化的操作步骤：
金粒、钨粒的处理
 微粒子弹的制备（外源DNA-金粒或钨粒复合体的制备 ）
 装备基因枪
 靶细胞或组织的预处理
 DNA-金粒或钨粒复合体轰击
 轰击材料的过渡培养
 进行筛选培养或直接分化再生植株

便携式基因枪
台式基因枪
基因枪法转化的优点有：
无宿主限制：农杆菌介导法只对双子叶植物敏感，限制了
它的应用范围。而基因枪没有物种限制。
靶受体类型广泛：可以是原生质体，叶片，悬浮细胞，茎
或根切段，种子胚，愈伤组织，花粉等。
操作简单快速
缺点：
转化率低，外源DNA整合机理不清楚。应该说该技术只
处在研究阶段，尚未成熟。
1、显微注射法
显微注射法首先利用非常微细的玻璃毛细管携带外源
DNA，在显微镜下直接将外源DNA注射到动物受精卵细胞核
中，然后将导入外源DNA的受精卵经体外培养、检测后作胚
胎移植
Microinjection
Gene transfer by microinjection
Microinjection 的主要特点如下：
① 体外受精。从受体动物的卵巢里获得卵母细胞，体外孵育
成熟，加入精子，进行体外受精，并进行受精卵的体外培养；
② 在胚胎移植前检测、鉴定外源DNA的整合，可定向挑选
具有目的基因整合的胚胎进行移植；
③ 改进胚胎移植技术可以减少受精卵的损伤，提高受精率。
First cloned cat
2、磷酸钙共沉淀法
磷酸钙共沉淀法首先将一定浓度的氯化钙和外源DNA置
于含有靶细胞的磷酸缓冲液中，然后调节pH使外源DNA与
钙结合形成白色的共沉淀。这些白色沉淀可沉积于靶细胞细
胞膜的表面，阻断溶酶体酶的活性，改善细胞膜的通透性，
并诱导细胞吞噬，从而使外源DNA进入靶细胞。
该法适于多种细胞，并可形成稳定的转化子
3、电穿孔法
电穿孔法(electroporation)是指利用高压电脉冲使细胞膜
形成小孔而导入外源DNA的技术
一般流程：
将外源DNA与待转化的细胞置于特制的装置内→在高压
脉冲电场作用下，电脉冲可使细胞膜产生瞬时可逆性穿孔→
同时，通过细胞的胞饮作用，外源DNA被摄入细胞→外源
DNA整合到细胞的基因组上。
该法适于导入环型DNA及线形DNA
4、病毒感染法
将外源DNA与病毒重组，将其包装，形成完整病毒颗粒，
然后将病毒颗粒释放到培养基上，使其在聚乙二醇的作用下
感染受体细胞，进行基因转移。
聚乙
二醇
受体细胞
感染
四、重组转化体的筛选和鉴定（筛和鉴）
(一) 利用表型特征进行筛选(遗传检测法)

表型(phenotype)是指机体遗传组成同环境相互作用所产生
的外观或其他特征。

供筛选用的表型特征来自两个方面：一是克隆载体提供的，
这是主要的；一是外源DNA提供的，这是次要的。
1、利用载体提供的表型特征进行筛选
(1) 抗药性标记基因插入失活筛选法
对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭活法进
行筛选。
如pBR322中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将
目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌
对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉素的培
养基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长的细菌
即为带重组体的细菌。
插
入
灭
活
法
筛
选
重
组
体
(2) 蓝-白筛选法
它是一种利用蓝色化合物的形成作为指示剂的筛选方法，筛选
含有编码β-半乳糖苷酶的基因。
β—半乳糖苷酶失活的λ插入型载体的基因组中含有一个大肠
杆菌的lac5区段 →编码β—半乳糖苷酶基因lacZ
合物(5-溴-4-氯靛蓝)
Xgal →蓝色复
IPTG
λ载体感染的大肠杆菌1ac-指示菌 涂布培养基平板 （ IPTG +
Xgal ）
形成蓝色的噬菌斑；
如果在lac5区段插入外源DNA，就会阻断β—半乳糖苷酶基
因lacZ的编码序列，那么被这种λ重组体感染的1ac—指示菌由于
不能合成β—半乳糖苷酶而只能形成无色的噬菌斑
蓝－白筛选示意图
2、利用外源DNA提供的表型特征进行筛选

这种筛选法要求外源DNA是一个完整的基因，而且能够在
大肠杆菌或其他受体细胞中实现功能表达。

该法基本原理如下：与载体重组的外源DNA完整基因对大
肠杆菌转化宿主菌株表现出外源基因所编码的表型特征；
从而与未被转化的菌株分别开。
3、利用噬菌斑的形成进行筛选

以λ噬菌体载体与外源DNA构建的重组体的筛选,主要依赖于重
组体的大小及形成噬菌斑的能力。

重组体DNA只有在为野生型λ噬菌体DNA的75％～105％的长度
时，才能在培养平板上形成清晰的噬菌斑，而载体DNA本身是
不会包装成活的噬菌体颗粒的。
4、利用遗传互补作用进行筛选

如果在转化宿主细胞后，重组体的表达产物可与宿主的营养缺
陷型突变发生互补作用，那么根据这种特性，即可筛选出重组
转化体。
(二) 物理筛选鉴定法
电泳检测法
根据DNA分子量的大小，以凝胶电泳检测重组体。
(三) 利用限制性内切核酸酶酶切进行鉴定

将单一细菌进行扩增后分别提取其DNA，用重组时所用的同一
限制酶进行酶切，再将其与不含目的基因的载体一起进行电泳
比较分析。
(四) 利用核酸杂交进行鉴定

所用的核酸杂交法就是常用的几种核酸杂交法，例如
Southern杂交、Nonhem杂交等
(五) 利用PCR技术进行鉴定
利用PCR技术可以对目的基因等特异核酸进行鉴定。
抽提少量重组DNA→PCR扩增→电泳鉴定→序列分析→
与已知序列比对
(六) 利用免疫学方法进行筛选鉴定
原理：以目的基因在受体细胞中的表达产物(多肽)作Ag，以
该基因产物的免疫血清作Ab，根据抗原—抗体反应，即可筛
选并鉴定出目的基因克隆及其产物
方法：放射性抗体检测法、免疫沉淀检测法、酶联免疫吸附
检测法等
1、放射性抗体检测法
转化菌体涂布在琼脂培养基平板上→出现菌落后，将其影印到另一
琼脂平板上继续培养，保留母板→待影印琼脂平板上的菌落长好后，
将其置于含有氯仿饱和气体的容器中使菌落裂解，阳性菌落便释放
出抗原→将吸附了未标记IgG抗体的聚乙烯薄膜覆盖在琼脂平板表面。
如果抗原与抗体具有对应关系，在薄膜上就会形成抗原—抗体复合
物→取下聚乙烯薄膜，再用125I标记的IgG处理，125I—IgG便会与结合
在聚乙烯薄膜上的抗原决定簇结合→漂洗聚乙烯薄膜，除去过剩的
125I—IgG，在空气中使之干燥→作放射性自显影，判断结果→从母板
上获得所需重组克隆。
自学内容
免疫沉淀检测法
酶联免疫吸附检测法
转译筛选鉴定法
2、免疫沉淀检测法
抗特定蛋白的
抗体
菌落细菌分泌这种蛋白
抗原-抗体
沉淀白圈
菌落细菌分泌其他蛋白
3、酶联免疫吸附检测法
抗原固定在固
相载体上，加
入抗体、酶标
记抗体，形成
抗体—抗原—
酶标抗体复合
物 ，加入合适
酶的显色剂进
行检测
(七) 利用Western杂交进行鉴定

Western blot技术是用来检测蛋白表达的特定的灵敏的方
法，由蛋白质的SDS-PAGE、吸印、杂交和免疫测定几部
分组成。

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采
用的是PAGE电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，
“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，
转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以
非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型
及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为
抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的
第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳
分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
五、克隆基因的表达
基因工程研究的最终目的就是使外源基因在受体生
物系统中高效表达，而基因表达一般包括转录和转译两
个过程。
转录
转录
DNA
RNA
翻译
protein
(一) 原核生物与真核生物系统中基因表达的不同特点
1、DNA的存在状态不同
2、重复序列的不同
3、内含子和转录后加工系统是否存在
4、基因表达的单位不同
5、RNA聚合酶的种类不同
6、核膜的有无决定着转录与转译是否偶联
7、转录的控制不同
8、真核生物mRNA分子的5’ 端和3’ 端都会发生修饰作用
9、mRNA的寿命不同
10、S-D序列是否存在
原核生物mRNA的结构特点
SD区
顺反子
顺反子
顺反子
5´
3´
AGGAGGU
插入顺序
插入顺序
末端顺序
先导区
① 半衰期短
② 许多原核生物mRNA以多顺反子形式存在
③ AUG作为起始密码；AUG上游7～12个核苷酸处有一被称为SD序列
的保守区， 16S rRNA3’- 端反向互补而使mRNA与核糖体结合。
真核生物基因结构图
转录起始点
GC框
转录终止信号
GC框
CAAT框
TATA框
RNA聚合酶结合
控制转录频率
RNA聚合酶结合
决定转录起始点

外显子 1
外显子 2
外显子 3
内含子1（I
）
内含子2（I
）
（E1）
（E2）
（E3）
1
2
1
30
31
104
105
146
AATAAA
回文顺序

真核生物mRNA的结构特点
m7G-5´ppp-N-3 ´ p
顺反子
5´ “帽子”
帽子结构功能
① 使mRNA免遭核酸酶的破坏
② 使mRNA能与核糖体小亚基结合并开始
合成蛋白质
③ 被蛋白质合成的起始因子所识别，从
而促进蛋白质的合成。
Poly(A)尾巴的功能
① 是mRNA由细胞核进入细胞质
所必需的形式
② 它大大提高了mRNA在细胞质
中的稳定性
PolyA 3´
AAAAAAA-OH
(二) 外源基因在受体生物细胞中正确表达的条件
启动子
S-D序列
起始密码子
终止子
转译后的修饰与加工

启动子(promoter)：是指DNA链上一段能与RNA聚合酶结
合并能起始mRNA合成(转录)的序列，是基因表达不可缺少
的重要调控序列。如果没有启动子，就不能进行转录。
原核生物启动子是由两段分开、但高度保守的核苷酸序
列组成的。其中之一为Pribnow box，位于转录起始点上游
5～10bp，一般由6～8个碱基组成，富含A、T，因此其又称
为TATAbox或-10区；另一序列为-35区，位于转录起始点上
游35bp处，一般由10个碱基组成。
-35
TTGACA
-10
16-19bp
转录起点
TATAAT 5-9bp
典型启动子的结构
真核生物蛋白质基因的一般结构模型

S-D序列是指位于mRNA的5’ 端不转译的前导区段内起始密码
子AUG上游3-10bp处的由3～9个碱基组成的一段序列。该段序列
富含嘌呤核苷酸，与16 SrRNA的3’端富含嘧啶的序列
(AUUCCUCCACUAG)互补，是rRNA的识别和结合位点，控制转
译的起始。
SD区
顺反子
顺反子
顺反子
5´
3´
AGGAGGU
插入顺序
插入顺序
末端顺序
先导区

起始密码子(initiation codon)是指规定多肽链的第一个氨
基酸的密码子。
细菌的起始密码子为AUG，它转译为N-甲酰基甲硫氨酸
(一种修饰的氨基酸)；或较罕见的GUG，它转译为缬氨酸。
真核生物的起始密码子为AUG，并转译为甲硫氨酸。其也用
来表示DNA中的相应顺序ATG。

终止子(terminator)，即转录终止子，是指位于一个基因或
操纵子3’末端后的一段特定核苷酸序列，其具终止转录的功
能。
在构建表达载体时，为防止所克隆外源基因的表达干扰
载体的稳定性，一般都在多克隆位点的下游插入一段很强的
核糖体RNA的转录终止子。
转译后的修饰与加工:在真核细胞中，有时需要将前体蛋白降
解为功能蛋白；有时需要进行某种修饰，例如，糖基化为糖
蛋白。
(三) 外源基因在受体(原核)生物细胞中高效表达的调控
1、选用强启动子及增强子
强的启动子可产生较多的mRNA，而弱的启动子则相反。启
动子区域的序列是高度保守的。在原核细胞中，一个区域是位于
转录起点上游10bp的-10区的TATAAT序列(Pribnow box)；另一个
区域是-35区的TTGACA序列。这两个区域对于决定启动子的强度
是很重要的。
增强子(enhancer)是位于更上游处的72bp的重复序列，有时也
位于基因3’ 端的下游区或位于内含子中，其作用为促进基因转录，
增强基因表达。
晚期区
SV40
无 核小体区
早期区
T3
72bp
72bp
250
GGTGTGGAAAG
21 21
107 103
22
47
T2
Ori
TATA
CCGCCC
图12- SV40复制起始中的增强子
0/5245
T1
2、调整S-D序列与AUG之间距离
以此达到最佳的转译效率。
3、优化转译起始相关序列
当连接在S-D序列后的4个碱基为4个A(T)时，其转译作用
最有效；而当连接在S-D序列后的4个碱基为4个C(或4个G)时，
其转录效率则只有最高转译效率的50％(或25％)。直接位于起
始密码子AUG左侧的密码三联体的碱基组成也会影响转译效
率。
4、优化起始密码子下游密码子组成
使外源基因能在受体细胞中转录。
5、采用转录终止子
6、提高质粒拷贝数及其稳定性
7、诱导受体细胞生长与外源基因表达分开
8、诱导受体细胞生长与表达载体复制分开
9、表达分泌蛋白
10、表达融合蛋白
第三节 基因工程在食品科学中的应用
基因工程与动物、植物、微生物产品品质的改良
基因工程与植物产品贮藏保鲜
基因工程与食品新资源的开发
一、基因工程与动物、植物和微生物产品品质的改良
(一) 培育抗病虫害、抗除草剂的植物新品种及抗冻动物新品种
的基因工程
1、ICP基因工程
ICP基因来自于苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)。其营养
体生长发育到一定阶段后，在其一端形成芽孢，在另一端形成伴胞
晶体。伴胞晶体主要由蛋白质和糖类组成。当昆虫吞食伴胞晶体后，
在昆虫肠道碱性条件和特定蛋白酶的作用下，伴胞晶体蛋白变成有
活性的毒性分子。这种蛋白为δ-内毒素（δ-endotoxin），被称作杀
毒结晶蛋白（insecticidal crystal protein, ICP）
ICP基因工程
研究进展
培育植物新品种、作物害虫抗性
2、蛋白酶抑制剂基因工程
在自然界中的所有生命体中，尤其在植物中，都含有蛋白酶
抑制剂(proteinase inhibitor，PI)。
蛋白酶抑制剂与昆虫消化道内的蛋白消化酶相结合形成酶抑
制剂复合物(EI)，导致蛋白质不能被正常消化；同时EI复合物能
刺激昆虫过量分泌消化酶，使昆虫产生厌食反应，干扰昆虫的蜕
皮过程和免疫功能 ，使昆虫不能正常发育或死亡。
3、其他抗虫基因工程
转基因番茄的抗蚜虫性能
4、抗病毒病基因工程
外源的病毒外壳蛋白(coatprotein，CP)基因在导入植物
细胞后，可能由于其RNA转录体与入侵病毒RNA间的相互
作用使植物细胞获得保护
研究人员分别将烟草抗TMV的N基因、CMV的CP基因、
CMV卫星DNA的cDNA、TYLCV的CP基因、AIMV的CP基因等
转入番茄，所获得的转基因植株均对相应的病毒侵染表现抗性。
转基因抗虫棉和普通棉对照
转基因耐贮藏番茄（左）和
普通番茄（右）
5、抗真菌病基因工程
抗枯病菌的烟草 、抗真菌的甘蓝型油菜、抗立枯丝核菌的烟
草、抗晚疫病的番茄等
6、抗细菌病基因工程
抗青枯病的番茄等
7、抗除草剂基因工程
抗多种除草剂的转基因植物
8、抗低温基因工程
抗低温的转基因鱼类
(二) 改良微生物菌种特性的基因工程
第一个采用基因工程改造的食品微生物为面包酵母。由于把
具有优良特性的酶基因转移至该菌中，因此使该菌含有的麦
芽糖透性酶(maltose permease)及麦芽糖酶(maltase)的含量比
普通面包酵母高，在面包加工中所产生的二氧化碳气体量也
较高，从而制造出膨发性能良好、松软可口的面包产品。
(三) 改良动植物品种质量的基因工程
1、改良谷物种子贮藏蛋白的基因工程
(1) 改良种子贮藏蛋白营养品质的基因工程
(2) 改良种子贮藏蛋白面包烘烤质量的基因工程
2、改良脂肪酸组成的基因工程
(1) 增加饱和脂肪酸含量的基因工程
(2) 降低饱和脂肪酸含量的基因工程
3、增加果实甜度的基因工程
4、提高果实可溶性固形物含量的基因工程
5、提高果实等器官组织微量元素含量的基因工程
6、提高动物生长速度、增加动物营养价值的基因工程
二、基因工程与植物产品贮藏保鲜
(一) PG基因工程
(二) ACC合成酶基因工程
(三) 乙烯形成酶基因工程
(四) ACC脱氨酶基因工程
三、基因工程与食品新资源的开发