Transcript 实验四
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实验四 蛋白质等电点测定
《食品生物化学实验》课件
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蛋白质的两性性质和等电点测定
一、实验目的
1、了解蛋白质是两性电解质，在酸性溶液中
成阳离子，在碱性溶液中成阴离子。
2、掌握蛋白质在等电点（pI）时引起聚沉，
加入乙醇、丙酮溶剂而使蛋白质溶液变化。
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2.实验原理
蛋白质是两性电解质。蛋白质分子中可解离基团除N-端α-氨基与C-端
羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如Phe、Thr、Ser的
羟基、Cys的巯基、Arg的胍基、His的咪唑基，Asn、Gln的酰胺基和
Lys的ε-氨基等都能解离为带电基团。
在蛋白质溶液中存在着下列平衡：
阴离子
两性离子
pH＞pI
pH = pI
电场中： 移向阳极
不移动
阳离子
pH＜pI
移向阴极
调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，即所带正负
电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点(pI)。
在等电点时，蛋白质溶解度最小，溶液的混浊度最大。配制不同pH的
缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可大致确定蛋白质的等
电点。在pH梯度电泳中，蛋白质泳动到其相应的等电点时则停止泳动，据
此可分离等电点不同的蛋白质。
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蛋白质的等电点
当溶液在某一 pH 值时，蛋白质所带正、负电荷相等，
即总净电荷为零，此时溶液的 pH 称该蛋白质的等电
点(isoelectric point)。
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本实验借助观察在不同pH溶液中的溶解度以测定
酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在
酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。
向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓
冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。蛋白质在不同
pH溶液中形成了不同的混浊度，即混浊度最大时
的pH值即为该种蛋白质的等电点值，这个方法虽
然不很准确，但在一般实验条件下都能进行，操作
也简便。
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三、实验步骤
1.制备蛋白质溶液
（1）称取酪蛋白0.6g，放在烧杯中，加入40℃
的蒸馏水20ml 。
（2）加入10ml 1 M氢氧化钠溶液，微热搅拌直
到蛋白质完全溶解为止。将溶解好的蛋白溶液转
移到100ml容量瓶中，并用少量蒸馏水洗净烧
杯，一并倒入容量瓶。
（3）在容量瓶中再加入1 M醋酸溶液10ml，摇
匀。
（4）加入蒸馏水定容至100ml，得到略现浑浊的
0.6M醋酸钠(NaAc)溶液中的酪蛋白胶体。如
果出现絮状物沉淀，则需要进一步搅拌。
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2.等电点测定
按下表次序在各管中加入蛋白质溶液，并准确地加入
蒸馏水和各种浓度的醋酸溶液（每管总量10 ml） ，加
入后立即摇匀，计时观察。
0.01M
HAC
(ml)
0.1 M
HAC
(ml)
1M
HAC
(ml)
pH
管号
蛋白质胶
液（ml）
H2 O
(ml)
1
1
8.4
0.6
——
——
5.9
2
1
8.7
——
0.3
——
5.3
3
1
8.0
——
1.0
——
4.7
4
1
7.0
——
2.0
——
4.4
5
1
7.4
——
——
1.6
3.5
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四、实验结果
观察各管产生的混浊并根据浑浊度来判断酪蛋白的等电点。
观察时可用+，++，+++，++++，+++++表示浑浊度。说出酪蛋白
质等电点pI = pH=？。
观察
管号
描述沉淀情况
0 min
1
2
3
4
5
10 min
20 min
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五、讨论分析
1．解释蛋白质两性反应中颜色及沉淀变化的原因。
2．该方法测定蛋白质等电点的原理是什么？
六、改进实验建议
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附：仪器和试剂
主要仪器：试管，吸管，容量瓶等。
0.01 M醋酸溶液，0.1 M醋酸溶液，1 M
醋酸溶液
1 M氢氧化钠溶液（氢氧化钠和醋酸溶液的
浓度要标定）
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仪器和试剂
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酪蛋白胶体
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实验结果
实验四 蛋白质等电点测定
《食品生物化学实验》课件
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蛋白质的两性性质和等电点测定
一、实验目的
1、了解蛋白质是两性电解质，在酸性溶液中
成阳离子，在碱性溶液中成阴离子。
2、掌握蛋白质在等电点（pI）时引起聚沉，
加入乙醇、丙酮溶剂而使蛋白质溶液变化。
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2.实验原理
蛋白质是两性电解质。蛋白质分子中可解离基团除N-端α-氨基与C-端
羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如Phe、Thr、Ser的
羟基、Cys的巯基、Arg的胍基、His的咪唑基，Asn、Gln的酰胺基和
Lys的ε-氨基等都能解离为带电基团。
在蛋白质溶液中存在着下列平衡：
阴离子
两性离子
pH＞pI
pH = pI
电场中： 移向阳极
不移动
阳离子
pH＜pI
移向阴极
调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，即所带正负
电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点(pI)。
在等电点时，蛋白质溶解度最小，溶液的混浊度最大。配制不同pH的
缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可大致确定蛋白质的等
电点。在pH梯度电泳中，蛋白质泳动到其相应的等电点时则停止泳动，据
此可分离等电点不同的蛋白质。
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蛋白质的等电点
当溶液在某一 pH 值时，蛋白质所带正、负电荷相等，
即总净电荷为零，此时溶液的 pH 称该蛋白质的等电
点(isoelectric point)。
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本实验借助观察在不同pH溶液中的溶解度以测定
酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在
酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。
向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓
冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。蛋白质在不同
pH溶液中形成了不同的混浊度，即混浊度最大时
的pH值即为该种蛋白质的等电点值，这个方法虽
然不很准确，但在一般实验条件下都能进行，操作
也简便。
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三、实验步骤
1.制备蛋白质溶液
（1）称取酪蛋白0.6g，放在烧杯中，加入40℃
的蒸馏水20ml 。
（2）加入10ml 1 M氢氧化钠溶液，微热搅拌直
到蛋白质完全溶解为止。将溶解好的蛋白溶液转
移到100ml容量瓶中，并用少量蒸馏水洗净烧
杯，一并倒入容量瓶。
（3）在容量瓶中再加入1 M醋酸溶液10ml，摇
匀。
（4）加入蒸馏水定容至100ml，得到略现浑浊的
0.6M醋酸钠(NaAc)溶液中的酪蛋白胶体。如
果出现絮状物沉淀，则需要进一步搅拌。
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2.等电点测定
按下表次序在各管中加入蛋白质溶液，并准确地加入
蒸馏水和各种浓度的醋酸溶液（每管总量10 ml） ，加
入后立即摇匀，计时观察。
0.01M
HAC
(ml)
0.1 M
HAC
(ml)
1M
HAC
(ml)
pH
管号
蛋白质胶
液（ml）
H2 O
(ml)
1
1
8.4
0.6
——
——
5.9
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1
8.7
——
0.3
——
5.3
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8.0
——
1.0
——
4.7
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7.0
——
2.0
——
4.4
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7.4
——
——
1.6
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四、实验结果
观察各管产生的混浊并根据浑浊度来判断酪蛋白的等电点。
观察时可用+，++，+++，++++，+++++表示浑浊度。说出酪蛋白
质等电点pI = pH=？。
观察
管号
描述沉淀情况
0 min
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10 min
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五、讨论分析
1．解释蛋白质两性反应中颜色及沉淀变化的原因。
2．该方法测定蛋白质等电点的原理是什么？
六、改进实验建议
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附：仪器和试剂
主要仪器：试管，吸管，容量瓶等。
0.01 M醋酸溶液，0.1 M醋酸溶液，1 M
醋酸溶液
1 M氢氧化钠溶液（氢氧化钠和醋酸溶液的
浓度要标定）
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仪器和试剂
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酪蛋白胶体
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实验结果