Transcript 激光扫描共聚焦显微镜在生命科学中应用

激光扫描共聚焦显微镜LSCM
在生命科学中应用
 Laser
 Scanning
 Confocal
 Microscope
1、显微形态学常用工具
电子显微镜
TEM
SEM
光学显微镜
生物显微镜
荧光显微镜
LSCM
实体镜
2、LSCM简介
A.特点
用激光作为光源，分辨率高，对样品损伤小，活体观察。
对样品做光学切片，具有Z轴分辨率。
以样品产生的荧光为检测信号，可进行定性、 定量测量。
计算机重构形成立体图像。
监测时间空间动态变化。
超出单纯形态学观察。
B.光路
C.成像原理
针孔
标本
物镜
有针孔
无针孔
C
A
B
C
A
B
B
C
A
ＰＭＴ
3、功能介绍
具有普通光镜所有的功能:万能生物显微镜、荧光显微镜、微分干涉
A.多通道、多荧光成像
B.光学切片，重构三维显微图像
C.生物活性物质（蛋白质、核酸、离子）定性、定量、定位分析
D.生理生化指标（pH、Ca2+、 Mg2+ 等）的动态观察、测量
E.荧光漂白后恢复技术
F.细胞的激光显微“外科手术”及光陷阱技术
G.药物、病毒、细菌等外界物质的跟踪
H.荧光蛋白的应用
I.强大的图像处理功能。
利用LSCM还可以研究：细胞凋亡、细胞增值的动态过程；膜流
动性、通透性、膜电位变化的检测；各种递质、高分子物质的扩散、
受体的移动变化；细胞骨架、基因定位、原位杂交.
A.多荧光图像
用多荧光，您可以使
用多个标记同时研究细
胞结构。此外，多荧光
试验是直接研究分子和
其他细胞成分之间关系
的唯一工具。
三重荧光图像与透射光图像
多通道成像原理
Ch-1
DAPI
Ch-2
=
=
FICT
Ch-3
TRITC
=
B.光学切片与重构三维图像
C.生物活性物质定性、定量、定位监测
D.生理生化指标的动态观察
Cover Glass:170um
For Inverted
Air/Oil/Water
E.荧光漂白后恢复
研究膜或活细胞内用荧光标记的分子的
扩散、转移或其他类型的运动
F.细胞的激光 “外科手术”及光陷阱技
术
将激光作为‘光子刀’，完成诸如细胞膜
瞬间穿孔、切除线粒体溶酶体等细胞器、染
色体切割、切除神经元突起等。
通过光陷阱操作可移动细胞器的微小颗
粒和结构，广泛应用于染色体、细胞器、细
胞骨架的移动。
在细胞培养时还可以作细胞筛选
G.药物、病毒、细菌的跟踪、定位
利用自发荧光或进行荧光标记，还可以
检测该物质在细胞的分布及进入细胞的动
态过程。
H.荧光蛋白的应用
GFP: 238个氨基酸，分
子量小，479激发，509
发射，其融合的蛋白不
影响结合蛋白的生物活
性，转染的细胞可继续
传代。所以GFP基因可
以作为一种直观、方便
、有效的报告基因。直
接观察蛋白质定位、监
测基因转录变化。
I.笼锁—解笼锁
许多重要生物活性物质都有其笼锁化合物，处于笼锁状
态其功能被封闭，而一旦被特异波长的瞬间光照射后，光活
化解笼锁，恢复原有生物功能。
通过LSCM人为控制多种生物活性产物和其他化合物在
生理过程中发挥功能的时间和空间。
活性蛋白酶
无活性酰基酶
活性部位酯化
光作用
反式肉桂酰
有活性
解笼锁
顺式
J.强大的图像处理功能
图像的加、减、乘、除、比率运算
长度、面积、角度测量
任意空间角度下的三维切面
4.应用思路
动植物组织
冰冻切片
100—5um
自发荧光或荧光染色
荧光染色
培养的细胞、组织
醛类长期固定样品
加入处理
LSCM观察
冰冻切片
100—5um
蒸馏水漂洗3次
5.应用实例
A.实时测量细胞内Ca2+浓度的变化：
贴壁生长
的细胞
缓冲液洗
去杂质
时间序
列扫描
加入药物等
研研究因子
细胞内Ca 2+
浓度估算
图像存储
图像分析
Fluo -3
荧光染色
488激发
525检测
37℃孵育
30min
缓冲液洗脱未结
合染料 10min
6、LSCM的产生
1957年开始提出共聚焦显微镜技术原理。
LSCM作为商品仪器是在80年代初。
真正具有强大功能、完善的光学系统、计算机
控制的LSCM从1997开始形成。
7.我们的仪器配置
我校新购置蔡司510配备
458、477、488、543、633六条可
见激光三个共聚焦通道。能满足绝
大多数荧光染料的要求。
谢谢您的参与!
希望大家交流、指正！
于维军
405nm 0.5s
photo bleaching
405nm 0.25s
photo bleaching