Transcript 播放/下载课件 - 武汉工业学院生物学实验教学示范中心

微生物学实验
武汉工业学院
生物与制药工程学院
课程组人员:
缪礼鸿 胡申才 代江红
周帼萍 曾驰
制作人员:
胡申才
一、课 程 简 介
微生物学实验课是微生物学课程教学中的一个重要环
节。本课程总计48学时，使用教材是沈萍主编的《微生物学
实验》（第三版）。通过本课程的学习，使学生了解微生物
学的基本知识；巩固和加深所学理论知识；掌握微生物学最
基本的操作技能。同时，通过实验，培养学生培养学生独立
思考和理论联系实际能力；养成实事求是、严肃认真的科学
态度，以及敢于创新的开拓精神；并在实验中进一步提高学
生的科学素质修养。
二、 微生物与实际应用
微生物与发酵工程
微生物与环境工程
微生物与农业
微生物与医学领域
微生物与食品工业
三、微生物学与Nobel奖
到目前为止，几十项Nobel生理学和医
学奖，化学奖都与微生物学有关
参考：沈萍教授《微生物学》绪论部分
Nobel获奖者全书
四、如何进行微生物学实验
严肃认真
科学态度
分析问题
搞清原理
五、微生物实验安排与考核
基础实验：80%，12次，一次考试
自主设计实验：20%
设计实验方案
实验操作
总结
汇报
课堂纪律
• 严格遵守实验室规章制度
• 严肃课堂纪律
不允许无故旷课、早退（1次）
迟到（3次）
工作服
实验室安全和卫生
• 安全
实验室严禁吸烟。
注意用水、防电和防火
正确使用化学试剂和仪器
卫生
每次实验需留下6位同学值日，协助保
持实验室清洁
实
实验一
实验二
实验三
实验四
实验五
实验六
实验七
实验八
验
内
容
显微镜使用及简单染色
细菌革兰氏染色
荚膜与芽孢染色
放线菌和蓝细菌的形态观察
霉菌形态特征
酵母菌形态观察、死活细胞鉴别
及细胞大小测定
微生物的数量测定
玻璃器皿的洗涤、包扎、灭菌及
无菌操作台的使用
实验九
实验十
实验十一
实验十二
实验十三
实验十四
实验十五
培养基的配制和灭菌
芽孢杆菌的分离纯化及观察
抗稻瘟霉的芽孢杆菌的分离及筛选
食品或水中大肠菌群的检测
微生物生长曲线的测定
细菌质粒的接合转移与检测
微生物菌种保藏技术
实验一 显微镜使用及
微生物形态观察
显微镜概述
微生物的个体微小，必须借助显微镜才能观察到。因
此，显微镜就成为微生物学研究工作者不可缺少的基本工
具。所以，了解显微镜的种类、结构、功能和正确地掌握
不同显微镜的使用方法是很有必要的。
显微镜可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。光学
显微镜有普通光学显微镜、相差显微镜、微分干涉差显微
镜、暗视野显微镜、紫外光显微镜、偏光显微镜和荧光显
微镜。下面主要介绍普通光学显微镜。
一、目的要求
1.学习显微镜的结构、功能和使用方法。
2.学习并掌握油镜的原理和使用方法。
二、显微镜的基本结构及油镜的
工作原理
1. 普通生物显微镜
由3部分构成：
• ①照明系统：包括光源和聚光器。
• ②光学放大系统：由物镜和目镜组
成，是显微镜的主体。
• ③机械装置：用于固定材料和观察
方便，包括镜台(载物台) 、调节
器和、物镜转换器(旋转器)。
尼康E-600显微镜
基础知识
与其他物镜不同，油镜需在载玻片与镜头之间
加滴镜油，原因有二：
1.
增加照明亮度
油镜的放大倍数可达100x，教具很短，直
径很小，但所需要的光照强度却最大。为
了不使通过的光线有所损失，必须造又精
于加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的
镜油。通常用香柏油（n=1.52）.
2.
增加显微镜的分辨率 油镜的分辨率可达
到0.2μm左右。
2. 显微操作技术
尼康NT-88NE显微操作/注射仪
显微镜的分辨率: 也称为分辨力，它是指能把两个物点辨清的最小距离，
分辨距离越大，则分辨率越低。所以，分辨率是以分辨
距离来表示的。
其计算公式为:
D=0.61入/N·A
N·A·=n · sina/2
式中D为分辨率，A为光波波长，N·A·为物镜的数值孔径(镜口率)。
在物镜上，有镜口率(N.A.)的标志，它反应该镜头
分辨力的大小，其数字越大，表示分辨率越高，各物
镜的镜口率如下表：
物镜
镜口率(N.A.)
工作距离(mm)
10×
0.25
5.40
40×
0.65
0.39
100×
1.30
0.11
• 显微镜的总放大倍数等于目镜和物镜放大倍
数的乘积，
• 公式为:
M = K1xK2
• 焦点深度: 显微镜调焦到看清标本某一
点时，不仅是这一物点，而且它的上下两
侧也能看清楚两侧的厚度叫做焦点深度。
看到标本的全厚度，必须调节螺旋仔细地
从上到下进行观察。
三、 实验步骤
•
(一) 显微镜的使用
• 1. 观察前的准备工作
•
(1)观察者要养成显微镜镜检的工作习惯，观察时
要双眼同时睁开，一边观察一边进行记录或描绘。
•
(2)观察时所用的材料、药品和各种器具要预先准
备好。
•
(3)显微镜在使用之前应检查一下它的各个部件是
否完整和正常，并对载物台、目镜、物镜以及聚光器
上端透镜进行必要的清洁工作。然后进行合轴调节。
2. 显微镜的调节
瞳距调节
屈光度调节
调节
粗调松紧调节旋钮
聚光镜中心调节
②10X物
镜
①标
本
③ 孔径
光栏
⑤ 光轴中心调节
螺钉
④ 聚光镜升降
旋钮
③ 视场
光栏
孔径光栏调节
N.A聚=(0.6-0.8)N.A物
操作步骤如下:
(1）可变光栏的中心对准聚光镜的中心。如果可变光栏的水
平是固定的，则装配时已保证它与聚光镜合轴，不必调整;如果
可变光栏的水平位置可以移动，则应把可变光栏关到最小，使它
的中心孔对准聚光镜下方的透镜中心。
(2)载物台上放置观察标本，把聚光器上升到它上端透镜平
面稍低于载物台平面的高度，并将它的可变光栏开到最大，用低
倍物镜，进行调焦到能看见标本，可调反射镜使视野得到最亮和
最均匀 的照明，或把光栏关小，最亮的照明区正处在视野的中
央。
(3)转到高倍镜，并调焦到看清标本，然后去掉标本，拔出
目镜，眼睛直接向镜筒观察，并把可变 光栏关小，看其亮点是
否在视野中心，如果不是，就要转动聚光器的调节螺旋，把亮点
调到视野中 央，再慢慢开启可变光栏，使视野看到光栏边缘和
聚光镜的边缘相接为止。
3. 观察操作
(1) 低、高倍镜的使用: 先把低倍的物镜用粗调焦螺旋下降至离盖玻片
0.5cm处，然后一边观察视野一边上升物镜，直至看到图像，再将标本移
到视野中心，用细调焦螺旋把物镜调至最清晰处，若要用高倍镜观察时，
把所要进一步放大观察的部位移至视野中央，直接顺时针转换成高倍物镜，
然后用细调焦螺旋调焦，至看清物像。
4、显微镜保养和使用中的注意事项
（1）不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏
。
（2）镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，
以保证光洁度
（3）观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，
最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油
镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或
损伤镜面。
（4）拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜
座，不可单手拿，更不可倾斜拿。
（5）显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生
霉菌而腐蚀镜片。
（二）简单染色
1.定义
是只用一种染料使细菌着色以显示其形
态，不能辨别细菌细胞的构造，通常采用
碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红 等）
使其着色。
Simple stains
2.实验器材
• 菌种： 培养12-16h的枯草杆菌（Bacillus
subtilis ） ， 培 养 24 小 时 的 大 肠 杆 菌
（Escherichia coli）
• 染色液和试剂：草酸铵结晶紫染液、卢
哥氏碘液、95%酒精、蕃红染液、复红、
乙醚酒精溶液、香柏油、无菌水
• 器材： 废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、
酒精灯、擦镜纸、显微镜等。
3.实验方法：
1、简单染色
制片→染色→水洗→干燥→镜检
• （1）制片：取菌种培养物常规涂片、自然
干燥、加热固定；
注意无菌
操作
• （2）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁
架上，加复红染色1-2min。
• （3）水洗：用水洗去涂片上的染色液。
• （4）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用
吸水纸吸干。
• （5）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出
适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香
柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察
细菌的形态。
四、记录实验结果
• 绘图
五、 思考题
• 1.使用油镜时，为使么选用香柏油或液体石蜡作
为物镜与玻片间的介质？其他液体行吗？
• 2.油镜用毕后，为什么必须把镜油擦净？用过多
的二甲苯或用酒精擦镜有什么危害？
• 3.什么是物镜的同焦现象？他在显微镜观察中有
什么意义？
• 4.观察时为什么要用左眼，并且两眼都应睁开？
实验二 细菌革兰氏染色
（一）实验目的
（二）实验原理
（三）实验器材
（四）实验方法
（五）注意事项
（六）实验作业
（一）实验目的
1、学习微生物涂片、染色的操作技术；
2、掌握细菌单染色和革兰氏染色的方法；
3、初步掌握无菌操作技术；
4、掌握革兰氏染色反应原理、操作步骤和
意义。
（二）实验内容及原理
1.革兰氏染色法
是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立
的。革兰氏染色法是细菌学上最常用的鉴别
染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别
为革兰氏阳性菌（G+ ）和革兰氏阴性菌（G- ）
两大类。
结晶紫
1
2
碘液
酒精
复红
3
？
4
革兰氏染色的机理：
主要由于两类细菌的细胞壁成分和结构不同。
（三）实验器材
• 1 、 菌 种 ： 培 养 12-16h 的 枯 草 杆 菌
（Bacillus subtilis），培养24小时的大肠
杆菌（Escherichia coli）
• 2、染色液和试剂： 草酸铵结晶紫染液、
卢哥氏碘液、95%酒精、蕃红染液、复红、
乙醚酒精溶液、香柏油、无菌水
• 3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种
杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜等。
(四）实验方法：
1、革兰氏染色
制片→初染（结晶紫1min）→水洗→媒染
（碘液1min）→水洗→脱色（乙醇20-30s）
→水洗→复染（番红2min）→水洗→干燥→
观察
crystal violet stain
Stain with gram's iodine solution
wash with water
Decolorize by adding 95% alcohol
Counterstain with Safranin
革兰氏阳性杆菌
革兰氏阴性杆菌
（10）实验完毕后的处理
• ①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净：
• a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。
• b.用擦镜纸沾少许乙醚-乙醇混合液将镜头擦2-3次。
• c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。注意擦镜头时
向一个方向擦拭。将显微镜小心轻拿，按号放入显
微镜柜中。
• ②观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干
净，放入回收容器内。
（五）注意事项
• 1、载玻片要洁净无油迹。涂片时，滴水不
要过多，挑菌量宜少，涂片要均匀，菌膜
宜薄。
？
• 2、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。
• 3、染色过程中勿使染色液干涸。
• 4、选用幼龄的细菌。
（六）实验作业
绘出枯草杆菌和大肠杆菌的形态图，并注明
两菌的革兰氏染色的反应性。
1．你认为哪些环节会影响革
兰氏染色结果的正确性？其中最关
键的环节是什么？
2．当你对一株未知菌进行革
兰氏染色时，怎样能确证你的染色
技术操作正确，结果可靠？
实验三 细菌的芽孢和荚膜染色
（一）实验目的
（二）实验原理
（三）实验器材
（四）实验方法
（五）注意事项
（六）实验作业
（一）实验目的
1、继续学习微生物标本的制作方法；
2、掌握芽孢、荚膜染色的基本原理及方法;
3、巩固无菌操作技术。
（二）实验原理
芽孢、荚膜染色法都是利用细菌各部位
（分）的构造不同，它们对染料的亲和力也不
同。因此，可以采用各种特殊染色方法，使细
菌细胞的不同构造能在显微镜下显示出来，便
于观察和区别。
芽孢 又称内生孢子（endospore），是某
些细菌（革兰氏染色阳性杆菌）生长到一定时
间（对数期后期），在细胞内形成一个圆形、
椭圆形或圆柱形的结构。
芽孢有的长在中央或近中央，圆形或
椭圆形，芽孢的大小，位置，在分类鉴定
上有一定的意义，它仅仅是芽孢细菌生活
史的一个环节，它还是检验培养基灭菌彻
底不彻底的依据。
中央芽孢
偏端芽孢
末端芽孢
游离芽孢
芽孢染色原理
芽孢壁厚、透性低，着色和脱色均较
困难，当用弱碱性染料（孔雀绿）在加热的
情况下进行染色时，使染料不仅进入菌体也
可进入芽孢内， 进入菌体的染料经水洗后被
脱色，当用对比度大的复染色剂（蕃红液）
染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，是芽孢
和菌体更易区分。菌体呈红色而芽孢呈绿色。
荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶
状物质，其成分为多糖、糖蛋白或多肽。由
于荚膜与染料的亲和力弱、不易着色；而且
可以溶于水，易在用水冲洗时被除去。
荚膜虽不是细胞的
主要结构，但它是细胞
外碳源和能源性贮藏物
质，并能保护细胞免受
干燥的影响，同时能增
加某些病原菌的致病能
力，使之抵御宿主吞噬
细胞的吞噬。
荚膜染色原理
由于荚膜与染料的亲和力弱、不易着
色；而且可以溶于水，易在用水冲洗时被
除去。通常用负染色法染色，使细菌和背
景着色，背景与菌体之间形成一透明区即
荚膜，便于观察，由于荚膜很薄，容易变
形，在制片是一般不用加热固定。
（三）实验器材
• 1、菌种：蜡样芽孢杆菌约2 d 营养琼脂斜
面 培 养 物 ； 褐 球 固 氮 菌 (Azotobacter
chroococcus) 约2 d 无氮营养基琼脂斜面培
养物。
• 2、染色液和试剂：5％孔雀绿水溶液、0.5
％蕃红溶液、碳素墨水、甲醇、生理盐水
等；
• 3、器材：试管夹、酒精灯、接种针、载
玻片、显微镜、香柏油、乙醚酒精、擦镜
纸等。
(四）实验方法：
切勿煮干
1、芽孢染色
制片→染色（孔雀绿5min）→水洗→复染
（蕃红花红2-3min）→水洗→干燥→镜检
芽孢染色结果
（芽孢呈绿色，营养体及芽孢囊呈红色）
2、荚膜染色（湿墨水法）
•
•
•
（1）制备菌和墨水混合液：加一滴墨水于洁
净的载玻片上，然后挑取少量褐球固氮菌与之
充分混合均匀；
（2）加盖玻片：将一洁净盖波片盖在混合液
上，然后在盖波片上放一张滤纸，轻轻按压以
吸去多余的混合液；
（3）镜检：用低倍镜和高倍镜观察。
荚膜染色结果
背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透
明圈即荚膜。
（五）注意事项
• 1、供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部
分芽孢仍保留在菌体上为宜。
• 2、染色加热过程要及时补充染液，切勿让涂
片干涸。
• 3、荚膜染色涂片不要用加热固定，以免荚膜
皱缩变形。
• 4、涂片不要用力过猛，不要滴加水，以防破
坏其荚膜原形。
（六）实验作业
1 ．绘出表示芽孢杆菌的形态特征，注意芽
孢的形状、着生位置及芽孢囊的形态特征。
2 ．绘图说明你所观察到的细菌的菌体和荚
膜的形态。
1．若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，
很少看到芽孢囊及营养细胞，你认为这是什么
原因?
2．组成荚膜的成分是什么?涂片一般用
什么固定方法，为什么?
实验四
放线菌和蓝细菌形态的观察
•
•
•
•
目的要求
实验材料
实验程序
思考题
I
放线菌形态的观察
一、目的要求
• 学习观察放线菌的基本方法
• 加深理解放线菌的形态特征
二、实验原理
• 群体和个体形态
• 形态观察方法
Filamentous Actinomycetes
• Typical
appearance of a
streptomycete
growing on agar
slants
• The colors are
due to the
production of
pigments
Filamentous Actinomycetes
• Antibiotic
action of soil
microorganisms
on a crowded
plate
streptomycetes
Bacillus
Filamentous Actinomycetes
• Stages in the conversion of a streptomycete’s(链霉菌) aerial
hypha into spores (conidia)
Various types
of spore-bearing
structures in the
streptomycetes
Filamentous Actinomycetes
• Several spore-bearing
structures of actinomycetes:
Streptomyces.
Filamentous Actinomycetes
• A young colony of an actinomycete of the genus Nocardia(奴卡(氏)(
放线)菌属)
（二）观察方法
1、插片染色法
• 28℃插片培养4-6d，轻轻取出盖玻
片，直接观察镜检。
• 观察菌丝和孢子丝自然生长的性状
，其中包括气生菌丝（较粗）、基
内菌丝（较细）和孢子丝的形状，
如分枝状况及孢子丝的卷曲等，并
绘图说明。
• 首先寻找插在培养基的界面分界线
，观察营养菌丝、气生菌丝形态及
分枝情况。
• 调节亮度
• 直接镜检
2. 印片染色法
• 微热载玻片－印片－ 固定 －石炭酸复红染色1min
－水洗－晾干－油镜
三、 实验材料
• 放线菌培养物：天蓝色链霉菌4天培养
物。
• 显微镜、载玻片、接种环、解剖针、
解剖刀、酒精灯、镊子等。
• 酒精、蒸馏水等。
四、实验步骤
1.印片法：
（1）接种培养 用高氏1号培养基平板，常规划线接种，28℃
下培养4-7天。
（2）印片 用灭菌的小刀(或刀片)挑取有单一菌落的培养基一
小块，放在洁净的载玻片上。用镊子取一洁净载玻片，在火
馅上稍微加热，然后把玻片盖放在带菌落的培养基小块上，
再用小镊子轻轻压几下，使菌落的部分菌丝体（气生菌丝，
孢子丝或孢子）压在载玻片上。
（3）固定：载玻片有印迹的一面向上，通过酒精灯火焰三次固
定。
（4）染色
（5）镜检
用石炭酸复红覆盖印迹，染色1-2min后水洗。
干后用油镜观察。
I I 蓝细菌形态的观察
1. 异形胞
是由营养细胞组成的，一般比营养细胞大，在光学显微镜
下观察，细胞内是空的。形成异形胞时，细胞内的贮藏颗
粒溶解，光合作用片层破碎，形成新的膜，同时分泌出新
的细胞壁物质于细胞壁外边。
与营养细胞的区别是：壁厚；细胞质中的颗粒物质溶解，
呈均匀状态；原来的类囊体膜解体，形成新膜；颜色呈淡
黄色或透明状。
异形胞的功能：一是将藻丝细胞分隔成藻殖段进行营养繁
殖；二是细胞内含固氮酶，可直接固定大气中的氮。
厚壁
孢子
异形胞
思考题
• 在用插片法观察气生菌丝和孢子丝的形态时，
要注意些什么？
实验五
霉菌形态特征
一、实验目与基本要求：
学习并掌握观察霉菌形态的基本
方法，了解常见霉菌的基本特征。
二、实验内容：
1．观察霉菌菌落形态。
2．用显微镜观察霉菌装片。
3．制作霉菌装片并观察其形态
。
三、实验步骤
（一）菌落特征的观察
用肉眼观察生长在琼脂平板上的各种霉菌菌落，
并根据下列要求对每种霉菌的菌落特征加以描述。
1.菌落的大小：局限生长或蔓延生长，菌落的直径和
高度。
2.菌落的颜色：正面和背面的颜色，培养基的颜色变
化。
3.菌落的形态：棉絮状、网状、疏松或紧密、同心轮
纹、放线状的皱褶等。
霉
菌
菌
落
各种病原真菌的菌落
各种曲霉的菌落
青霉的菌落
青霉的菌落
隔膜
霉菌菌丝 A、无隔菌丝 B有隔菌丝
（二）个体形态特征的观察
1.乳酸石炭酸制片法观察
（1）制片：在干净的载玻片上加一滴乳
酸石炭酸，用接种针从菌落边缘处取小量
带有孢子的菌丝置于液体中，再小心地把
菌丝放开，然后用盖玻片盖上，注意不要
产生气泡。
（2）镜检：
1）毛霉和黑根霉的孢子的形状、颜色、大
小、孢子囊、中轴体的形状，有无假根和葡
萄菌丝。
2）黑曲霉的分生孢子的形状、颜色、大小、
顶囊的形状、小梗排列隔膜。
3）青霉的分生孢子的形状、颜色、大小、
小梗的排列方式，菌丝的隔膜。
（3）将观察结果绘图，并注意各部分名称。
霉菌的静孢子
左：毛霉的孢子囊；中：孢子囊壁破裂，露出静
孢子；右：囊轴
曲霉的分生孢子梗和顶 青霉的帚状分生孢子梗和分生孢子
囊上的分生孢子
霉菌的厚垣孢子
曲霉的分生孢子头彩图
2.插片培养观察：
（1）插片培养：将已灭菌的盖玻片斜插入
培养基平板上，一半露在外面，然后沿盖玻
片与培养基交接处接种霉菌孢子悬液。24到
26度恒温培养2到4天。
（2）制片、镜检：以无菌操作取下盖玻片，
有菌面朝下，放在滴有一滴棉兰染液的载玻
片上。
四、实验报告
绘制镜检形态图
1．毛霉和根霉形态图，示各部。
2．青霉和曲霉形态图，示各部
五、问题和思考
1．什么叫载玻片湿室培养?它适用于观
察怎样的微生物，有何优点?
2．湿室培养时为何用20%甘油作保湿剂?
实验六
酵母菌的形态观察、
死活鉴别及大小测定
I 酵母菌的形态观察及
死活鉴别
（一）实验目的
（二）实验原理
（三）实验器材
（四）实验方法
（五）注意事项
（六）实验作业
（一）实验目的
1、观察酵母菌的细胞形态及出芽生殖方式；
2、学习掌握区分酵母菌死、活细胞的染色
方法；
3、掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌
的区别。
（二）实验原理
酵母菌是多形的、不运动的单细胞真
核微生物。无性繁殖主要是出芽生殖。
本实验通过用美蓝染色浸片来观察
生活的酵母形态和出芽生殖方式。
美蓝 是一种无毒性染料，它的氧化型是
蓝色的，而还原型是无色的，用它来对酵母
的活细胞进行染色。
还原剂
美蓝（氧化型）
蓝色
氧化剂
美蓝（还原型）
无色
死活细胞鉴别原理
酵母活细胞
新陈代谢
还原能力
美蓝（氧化型）
蓝色
美蓝（还原型）
无色
（三）实验器材
• 1 、 菌 种 ： 酿 酒 酵 母 （ Saccharomyces
cerevisiae）培养约2d的麦芽汁斜面培养物；
• 2、染色液和试剂：0.05％和0.1% 吕氏碱
性美蓝染液；
• 3、器材：废液缸、载玻片、盖玻片、酒
精灯、擦镜纸、显微镜等。
(四）实验方法（美蓝浸片）染液不宜过
 在载玻片中央加一滴0.1％吕
氏碱性美蓝染色液，用接种
环挑取少量酵母菌苔放入上
述液滴里，混合均匀；
 用镊子取一块盖玻片，先将
一边与菌液接触，然后慢慢
将盖玻片放下使其盖在菌液
上；
多或过少
盖玻片不宜
平着放下
 将制片放置约3min，先低倍镜后高倍
镜观察酵母形态和出芽情况，并根据
颜色区别死活细胞。
 染色30min后再次观察，注意死活细
胞数量的变化；
 用0.05％的吕氏碱性美蓝染色液重
复上述操作。
（五）注意事项
• 1、加染液不宜过多或过少，否则，在盖上
盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡而
影响观察；
• 2、盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡影
响观察。
II 酵母细胞大小测定
------显微镜测微技术
一、实验目的
1）学习用测微尺测量微生物细胞大小。
2）掌握台镜测微尺和目镜测微尺的使用方
法。
二、材料与仪器
1、酿酒酵母
2、显微镜、物镜测微尺、目镜测微尺
三、基本原理
微生物细胞大小，是其形态特征重要标
志之一。每一种微生物在一定条件下，有
其相对固有的大小形态。它是分类鉴定的
依据之一。其大小测定可用测微尺测量。
测微尺分为目镜测微尺和物镜测微尺两部
分。
目镜测微尺：是一块可以放入接目镜内的
特定圆形玻璃片。玻片中央是一个细长带
刻度的尺，等分成50或100小格，每个等分
线间距为0.1mm。由于不同显微镜的放大倍
数不同，故目镜测微尺每格实际代表长度
随显微镜的不同而不同。因此在使用前必
须用物镜测微尺校正，以求得在一定接物
镜及目镜等光学系统下，目镜测微尺每格
所代表的实际长度。
物镜测微尺是一块中央部分刻有精确等分
线的载玻片。每一刻度间距为10um即把1mm
等分为100格，是专门为校正目镜测微尺实际
数值用的。
四、方法与步骤
1、目镜测微尺的校正
1）将目镜测微尺装入目境内，刻度朝下，并将物
镜测微尺朝上置载物台上。
2）用低倍镜核对，至能清晰看到物镜测微尺。
3）改用高倍镜或油镜对焦后，转动目镜，使目镜
测微的刻度和物镜测微尺刻度平行。
4)两尺吻合后，先使两尺的一端某一刻度完全重合
，然后再寻找另一端第二条重叠的刻度。
• 5)计下两吻合刻度间，目镜测微尺与物镜测
微尺的格数。按下列公式算出目镜测微尺每
小格所代表长度。
• 目镜测微尺每格长度（微米）
两吻合刻度间物镜测微尺格数×10μm
=
两吻和刻度间目镜测微尺格数
• 例如：目镜测微尺的5格等于物镜测微尺的2
格，则目镜测微尺1格=（2×10）/5=4微米
•目镜测微尺安装方法
目镜测微尺
•一
•镜台测微尺及其中央部分的放大
•目镜测微尺
镜台测微尺校准目镜测微尺时的情况
2、酵母细胞大小测定：
1）制作酵母水浸片
2)取下镜台测微尺，将“水浸片”标本置于载物
台上。
3）先用低倍镜观察到目标后，转换高倍镜测量
酵母的大小，测量10—20个菌体，求出其平
均值。
四、测量结果记录：
在高倍镜下：
• 目镜测微尺——格=物镜测微尺——格
• 目镜测微尺1格=
微米
酵母细胞长度=目镜测微尺平均——格
= ——微米
宽度=目镜测微尺平均——格= ——微米
注：要求测量10个酵母细胞的平均值
五、 实验作业
绘图说明你所观察到的酵母菌的细胞结构及
出芽生殖方式。
1、吕氏碱性美蓝染液浓度和作
用时间的不同，对酵母菌死细胞数
量有何影响？试分析其原因。
2、为何更换不同倍数目镜和物
镜时，必须要重新标定？
第七章 微生物的数量测定
I
显微镜直接计数法
II 稀释涂布法
I
显微镜直接计数法
（一）实验目的
（二）实验原理
（三）实验器材
（四）实验方法
（一）实验目的
1、了解显微镜计数的原理；
2、学习并掌握使用血球计数板进行微生
物直接计数的方法。
（二）实验原理
利用血球计数板在显微镜下直接计数，是微
生物实验中一种十分重要的常用微生物计数方
法。此法的优点是直观、快速，不论微生物的
生理状况如何，都可以在显微镜下一一计数。
由于此法得到的是活菌和死菌的总和，故又称
为总菌计数法。
血球计数板是一块特制的载
玻片，其上四条纵槽构成了三个
平台，中间的平台又被一短横槽
隔成两半，每一边的平台上各刻
有一个方格网，每个方格网共分
成9个大方格，中央的大方格为
计数室。计数室边长1mm，共有
400个小方格，加盖玻片于突起
部分上时，即形成一个体积为
0.1mm3的计数室。
计数室的规格有两种：一种
是25个中方格×16个小格，另一
种是16个中方格×25个小格，所
以小方格的总数是相同的，都为
400个。
• 在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后
求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就
得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml
菌液中的总菌数。如果设五个中方格的总菌数
为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中
的总菌数即（0.1mm3中的总菌数）为 A／5 ×
16(或25)×B。所以1ml菌液中的总菌数 = A／
5×16（或25）×10×1000×B。
（三）实验器材
1.菌种
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌悬
液
2.器具
显微镜、血球计数板、酒精灯、接种环、无菌
水、吸管、盖玻片、计数器。
（四）实验方法
1.稀释
将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，
可不必稀释。
2.镜检计数室
在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若
有污物，则需清洗后才能进行计数。
3．加样品
将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无
菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片
边缘滴一小滴（不宜过多）让菌液沿缝隙靠毛
细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能
充满菌液。注意不可有气泡产生。
4.显微镜计数
静置几分钟，将计数板放在显微镜下，先用低倍镜找到
计数室，再换成高倍镜进行计数；每个计数室选右上
右下、左上左下和中间的五个中方格中的菌体进行计
数，每个样品重复计数两次
5.清洗血球计数板
计数完毕，将计数板在水龙头下冲洗干净后自行晾干或
用吹风机吹干，镜检观察每小格内无残留物为止。
注意事项
1、加样时先摇匀菌液，计数室中不可有气泡产
生；
2、计数时，格线上的菌体只数上方和右边线上
的；
3、如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半
时，作为两个菌体计算；
4、清洗计数板时切勿用手或硬物刷洗。
II
稀释涂布法
（一）实验原理
（二）实验方法
实验方法
1、倒平板：每皿约15ml，
2、编号：对平板和稀释用试管分别编号。
3、稀释：放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支
吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精
确，结果误差较大。
4、取样：选择合适的三个稀释度，用三支无菌吸管
分别吸取三个稀释度的菌悬液，对号放入编好号的
无菌平皿中。不要用1ml吸管每次只靠吸管尖部吸
0.2ml稀释菌液放入平皿中，这样容易加大同一稀
释度几个重复平板间的操作误差。
5、涂布：用灭过菌的涂布棒将菌悬液均匀涂布在平
皿表面。涂完后，旋转90度再涂布。
以上倒平板、稀释、涂布均要进行无菌操作
6、计数：培养48小时后，取出培养平板，一般选择
每个平板上有30—300个菌落的稀释度计数。算出
同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公
式计算：
每毫升中菌落形成单位（cfu）=同一稀释度三次重复
的平均菌落数×稀释倍数×5
(五)
作业
显微直接计数结果
计
数
室
第一室
第二室
各格中菌数
1
2
3
4
5
总
菌
数
稀
释
度
菌 平
数 均
值
/ml
实验八 玻璃器皿的洗涤、包扎、灭菌
及无菌操作台的使用
一、实验目的
1. 掌握玻璃器皿的洗涤和包扎方法；
2. 了解玻璃器皿的灭菌方法和原理；
3.了解无菌操作台的使用。
二、实验原理
• 微生物学实验所用的器皿，大多要进行消毒、灭
菌和用来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包
装方法均有一定的要求。清洁的玻璃器皿是实验
得到正确结果的先决条件，包扎方法要能保证防
止污染杂菌。空的玻璃器皿一般用干热灭菌，若
用湿热灭菌，则要多用几层报纸包扎。
三、实验器材
• 试管、培养皿、吸管、棉花、包扎绳、
三角瓶、电热烘箱等。
四、操作步骤
（一）玻璃器皿的洗涤方法
• 1、新玻璃器皿的洗涤
• 在2%的盐酸溶液中浸泡数小时，用自来水冲洗干净
。
• 2、旧玻璃器皿的洗涤
（1）试管、培养皿、三角瓶：洗衣粉和去污粉洗刷，
自来水冲洗
• 装有固体培养基：刮掉，洗涤
• 带菌的器皿：2%来苏尔或0.25%新洁
尔灭消毒液中浸泡24小时或煮沸0.5
小时，然后洗涤
• 带病原菌培养物的器皿：先高压蒸
汽灭菌，倒去培养物后在洗涤
• （2）玻璃吸管：吸管尖端与装在水龙头上的橡皮
管连接，反复冲洗
• 吸过血液、血清、糖溶液或染料溶液等的玻璃吸
管：立即投入盛有自来水的容器中浸泡，实验后
集中冲洗。
• 塞有棉花的吸管：用水将棉花冲出，然后冲洗
• 吸过含有微生物培养物的吸管：2%来苏尔或
0.25%新洁尔灭消毒液中浸泡24小时然后洗涤
• 吸管内壁有油垢：洗涤液中浸泡数小时，再冲洗
（3）载玻片与盖玻片
• 带有香柏油：用皱纹纸擦或在二甲苯中摇晃几次，
然后在肥皂水中煮沸5-10分钟，用软布或脱脂棉擦
拭，立即用自来水冲洗，然后在稀洗涤液中浸泡
0.5-2小时，自来水冲洗，干后在95%乙醇中保存备
用。
• 检查过活菌的：2%来苏尔或0.25%新洁尔灭消毒液
中浸泡24小时然后按上述方法洗涤。
（二）玻璃器皿的包扎
1、培养皿的包扎：一般以5-8套培养皿做一包
2、吸管的包扎：准备好干燥的吸管，在距其粗头顶端约
0.5cm处，塞一小段1.5cm长的棉花，然后将吸管尖端斜
放在旧报纸条的近左端，与报纸成30度角，并将左端多
余的一段纸覆折在吸管上，再将整根吸管卷入报纸，右
端多余的报纸打一小结。
3、试管和三角瓶等的包扎：试管口和三角瓶口用棉花塞或
泡膜塑料塞，然后在棉花塞与管口和瓶口的外面用二层
报纸与细线扎好。
（三）灭菌
灭菌是指应用物理或化学的方法，杀灭物
体表面和内部一切微生物营养体、芽孢和孢
子。灭菌方法很多，可分为加热、过滤、照
射和化学药品法等。
常用加热灭菌法：
1、干热灭菌：
用火焰烧灼或电热干燥箱内高温热空气灭菌
2、湿热灭菌
⑴高压蒸汽灭菌法
⑵间歇灭菌法
⑶煮沸消毒法
1、干热灭菌法
A、原理：利用干的热空气使微生物细胞内
的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
B、操作方法：装入待灭菌物品→关门→升
温→恒温→降温→开箱取物。
C、灭菌条件：160-170℃，1-2小时。
2.高压蒸汽灭菌，1210C灭菌20分钟。
（四）无菌操作台的使用
紫外杀菌
内外压力差
垂直送风
水平送风
保持空间无菌操作
五、结果记录
（略）
六、思考题
玻璃器皿干热灭菌时应该注意哪些问题，
为什么？
实验九
培养基的配制和灭菌
（一）实验目的
（二）实验原理
（三）实验器材
（四）实验方法
（五）实验作业
（一）实验目的
1、明确培养基的配制原则；
2、掌握配制培养基的一般方法和步骤；
3、了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围；
4、掌握高压蒸汽灭菌技术，了解几种常用灭菌
方法。
（二）实验原理
培养基是按照微生物生长繁殖或积累代谢产物
所需的各种营养物质，用人工方法配制而成的一
种基质。它包括碳源、氮源、能源、生长因子、
无机盐和水六类营养要素。由于不同微生物细胞
组成不同，因而所需营养基质不同，为了分离、
培养和鉴定不同的微生物，必须根据其需要，配
制合适的培养基.
培养基的种类繁多，根据培养基的成分、物
理性状不同，可分为天然培养基、合成培养基、
半合成培养基、固体培养基、半固体培养基和液
体培养基。
（三）实验器材
• 1.药品和试剂：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、10％
NaOH溶液、10％盐酸溶液。
• 2.器材：天平、药匙、瓷缸、玻璃棒、电炉、
PH试纸、试管、三角瓶、分装漏斗、牛皮纸、
棉花、线绳、干燥箱、高压锅。
（四）实验方法
培养基的制备过程
称量---溶解----调节pH值----过滤----分
装及包扎----灭菌----灭菌后试管摆放斜
面
• 1.称量
按照培养基配方，准确称量各成份放于瓷缸中。
• 配方：牛肉膏5.0 g,蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g,琼脂
20.0 g,蒸馏水1000 ml, pH 7.0。
• 2.溶解
• 向上述瓷缸中加入所需要的水量，搅拌，加热使
其溶解。如是配制固体培养基，在琼脂的熔化过
程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢
出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水分。
• 3.调节pH值
• 用玻璃棒沾少许液体，测量PH值。用氢氧化钠和
盐酸调节PH。
• 4.过滤
用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省
去。
• 5.分装及包扎
• 根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试
管内（用分装漏斗）或三角瓶内，管（瓶）口
塞上棉塞。最后用牛皮纸将棉塞部分包好。
6. 灭菌后试管摆放斜面
注 意 事 项
1、称取药品时严防药品混杂，一把牛角匙称一种药品；
2、蛋白胨极易吸湿，称取时动作要迅速；
2、配制固体培养基时，先将其他药品加热溶解到快沸时，再将称好
的琼脂加入，继续加热至琼脂完全熔化，此过程要不断搅拌，以免
琼脂糊底，并控制火力，防止沸腾外溢；
4、分装量根据试管大小和实际需要而定，固体培养基装量约为管高
的1/5，液体培养基的装量约为管高的1/4，三角瓶的装量不超过瓶
体的1/2 ；
5、分装过程中注意不要将培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞
而引起污染。
返 回
（五）实验作业
• 1.思考牛肉膏蛋白胨培养基属于何种培养
基？
• 2.为什么湿热灭菌比干热灭菌法更有效？
实验十 芽孢杆菌的分离纯化及
观察
• （一）实验目的
• （二）实验原理
• （三）实验器材
• （四）实验方法
• （五）实验作业
（一）实验目的
1、了解微生物分离和纯化的原理
2、掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化接
种培养的基本操作技术，掌握微生物的无菌操作
技术。
（二）实验原理
在自然界中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生
活在一起的，为了生产和科学研究的需要，当我们希望获
得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离出
它，以得到只含有这一种微生物的纯培养物，这种获得纯
培养物的方法称为微生物的分离与纯化。
为了获得纯种的微生物，一般根据该微生物营养或培
养特点，或对某种抑制剂的耐受性不同，或对某种环境条
件要求不同，从而制作或设置一些选择性培养基，或选择
性培养条件，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或划
线法分离，纯化该微生物，直至得到该纯种菌株。
（三）实验器材
• 1. 样品 土样
• 2.培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。
• 3.其它 盛9ml无菌水的试管、盛90ml无菌水并
带有玻璃珠的三角瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸
管、接种环、无菌培养皿。
（四）实验方法
（一）稀释涂布平板法
图14-1 从土壤中分离微生物操作过程
（1）土壤稀释液的制备
• ① 称取土样10g，放入盛90ml无菌水三角瓶中，振
荡15～20分钟，使微生物细胞分散，静置约20～30
秒，即成10-1的土壤悬液。再将土壤悬液置于80 90℃水浴中保温10 min。
• ② 另取装有9ml无菌水的试管，编号为10-2、10-3、
10-4、10-5、10-6及10-7，用无菌吸管吸取10-1土壤
悬液lml，加入编号10-2的无菌试管中，吹吸三次，
使之混合均匀，即成10-2的土壤稀释液。再用另一
支吸管吸取10-2试管中的土壤稀释液1ml，加入编
号10-3的无菌试管中，轻轻摇动，使之混合均匀，
即成10-3的土壤稀释液，一定要每次更换一支无菌
吸管（连续稀释）。同法依次分别稀释成10-4、105和10-6等一系列稀释度菌悬液
（2）平板制作
将无菌培养皿编上10-4、10-5、10-6号码，每一号码
设三个重复，用1ml无菌吸管按无菌操作要求吸10-6稀释
液各1ml，分别放入编号10-6的三个培养皿中。同法吸取
10-5稀释液各1ml，分别放入编号10-5的三个培养皿中。再
吸取10-4稀释液各1ml，分别放入编号10-4的三个培养皿中。
然后在9个培养皿中分别倒入15ml已融化并且冷却至45℃
左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，加盖后轻轻摇动培养
皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝固后即成
平板，整个操作过程应严格按照无菌操作
（3）培养与移植
待平板完全冷凝后，将平板倒置37℃恒温箱中培养
24～48小时，检查分离结果。将培养后长出的单个菌
落分别挑取接种到牛肉膏蛋白胨培养基的斜面上，然
后置于37℃恒温箱中培养，待菌苔长出后，检查菌苔
是否单纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的
微生物，若有其它杂菌混杂，就可再一次进行分离、
纯化，直至获得纯培养。
（二）平板划线分离法
交叉划线法
连续划线法
（三）培养及形态观察
培养及观察：平板置28～30℃培养2－3天，挑取菌落制
片，用石碳酸复红染色1-2min，镜检，观察记录菌体、
芽孢的形态。并且观察记录单个菌落的培养特征。
（五）实验作业
1．在你所实验的三种培养基平板上长出的菌落属于
哪个类群？简述它们的菌落形态特征。
2．稀释分离时，为什么要将已融化的琼脂培养基冷
却到45～50℃左右才能倾入到装有菌液的培养皿内？
3．划线分离时，为什么每次都要将接种环上多余的
菌体烧掉？划线为何不能重叠？
4．培养时为什么要将培养皿倒置培养？
实验十一
抗稻瘟霉的芽孢杆菌的分离筛选
一、目的要求
1.了解病原菌拮抗菌的筛选方法
2.了解芽孢杆菌具有作为拮抗菌开发的巨大
潜力
二、实验原理
1、杯碟法
采用抑菌圈法，亦称平板扩散法。杯碟法
方法
培养菌液
溶化的琼脂48℃
无菌操作
混合
倒平板
有抑菌圈为
阳性反应
放检样杯碟
培养
二、实验原理
2、对峙培养法
可将病原菌和测试菌分别相对着划线接种，
相隔大概2cm左右，当测试菌对病原菌有
拮抗作用，病原菌和测试菌之间就有一道
“不可逾越的鸿沟”。
此法简单易行，故被选定为
本实验拮抗菌的筛选方法
三、实验方法步骤
1、对峙培养法
采用对峙培养法筛选具有拮抗活性的菌株。
接种灰霉病菌到PDA固体24℃培养一天后，①挑取
拮抗菌的菌丝接种到距灰霉病菌落边缘2 cm左右
处，24℃培养48-72 h后观察该菌株抑菌圈半径的
大小；②将分离纯化的内生细菌用接种环挑取少
量在距灰霉病菌落边缘2 cm左右处，24℃培养4872 h后观察该菌株抑菌圈半径的大小。
四、思考题
1、为何本实验采用对峙培养法而非杯碟法
来筛选稻瘟霉的拮抗菌？
实验十二
食品或水中大肠菌群的检测
一、目的要求
1.了解食品卫生微生物学的重要性及其原理
2.学会水和食品中大肠菌群数的测定方法
二、基本原理
水和食品中的微生物数量主要考虑到的是细菌特别是
病原菌的数量。这些细菌主要来源于土壤、垃圾、粪便等，
尤其是后者。若饮用水、酿造水和食品中发现有大肠群细菌，
就有可能存在肠道病原菌，可能会危害人们的健康，因此，
进行食品卫生的微生物学检验是十分重要的。
一般情况下，主要是测定水和食品中细菌菌落总数和
大肠菌群数。细菌菌落总数是指水中或食品检样经处理后，
在一定条件培养后，所得1 g或1 mL检样中所含细菌菌落的总
数，其主要作为判定水和食品被污染程度的标志（采用稀释
涂布法测定，本实验略）。大肠菌群是肠道最普遍存在和数
量最多的一群细菌、常将其作为人畜粪便污染的标志。水和
食品中大肠菌群数是以每100 mL（g）检样中大肠菌群最可能
数（MPN）表示的。
不同微生物发酵产物的不同，也是细菌分类鉴定的重要依据。
大肠杆菌：
产酸产气
丙酮酸裂解生成乙酰CoA与甲酸，甲酸在酸性条件下可
进一步裂解生成H2和CO2
志贺氏菌：
产酸不产气
丙酮酸裂解生成乙酰CoA与甲酸，但不能使甲酸裂解产生
H2和CO2
三、材料与器皿
(—)培养基
1、普通乳糖蛋白胨培养液
蛋白胨
牛肉膏
乳糖
氯化钠
1.6％溴甲酚紫乙醇液
蒸馏水
pH
10g
3g
5g
5g
1.0mL
1000mL
7.2~7.4
将蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠加
热 溶 解 于 1000mL 蒸 馏 水 中 ， 调 节 pH 为
7.2~7.4 ， 再 加 入 1.6 ％ 溴 甲 酚 紫 乙 醇 液
1.0mL，充分混匀，分装于有杜汉氏小管的
试管中，每管10mL，115℃灭菌20min。
2、三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液
按上述普通乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配
制，分装于有杜汉氏小管的试管中，每管
5mL。
3、品红亚硫酸钠培养基（供平板分离用）
蛋白胨
10g
乳糖
10g
K2HPO4
3.5g
琼脂
15～20g
蒸馏水
1000mL
无水亚硫酸钠
5g左右
5％的碱性品红乙醇溶液
20mL
pH
7.2~7.4
4、伊红美蓝培养基（EMB培养基）（供发酵法平
板分离用，3和4可任选一种）
蛋白胨
10g
乳糖
10g
K2HPO4
2.0g
琼脂
20g
蒸馏水
1000mL
2％伊红（曙红）水溶液 20mL
5％美蓝（亚甲蓝）水溶液 13mL
pH
7.2~7.4
三、方法与步骤
(一)水样的采集
供细菌学检验的水样，必须按一般无菌操作的基
本要求采集，并保证再运送、贮存过程中不受污
染。水样从采集到检验不应超过4小时，在0～4℃
下保存不应超过24小时，如不能在4小时内分析，
应在检验报告上注明保存时间和条件。
（1）自来水取样：应在水龙头打开放水5分
钟，再用无菌容器接取水样，待分析。如
水样内含有余氯，则采样瓶灭菌后按每
500mL水样加3％Na2S2O3.5H2O溶液1mL。
江、河、湖、池自然水体取样：可用采样
器，采样瓶应先灭菌。采样后，瓶内应留
有空隙。如果与其他化验项目联合取样，
细菌学分析水样应采在其他样品之前。
（二）初发酵试验
水样稀释：制备水样10-1、10-2的稀释液，
方法为用无菌移液管吸取水样10mL放于
盛有90mL无菌水和若干玻璃珠的锥形瓶
中，充分振荡使混合均匀，并使其中的
细菌尽量呈单个存在，即为10-1稀释液；
再从10-1制备10-2稀释液。以此类推，稀
释到所需倍数。
（2）接种和培养：以无菌操作于5支三倍浓缩
培养基（接种前一定应先检查杜汉氏小管内有无
气泡）中各加入水样10mL，5支普通培养基试管
中加入水样1mL，5支普通培养基试管中加入10-1
稀释液1mL， 小心混匀放入37℃培养箱中培养24
小时。此即5管法。
（3） 结果观察：37℃中培养24h后取出观察，
观察有无气体（杜汉氏小管内有无气体）和酸产
生（培养基有无变色）。在48h之间，培养管内倒
置的杜汉氏小管内有任何量的气体积累，或培养
基颜色从紫色变为黄色，便可初步断定为阳性反
应。
(三)平板培养试验
将初发酵实验中产酸产气的后只产酸或
只产气的试管中的培养物用接种环取少
许，划线接种在品红亚硫酸钠培养基或
伊红美蓝培养基平板上，为了确保获得
分离的单菌落，须注意以下事项：
注意事项
（1）划线间距至少相隔0.5厘米；
（2）接种钉尖端要稍弯；
（3）先对试管轻击并使之倾斜，以免接种针
挑取到任何膜状物或浮渣；
（4）划线时要用针尖的弯曲部分接触琼脂培
养基平面．以免刮伤或戳破培养基。划线
后培养皿倒置，于37℃培养18～24h。
24h后，观察在平板上出现的单个菌落，
其核心有深绿色金属光泽者为较典型的大肠
菌群菌落。尽可能挑取典型的或接近典型的
大肠菌群菌落，在营养琼脂斜面上划线，置
37℃培养24h。挑取斜面培养物制成涂片，
进行革兰氏染色，凡属革兰氏阴性杆菌，即
确认了大肠菌群细菌的存在．
(四)复发酵验证实验
经上述经染色为革兰氏阴性的典型菌
落，用接种环刮取部分接种于盛有乳糖培
养基的试管中，在37℃培养24h，阳性反应
者即确认为大肠菌群细菌。
四、结果计算
在初发酵试验中，可能有极少数能发
酵乳糖产气的非大肠菌群细菌混在阳性可
疑反应管中，通过对初发酵中的阳性可疑
管进行平板和复发酵试验，并进行革兰氏
染色和细菌形态的观察，可将那些少量的
非大肠菌群细菌(“假阳性管”)删除去，故
在记录时只能把三步试验都呈阳性的试管
计入阳性反应管。
如果初发酵接种水样量为10mL、1mL、0.1mL，可直接
查表4－2求出原水样100mL中大肠菌群指数（MPN）。如果
接种水样量低于上述水样量，则经下面的换算式计算。
目前我国系以1L水样中的菌数为报告值，即为MPN×10。
10
（mL）
MPN  MPN 指数×
接种量最大的一管的水样量（mL）
目前我国系以1L水样中的菌数为
报告值，即为MPN×10。
水样的总大肠菌群检索表
每100ml中的细菌的MPN
出现阳性反应的试管数
10ml管中
1ml管中
0.1ml管中
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
2
3
4
5
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
0
0
0
0
0
0
4
4
4
4
4
4
0
1
2
3
4
5
10ml管中
0
2
4
5
7
9
0
1
2
3
4
5
出现阳性反应的试管数
0
0
0
0
0
0
1ml管中
2
2
2
2
2
2
每100ml中的细菌的MPN
0.1ml管中
4
6
7
9
11
13
0
1
2
3
4
5
2
4
6
7
9
11
0
0
0
0
0
0
3
3
3
3
3
3
0
1
2
3
4
5
6
7
9
11
13
15
8
9
11
13
15
17
1
1
1
1
1
1
3
3
3
3
3
3
0
1
2
3
4
5
8
10
12
15
17
19
下略
五、实验报告
1、 简述实验过程。
2、计算实验结果。
六、思考题
 用倾注平板法和涂布平板法计数，其平板上长出
的菌落有何不同？为什么要培养较长时间（48小时）
后观察结果？
 大肠菌群的定义是什么？
 大肠菌群中的细菌种类，一般并非是病原菌，为
什么要选用大 肠菌群作为食品被污染的指标？
实验十三 微生物生长曲线的测定
一、实验目的
1.通过大肠杆菌数量的测量理解大肠杆菌的生
物特征和规律，绘制生长曲线；
2.学习使用光密度法测定菌数。
二、实验原理
• 适宜的条件下，在一定体积的培养基中培养某一
纯种微生物，并定时取样，测定细胞的数目。以
时间为横坐标、细胞数目的对数为纵坐标，可作
出该种微生物的生长曲线。经历延迟期、对数期
、稳定期和衰亡期四个阶段。
三、实验器材
• 分光光度计、大肠杆菌液体培养
物、无菌水、1ml、2ml和5ml无
菌吸管、试管架、恒温摇床等。
四、操作步骤
• 1、制备YEPD培养基
• 2、活化菌种：活化三次。
• 3、接种培养：接种2%的大肠杆菌菌于三角瓶液
体LB培养基中，摇匀。取5ml放入灭菌的试管中
（作为空白对照）。三角瓶于摇床中30℃培养。
每隔2h取样一次，均放入做好标签的灭菌空试管
中，并于冰箱中保存。
4、生长曲线的测定
（1）总菌数的测定
• 将上述培养液逐次进行稀释，然后选择合
适的稀释度进行光密度值的测定。并作出
大肠杆菌生长过程中总菌数的变化情况。
（2）活菌数的测定
• 将上述培养液逐次进行稀释，然后选择合
适的稀释度进行平板菌落计数。并作出大
肠杆菌生长过程中活菌数的变化情况。
• 五、结果记录
• 培养时间（h）0、2、4、6、8、10、12和14细
胞总数（个/ml）活细胞数（个/ml）
• 六、思考题
• 试比较平板菌落计数法和光密度法的优缺点及
应用。
实验十四
细菌质粒的接合转移
与检测
（一）实验目的
（二）实验原理
（三）实验器材
（四）实验方法
（五）实验作业
（一）实验目的
掌握细菌之间通过接合转移方式交换遗传物
质的基本原理与方法
（二）实验原理
细菌的遗传重组有接合转移、转化和
转导三种方式。本实验中，将供体菌、协
助菌与受体菌混合起来，使菌体细胞紧密
接触，供体中的质粒可以在协助菌的帮助
下通过接合转移方式导入受体菌中。
例如，由于所用供体
质粒pHNC3中不含
转移基因tra，所以，
该接合转移必须有辅
助菌株E.coli
(pRK2013)参加才能
完成(pRK2013含tra
基因)，因此该接合
转移过程称为三亲本
杂交。
（三）实验器材
（1）活材料
1）受体菌：快生型大豆根瘤菌（Tcs、Kms）；
2）辅助质粒：E. coli MM294（pRK2013）（Tra+，Kmr）；
3）供体菌： E. coli DH5α(pHNC3)（Mob+、Tcr、Kmr、lux+）
（2）培养基
1）YMA培养基；
2）SM培养基；
3）TY培养基
（四）实验方法
（1）供体菌C3和辅助菌2013在含Km 的LB平板固体培
养基上划线活化，培养16-18 h，再接到含Km 的LB液
体培养基中，过夜培养，直至对数期；
（2）受体菌在YMA平板上划线活化，培养2-3d，然后
接种到含Amp的TY液体培养基中，振荡培养2d，至对数
期；
（3）将这三种菌按1：1：1体积混合，离心5min，得
到混合菌体。
（4）用不加抗生素的TY液体培养基洗涤后收集菌体；
（5）将灭菌滤纸片贴于TY平板上，菌体涂布在滤纸上。
（四）实验方法
（6）培养2-3d后，无菌水洗下菌液，取适当稀释度涂
平板（SM和SM+Km）；
（7）培养一周，挑选接合子，验证其特性并计算转移
频率。
（五）思考题
1、在你的试验中，分别涂布有供、受
体菌的两个对照平板上，是否有个别菌
落形成？说明有或没有的原因。
2、亲本菌株中卡那霉素（Kn）标记的
意义是什么？
实验十五
微生物菌种保藏技术
（一）实验目的
（二）实验原理
（三）实验器材
（四）实验方法
（五）实验作业
（一）实验目的
1、学习和掌握菌种保藏的基本原理；
2、了解各种保藏方法的优缺点及其适用的目
标微生物；
3、学习并掌握几种常用的微生物菌种保藏方
法。
（二）实验原理
由于微生物种类繁多，且保存方法的难
易程度不同，所以微生物菌种的保藏方法
也有许多。
菌种保藏的基本原理都要求使微生物的
代谢作用降至最低程度，从而使其处于不
活泼的状态，即休眠状态；
从环境条件来说，就是要选用低温、干
燥和缺氧等三个条件。
几种常用的保藏方法：
1、传代培养法
保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱
肉培养基（用于厌氧细菌）培养好后，
置4C˚冰箱中存放，定期进行传代培
养、再存放。
可用胶塞代替棉塞或在斜面上覆
盖一层无菌液体石蜡来进一步延长保
存期。
此法优点是操作简单、使用方便，
缺点是保藏时间短、易被污染。
2、悬液法
将微生物混悬于适当溶液中，包括蒸馏
水、蔗糖、葡萄糖等糖液，磷酸缓冲液、食
盐水等。
悬液法操作简便、效果较好。
3、载体法
使生长合适的微生物吸附在一定的载体
上进行干燥。
常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、
麸皮、磁珠和滤纸片等。
该法操作通常比较简单，普通实验室均
可进行。
4、真空干燥法
这类方法包括冷冻真空干燥法和L－
干燥法。
冷冻真空干燥法是将要保藏的微生
物样品先经低温预冻，然后在低温状态
下进行减压干燥。
L-干燥法则不需要低温预冻样品，
只是使样品维持在10－20C˚范围内进行
真空干燥。
冷冻干燥安瓿管处理方法
冷冻真空干燥简易装置
5、冷冻法
使菌种始终存放在低温环境下的保藏
方法。包括低温法和液氮法。
此法关键是要克服细胞的冷冻损伤。
注意控制降温速率及保护剂的使用。
（三）实验器材
• 1、菌种：培养12-16h的大肠杆菌，
灰色链霉素，酿酒酵母；
• 2、试剂： 液体石蜡、河沙、红土
等；
• 3、器材： 无菌吸管、安瓿管、60
目筛子、冰箱等。
(四）实验方法：
1、液体石蜡法
• （1）矿油灭菌：将液体石蜡分装包扎，121℃
灭菌30min后，放在40 ℃温箱中使水蒸气蒸发
备用 ；
• （2）菌种培养：将菌种在斜面上培养成熟；
• （3）灌注矿物油：用无菌吸管吸取无菌的液
体石蜡，加入已长好菌的斜面上，其用量以高
出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝；
• （4）低温（5 ℃左右）保藏 ：将试管直立，
置冰箱中保存。
2、砂管保藏法
• （1）制备沙管 ： 河沙60目过筛—去杂质漂
洗—烘干分装—灭菌—烘干；
• （2）准备菌种：在合适培养基上培养获得孢
子；
• （3）接种：干法接种，直接将放线菌、真菌
孢子接种于沙管中。湿法接种，先将斜面培养
物制成菌悬液，吸取菌悬液于沙管中（每管约
10滴）；
• （4）干燥保藏：将含菌沙管放在含干燥剂的
干燥器中吸水干燥。低温或室温下干燥处保藏。
（五）实验作业
1、根据你自己的实验，谈谈1~2种菌种保藏
方法的利弊？
2、冷冻干燥保藏菌种的原理是什么？为
什么冷冻时一般要用牛奶作为保护剂？