Transcript 课件4 - 辽宁师范大学

实验一
细菌的简单染色和革兰氏染色
辽宁师范大学生物基础实验教学中心
谢鲲鹏
（一）实验目的：
1、学习微生物涂片的基本技术
2、巩固显微镜的使用方法和无菌操作技术
3、掌握细菌的简单染色法和革兰氏染色法。
（二）实验原理：
1、简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的方
法。此法操作简便，适用菌体一般形态和细菌排列
的观察。
2、革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram氏
创立的。而后一些学者在此基础上作了某些改进。
革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
（三）实验器材
1、菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。
2、染色剂：吕氏美蓝、结晶紫、碘液、
95%酒精、番红。
3、仪器或其他用具：显微镜、酒精灯、
载玻片、接种杯、双层瓶、擦镜纸、
吸水纸、废液缸、洗瓶等。
（四）实验方法：
1、简单染色：
（1）涂片：取两块载玻片，各滴一小滴生理盐水于玻片中央，
用接种环以无菌操作分别从大肠杆菌和金黄色葡萄球菌
斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。
（2）干燥：室温自然干燥。
（3）固定：涂面朝上，通过火焰2-3次。
（4）染色：将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上。
（5）水洗：倒去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水
无色为止。
（6）干燥：自然干燥，或用电吹风吹干，也可以用吸水纸吸干。
（7）镜检：涂片干后镜检。
2、革兰氏染色：
（1）制片：取菌种培养物常规涂片，干燥，固定。
（2）初染：滴加结晶紫染色1min，水洗。
（3）媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，
水洗。
（4）脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，
在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直
至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。
（5）复染：用番红复染约2min，水洗。
（6）镜检：干燥后用油镜观察。
（7）混合涂片染色
（五）实验总结
1、实验结果
简单染色
革兰氏染色
2、复习
（1）简单染色操作步骤
涂片—干燥—固定—吕氏美蓝染色1-2分钟—水洗
—干燥—镜检
（2）革兰氏染色操作步骤
制片—初染（结晶紫）1min—水洗—媒染（碘液）
1min—水洗—脱色（95%乙醇至无色）20-30S—水
洗—复染（番红）2min—水洗—干燥—镜检
3、注意事项
（1）涂片不宜过厚，以免脱色不完全，造成假阳性。
（2）乙醇脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可
被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性
菌也会被染成革兰氏阳性菌。
（3）菌龄，应选择活跃生长期的幼培养物作革兰氏染
色。培养时间过长，或死亡及部分自溶，改变了细菌
CW的通透性，造成阳性菌的假阴性反应。
（4）火焰固定不宜过热。
（5）媒染剂的作用，是增加染料和细胞之间的亲和性
或吸附力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使
之不易脱落。
4、思考题
（1）你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意那些环节？
（2）如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？如果
加热温度过高，时间太长，又会怎么样呢？
（3）你认为那些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其
中最关键的环节是什么？
（4）革兰氏染色时，初染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染
之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？