Transcript 菌落总数的测定和大肠菌群的测定

指示微生物的检测
April 10, 2015
 指示微生物：是指在常规卫生监测中，用以指示样品卫生状
况及安全性的（非致病）微生物（或细菌）
 最常用的指标为菌落总数和大肠菌群
• 菌落总数：1mL水样在普通营养琼脂培养基中，经37℃ 24h*
培养后，所生长的细菌菌落的总数。
• GB5749-2006：生活饮用水 菌落总数（CFU/mL）≤100
*GB5749-2006定义为48h
 大肠菌群：一群能在35～37℃、24h内发酵乳糖产酸产气的、需




氧或兼性厌氧的，革兰阴性无芽孢杆菌。
水样中总大肠菌群数的含量，表明水被粪便污染程度，而且间
接地表明有肠道致病菌存在。
大肠菌群主要包括肠杆菌科的大肠埃希氏菌属、枸橼酸菌属、
肠杆菌属(产气杆菌属)、克雷伯氏菌。
根据对培养温度的敏感性分为：总大肠菌群（35～37℃）和粪
大肠菌群（44～45℃）
GB5749-2006：生活饮用水 总大肠菌群 （MPN/100mL或
CFU/100mL）不得检出
水样的采集及送检
 参见GB5749-2006
 1.采样器皿的准备：采样瓶洗净，瓶口包扎进行灭菌，装




运和保存过程中避免污染
2.采自来水样时水龙头酒精灯烧灼消毒，放水5～10min，
常用的水1～3min。目的：排除管道内贮存水样。采样量
为瓶的80%左右，方便摇动混匀水样
3.如果采集的水样含有余氯，则在采样瓶未灭菌前，按每
500mL水样加入1.5%硫代硫酸钠（Na2S2O3）2mL。
4.采集江、河、湖、水库等地表水时，应选择有代表性的
地点及水质可疑的地方。深度：距水面10～15cm。
5.采样后，应立即记录名称、时间、地点等项目。从速检
测。一般从采样到检测不超过2h，条件有限时，先存放冰
箱，但也不应超过4h。
• 实验目的
• 学习生活饮用水的取样方法
• 掌握测定菌落总数的方法。
• 学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法；
• 了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性
• 仪器设备和试剂
 恒温培养箱 显微镜
• 无菌吸管
无菌平皿 营养琼脂 量筒 无菌水
• 3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液 伊红美蓝平板 普通浓度乳糖蛋
白胨培养液 革兰染色液
• 本次试验所用水样为： 实验室自来水 中山公园地表水
实验原理
• 菌落总数的测定采用平板掺入法
• 发酵法测定大肠菌群包括：初（步）发酵试验、平板分离和复发酵
试验。
• 初（步）发酵试验：利用大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气的原理。
• 平板分离：采用伊红美蓝琼脂平板，使大肠菌群产生带核心的、有
金属光泽的深紫色菌落。
• 复发酵试验：以上阳性菌落，经染色为革兰氏阴性无芽孢菌者，再
次进行发酵试验，经24h培养产酸产气的，最终确定为大肠菌群阳
性结果
方法及步骤
 一、生活饮用水
 由于生活用水较清洁，故无需稀释处理
 1.用力摇匀20～25次，使细菌分散
 2.细菌总数及大肠菌群的检测步骤
① 1 mL
菌
落
总
数
②
45℃营养琼脂20mL
旋转混匀
每个水样做两皿平行对照，另取一皿做空白对照
各取100mL
大
肠
菌
群
×2
50mL 3倍浓缩乳糖蛋白胨
水样
各取10mL
× 10
5mL 3倍浓缩乳糖蛋白胨
注：平行对照主要是为了排除由于操作带来的影响
空白对照主要用来排除由培养基等带来的影响
45℃以手背皮肤能忍受的温度为准
37℃，24h
 培养24h后观察结果
 若大肠菌群的培养管产酸产气则按以下步骤进行
取产酸产气的培养液
伊红美蓝培养基
37℃，24h
挑取菌落革兰染色镜检，
复发酵
37℃，24h
10mL普通浓度乳糖蛋白胨培养液
 二、地表水
 由于地表水所含细菌量较大，故测定前常进行稀释处理
 1.用力摇匀水样20～25次
 2.稀释：按1：10倍比稀释
10mL
100
水源水
1 mL
1 mL
10-1
90mL
3.细菌总数及大肠菌群的检测步骤
10-2
9mL
9mL
10-3
菌落总数
① 1 mL
100
10-1
10-2
10-3
②
45℃营养琼脂20mL
旋转混匀
③ 37℃，24h
每个水样做两皿平行对照，另取一皿做空白对照
大肠菌群
1mL
100
10mL普通浓度乳糖蛋白胨培养液
1mL
10-1
× 5
10mL普通浓度乳糖蛋白胨培养液
1mL
10-2
× 5
10mL普通浓度乳糖蛋白胨培养液
1mL
10-3
× 5
10mL普通浓度乳糖蛋白胨培养液
10mL
100
× 5
× 5
5mL 3倍浓缩浓度乳糖蛋白胨培养液
 培养24h后观察结果
 若大肠菌群的培养管产酸产气则按以下步骤进行
取产酸产气的培养液
伊红美蓝培养基
37℃，24h
挑取菌落革兰染色镜检，
复发酵
37℃，24h
10mL普通浓度乳糖蛋白胨培养液
结果分析与报告
 菌落总数的计数与报告
 1.选择平均菌落在30～300之间计算，当只有一个稀释度符合，即以该






平均菌落数乘以稀释倍数报告。例一
2.若有两个稀释度符合，则按两者菌落数以各自稀释倍数后的总数之比
值来决定。若＜2，则报告两总数的平均数，例二；若≥2，则报告较少
的菌落总数，例三
3.若所有的稀释度的平均菌落数均大于30～300，则应按稀释度最高的
平均菌落乘以稀释倍数报告，例五
4.若所有的稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌
落乘以稀释倍数报告，例六
5.若所有的稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最接近300或
30的平均菌落数乘以稀释倍数报告，例六
6.若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告例八
7.菌落计数的报告：在100以内按实际数报告，＞100，2位有效数字。
报告“多不可计”时，应注明稀释倍数。
表1 稀释度的选择及报告方式
不同稀释度的平均菌落数
10-1
10-2
10-3
两个稀释度
菌落总数之比
1
1365
164
20
—
16400
16000或1.6*104
2
2760
295
46
1.6
37750
38000或3.8*104
3
2890
271
60
202
27100
27000或2.7*104
4
150
30
8
2.0
1500
1500或1.5*103
5
多不可计
4650
513
—
513000
51000或5.1*105
6
27
11
5
—
270
270或2.7*102
7
多不可计
305
12
—
30500
31000或3.1*104
8
0
0
0
—
＜1*10
＜10
例次
自GB/T 5750.12-2006
*CFU (Colony-Forming Units)经培养所得菌落形成单位
菌落总数
（CFU*/mL）
报告方式
（CFU/mL）
生活饮用水大肠菌群存在阳性管（瓶）数查表
*
表2总大肠菌群MPN检索表
2
*MPN（most probable number）最可能数
地表水大肠菌群存在阳性管（瓶）数查表
表3 总大肠菌群MPN检索表*
表未完，具体参见GB/T 5750.12-2006
 注意事项：
 1.实验开始前，将相应的稀释管、平皿做好标记
 2.进行水样稀释时，更换吸管的顺序：每支吸管吹打混匀
本稀释度的水样，并吸取1mL到下一支无菌水管后（最好
不要插入无菌水）即弃去
 3.实验注意无菌操作
 4.培养时平皿底面朝上
Tips：
革兰染色步骤
1,初染:结晶紫,1min ,水洗.
2,媒染:卢戈碘液,1min,水洗.
3,脱色:95%乙醇,30s,转动玻片,水洗.
4,复染:稀释复红液,1min,水洗.
思考：倒置培养原因?
培养基倒置，最根本的原因是因为培养基中的水份在备用储
存期间或培养过程中会蒸发出来。倒置可以防止培养基过分
失水干裂或缩小。如果不倒置的话，凝结在平皿盖子上的水
就会滴下来这样会造成：1、增大了培养基的污染几率。2、
冷凝水造成菌落不成型，影响判断。
 本次实验课 8学时，4次课
 4人/组，每组均做生活饮用水及地表水的菌落总数及
大肠菌群的测定。
 课程安排：
 第一次课：1.稀释水样（地表水） 2.菌落总数的平板
掺入及大肠菌群的初发酵实验（地表水及自来水）
 第二次课：1.观察报告菌落总数及大肠菌群初发酵的
实验结果 2.大肠菌群平板分离
 第三次课：大肠菌群革兰染色镜检及接种复发酵
 第四次课：观察复发酵实验结果。总结分析报告
1.平板分区划线
2.平板分离鉴定
3.革兰染色
平板分区划线
 平板划线：用接种环在平板培养基表面通过分区划线而达
到纯化分离微生物的一种方法。是将微生物样品在固体培
养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。用
于目的微生物的分离。
 方式
划线的形式有多种，以四区划线为例：第一区(A
区)面积最小，作为待分离菌的菌源区，第二和第三区(B、
C区)是逐级稀释的过渡区，第四区(D区)，则是关键区，使
该区出现大量的单菌落以供挑选纯种用。为了得到较多的
典型单菌落,平板上四区面积的分配应是D＞C＞B＞A。
 特点
快捷、方便、便于得到目的性状的单克隆。
 示例
对大肠杆菌的分离
 1.挑取含菌样品：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法
挑取少量菌种。
 2.划A区：将平板倒置于酒精灯旁,左手拿出皿底并尽量使平
板垂直于桌面，有培养基一面向着酒精灯(这时皿盖朝上，
仍留在酒精灯旁)，右手拿接种环先在A区划3—4条连续的平
行线(线条多少应依挑菌量的多少面定)。划完A区后应立即
烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果
。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方(不要
放入皿盖内)，以防止杂菌的污染。
A区
B区
D区
C区
3.划其他区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使
B区转到上方，接种环通过A区(菌源区)将菌带到B区，随即划数条致密
的平行线。再从B区作C区的划线。最后经C区作D区的划线，D区的线
条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A、B区，以免极该两区中浓
密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去
接种环上的残菌。
平板分离鉴定
 以本次伊红美蓝平板为例：

伊红美蓝培养基（eosin-methylene blue medium,简称EMB
medium），一般用于检测大肠杆菌。伊红为酸性染料，美蓝为碱
性染料。当大肠杆菌分解乳糖产酸时细菌带正电荷被染成红色，再
与美蓝结合形成紫黑色菌落，并带有绿色金属光泽。而产气杆菌则
形成呈棕色的大菌落。在碱性环境中不分解乳糖产酸的细菌不着色
，伊红和美蓝不能结合，故沙门氏菌等为无色或琥珀色半透明菌落
。金葡菌在此培养基上不生长。
常用的伊红美蓝乳糖培养基，可用
来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠
杆菌等细菌。如果有大肠杆菌，因其强
烈分解乳糖而产生大量的混合酸，菌体
带H+，故菌落被染成深紫色，从菌落表
面的反射光中还可以看到金属光泽。
EMB平板上大肠菌群
革兰染色
 原理：
①G+菌细胞壁肽聚糖层厚，脂质少，乙醇可使肽聚糖
层孔径变小造成细胞壁通透性降低，阻止结晶紫脱出。G菌肽聚糖层薄，其外膜、脂蛋白、脂多糖等脂质含量高，
乙醇溶解脂质使细菌壁通透性增高，易于结晶紫脱出，可
被复染液着色，称为通透性学说。

②G+菌等电点较G-菌为低，在相同pH值条件下G+菌
带负电多，故结合碱性染料结晶紫多，称为等电点学说。
—《卫生理化检验与微生物学检验》

 革兰染色的实验步骤
 1. 涂片：左手持菌液试管，右手持接种环，用接种环从试
管培养液中取一环菌，于载玻片中央涂成薄层即可，或先
滴一小滴无菌水于载玻片中央，用接种环从斜面上挑出少
许，与载玻片上的水滴混合均匀，涂成一薄层。
 拔或塞试管塞时，应将试管口通过火焰略加烧灼，最后将
接种环在火焰上烧灼灭菌。
 2. 干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加
温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰。
 3. 固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面
朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。
要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉
过烫为宜，放置待冷后染色。

 4. 染色：
 （1）初染： 加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。
 （2）媒染： 滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。
 （3）脱色： 将载玻片上的水甩净，并衬以白背景，用95%
酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20～30秒，
立即用水冲净酒精。
 （4）复染： 用复红液染一分钟，水洗。
 5. 镜检： 干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰
氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，
过于密集的细菌，常常呈假阳性。
 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度
，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被
误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养
时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应
 革兰染色的实验现象

如果将细菌做革兰染色，凡染
后菌体呈蓝紫色的，称为“革兰阳
性菌”；菌体是伊红色，称“革兰
阴性菌”。无论阳性菌还是阴性菌
，都有杆菌和球菌。葡萄球菌、大
肠杆菌、铜绿假单胞菌是常见的病
原菌，葡萄球菌属于革兰阳性菌，
大肠杆菌属于革兰阴性菌中的肠杆
菌科，除大肠杆菌以外，较常见的
肠杆菌科细菌还有变形杆菌属，沙
门菌属；铜绿假单胞菌是临床常见
的较耐药革兰阴性杆菌。
大肠杆菌革兰染色
蜡样芽孢杆菌革兰染色