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特殊光学显微镜的原理与使用
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暗视野显微镜
相差显微镜
荧光显微镜
偏光显微镜
干涉显微镜
体视显微镜
倒置显微镜
共聚焦显微镜
暗视野显微镜
步骤
• 根据丁达尔效应原理设计的一种在黑色背景条件下观
察被检物体的显微镜。
• 不让直射光线进入物镜的镜头，而是先让直射光线经
过暗视野聚光器后改变途径，使其斜向射向被检物体
。
• 能观察到明视野下看不到的极其微小的物体，可判断
物质颗粒的存在与否。最高分辨率可达0.004um,”超显
微镜术“
1. 换上暗视野聚光器并在聚光器透镜的上表面滴上镜头
油。向上缓慢调升聚光镜，使镜头油与载玻片下表面
缓缓接触。只有在油滴与载玻片的底面相接触后，光
线才能射向标本。
2. 将视场光圈适当缩小，用10倍物镜找到被检物体，同
时可在视场中看到视场光圈的轮廓像。上下缓慢调整
聚光镜，使视场光圈的像清晰可见。
相差显微镜的特点
• 光线通过比较透明的标本时，光的波长
（颜色）和振幅（亮度）都没有明显的
变化。因此，用普通光学显微镜观察未
经染色的标本（如活的细胞）时，其形
态和内部结构往往难以分辨。
• 相差显微镜能通过其特殊装置——环状
光阑和相板，利用光的干涉现象，将光
的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差
（明暗差），从而使原来透明的物体表
现出明显的明暗差异，对比度增强，使
我们能比较清楚的观察到普通光学显微
镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清
的活细胞及细胞内的某些细微结构
相差显微镜的成像原理
• 镜检时光源只能通过环状光阑的透明环，经聚光器后
聚成光束，这束光线通过被检物体时，因各部分的光
程不同，光线发生不同程度的偏斜（衍射）。由于透
明圆环所成的像恰好落在物镜后焦点平面和相板上的
共轭面重合。因此，未发生偏斜的直射光便通过共轭
面，而发生偏斜的衍射光则经补偿面通过。由于相板
上的共轭面和补偿面的性质不同，它们分别将通过这
两部分的光线产生一定的相位差和强度的减弱，两组
光线再经后透镜的会聚，又复在同一光路上行进，而
使直射光和衍射光产生光的干涉，变相位差为振幅差
。这样在相差显微镜镜检时，通过无色透明体的光线
使人眼不可分辨的相位差转化为人眼可以分辨的振幅
差（明暗差）。
相差显微镜的结构和装置
• 1、环状光阑
– 具有环形开孔的光阑。位于聚光器
的前焦点平面上，光阑的直径大小
是与物镜的放大倍数相匹配的，并
有一个明视场光阑，与聚焦器一起
组成转盘聚光器。在使用时只要把
相应的光阑转到光路即可。
相差显微镜的结构和装置
• 2、相板
– 位于物镜内部的后焦平面上。相板上有两
个区域，直射光通过的部分叫“共轭面”
，衍射光通过的部分叫“补偿面”。带有
相板的物镜叫相差物镜，常以“Ph”字样
标在物镜外壳上。
– 相板上镀有两种不同的金属膜：吸收膜和
相位膜。吸收膜常为铬、银等金属在真空
中蒸发而镀成的薄膜，它能把通过的光线
吸收掉60%—93%，相位膜为氟化镁等在
真空中蒸发镀成，它能把通过的光线相位
推迟1/4波长。
相差显微镜的结构和装置
• 3、合轴调节望远镜
– 是相差显微镜一个极为重要的结构。环状光阑的像
必须与相板共轭面完全吻合，才能实现对直射光和
衍射光的特殊处理。否则应被吸收的直射光被泄掉
，而不该吸收的衍射光反被吸收，应推迟的相位有
的不能被推迟，这样就不能达到相差镜检的效果。
由于环状光阑是通过转盘聚光器与物镜相匹配的，
因而环状光阑与相板常不同轴。为此，相差显微镜
配备有一个合轴调节望远镜（在镜的外壳上标有
“CT”符号），用于合轴调节。使用时拨去一侧目
镜，插入合轴调节望远镜，旋转合轴调节望远镜的
焦点，便能清楚看到一明一暗两个圆环。再转动聚
光器上的环状光阑的两个调节钮，使明亮的环状光
阑圆环与暗的相板上共轭面暗环完全重叠。如明亮
的光环过小或过大，可调节聚光器的升降旋钮，使
两环完全吻合。如果聚光器已升到最高点或降到最
低点而仍不能矫正，说明玻片太厚了，应更换。调
好后取下望远镜，换上目镜即可进行镜检观察。
相差显微镜的结构和装置
• 4、绿色滤光片
– 由于使用的照明光线的波长不同，
常引起相位的变化，为了获得良好
的相差效果，相差显微镜要求使用
波长范围比较窄的单色光，通常是
用绿色滤光片来调整光源的波长。
Olympus厂家生产的相差显微镜在
镜检时要使用该厂规定的IF550绿色
滤光片作为配套器件。
相差显微镜的使用范围
• 相差显微镜能观察到透明样品的
细节，适用于对活体细胞生活状
态下的生长、运动、增殖情况及
细微结构的观察。因此，是微生
物学、细胞生物学、细胞和组织
培养、细胞工程、杂交瘤技术等
现代生物学研究的必备工具。
相差显微镜的操作步骤
• （1）根据观察标本的性质及要求，挑选适合
的相差物镜。
• （2）将标本片放到载物台上。
• （3）进行光轴中心的调整。
• （4）取下一侧目镜，换上合轴调节望远镜，
调整环状光阑与相板上的共轭面圆环完全重
叠吻合，然后取下合轴调节望远镜，换回目
镜。在使用中，如需要更换物镜倍数时，必
须重新进行环状光阑与相板共轭面圆环吻合
的调整。
• （5）放上绿色滤光片，即可进行镜检，镜检
操作与普通光学显微镜方法相同。
相差显微镜的注意事项
• （1）视场光阑与聚光器的孔径光阑
必须全部开大，而且光源要强。因环
状光阑遮掉大部分光，物镜相板上共
轭面又吸收大部分光。
• （2）不同型号的光学部件不能互换
使用。
• （3）载玻片、盖玻片的厚度应遵循
标准，不能过薄或过厚。
• （4）切片不能太厚，一般以5—
10μm为宜，否则会引起其他光学现
象，影响成像质量。
荧光显微镜
• 荧光显微镜是免疫荧光细胞化学
的基本工具。它是由光源、滤板
系统和光学系统等主要部件组成
。是利用一定波长的光激发标本
发射荧光，通过物镜和目镜系统
放大以观察标本的荧光图像。
荧光是什么？
荧光显微镜--光源
• 多采用200W的超高压汞灯作光源
• 国产超高压汞灯GCQ-200型性能
良好，可以代替HBO-200等型的
进口灯泡
荧光显微镜--滤色系统
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滤色系统是荧光显微镜的重要部位，由激发滤板和压制滤板组成。
滤板型号，各厂家名称常不统一。滤板一般都以基本色调命名，前
面字母代表色调，后面字母代表玻璃，数字代表型号特点。
荧光显微镜--滤色系统
• 1．激发滤板
• 根据光源和荧光色素的特点，可选用以下三类激发滤
板，提供一定波长范围的激发光。
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紫外光激发滤板：此滤板可使400nm以下的紫外
光透过，阻挡400nm以上的可见光通过。常用型号为
UG-1或UG-5，外加一块BG-38，以除去红色尾波。
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紫外蓝光激发滤板：此滤板可使300～450nm范围
内的光通过。常用型号为ZB-2或ZB-3，外加BG-38。
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紫蓝光激发滤板：它可使350～490nm的光通过。
常用型号为QB24（BG12）。
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最大吸收峰在500nm以上者的荧光素（如罗达明
色素）可用蓝绿滤板（如B-7）激发。
荧光显微镜--滤色系统
• 2．压制滤板
• 压制滤板的作用是完全阻挡激发光通过，提
供相应滤长范围的荧光。与激发滤板相对应
，常用以下3种压制滤板：
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紫外光压制滤板：可通过可见光、阻挡
紫外光通过。能与UG-1或UG-5组合。常用
GG-3K430或GG-6K460。
•
紫蓝光压制滤板：能通过510nm以上滤
长的荧光（绿到红），能与BG-12组合。通
常用OG-4K510或OG-1K530。
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紫外紫光压制滤板：能通过460nm以上
波长的荧光（蓝到红），可与BG-3组合，常
用OG-11K470AK 490，K510。
荧光显微镜--目镜
• 在荧光显微镜中多用低倍目镜，
如5×和6.3×。
荧光显微镜标本制作要求
• 载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另
一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无
明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。
• 盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用干涉盖玻
片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用
的物质（如氟化镁）的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发
光，这种反射的激发光女可激发标本。
• 组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部
，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖
，影响判断。
• 封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5～
9.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的
碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。
• 般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用
特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替，液体石蜡也可用，只是折
光率较低，对图像质量略有影响。
使用荧光显微镜的注意事项
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（1）严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变
程序
（2）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞
灯5～15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察
标本。
（3）防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。
（4）检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强
度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3～5min后，荧光也明显减
弱；所以，最多不得超过2～3h。
（5）荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节 省时间，
保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用
时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避
免数次点燃光源。
（6）标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本
放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。
（7）荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“一”—无或可见微
弱荧光。“+”—仅能见明确可见的荧光。“++”—可见有明亮的荧光。
“+++”—可见耀眼的荧光。