Transcript 细胞培养从基础到精通
细胞培养从基础到精通 基础篇-无菌操作基本技术 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 %ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运 转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养 基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实 验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无 菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸 取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之 流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应 在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器 瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并 握住瓶身，倾斜约45° 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。 对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等 级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤 害等。 5. 定期检测下列项目： 5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力 5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用 无菌水，每周更换)。 5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过 滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。 基础篇-实验用品 1. 种类︰ 1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器 与pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌制品。 1.2. TC 级培养盘表面均有coating 高分子物 质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask， plates, dishes, roller bottle 等，依实验需 要使用。 1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml 1.4. 塑料离心管: 15 ml, 50 ml，均有2 种不 同材质，其中polypropylene (PP) 为不透明 材质，polystyrene (PS) 为透明材质，可依 实验需要而选择适合材质之离心管。 1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽 掉废弃培养液等。 1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100 ml, 250 ml,500 2. 清洗︰ 2.1. 新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡数 小时，洗净后才开始使用。 2.2. 用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分 别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。 3. 灭菌︰ 3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽 灭菌121℃, 15 lb, 20 分钟，置于oven 中烘干。 3.2. 实验用玻璃pasteur pipet 以干热灭菌170℃, 4 小时。 3.3. 液体或是固体废弃物可用10 % hypochloride 溶液(次氯酸，即漂白水) 或是蒸汽 高压灭菌121 ℃, 15 lb, 20 分钟处理。 基础篇-培养基 1. 液体培养基贮存于4℃ 冰箱，避免光照，实验进行 前放在37℃ 水槽中温热。 2. 液体培养基(加血清) 存放期为六个月，期间 glutamine 可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添 加适量glutamine。 3. 粉末培养基配制(以1 升为例)： 3.1. 细胞培养基通常须添加10 % 血清，因此粉末培 养基之配制体积为900 ml，pH 为7.2 - 7.4。 NaHCO3 为另外添加，若将NaHCO3 粉末直接加入 液体培养基中会造成pH 之误差，或局部过碱。因此粉 末培养基及NaHCO3 粉末应分别溶解后才混合，然后 用CO2 气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱 (NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮 存时培养基的pH 易发生改变。 3.2. 材料： 纯水(milli-Q 水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要) ，粉 末培养基 ，NaHCO3 ，电磁搅拌器 无菌血清瓶 ，0.1 或0.2 mm无菌过滤膜 ，pH 计，真空泵，CO2 气体 3.3. 步骤： 3.3.1. 取粉末培养基溶于700 ml milli-Q 水中，搅拌使其溶 解。 3.3.2. 称取适量之NaHCO3 粉末溶于200ml milli-Q 水中， 搅拌使其溶解，然后通入CO2 气体至饱和，约3-5 分钟。 3.3.3. 将溶解且含饱和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液体 培养基中混合。混后溶液之pH 应为7.2-7.4，除非pH 值偏差 太大，否则不需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入CO2 气 体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时，pH 会升高0.10.2。 3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无 菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4℃。(血清 亦可加入培养基中一起过滤) 3.3.5. 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。 附-配制培养基之生长测试 材料： MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) 6-well TC plate (or 35 mm TC dish) methanol glacial acetic acid 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013) 步骤： 1. 以待测试培养基培养MDCK cell，接种MDCK 细胞于6-well plate (或35mm TC dish) 中，每个well 接种1 × 102 活细胞，同时作对照 组实验。 2. 接种5～7 天后，在100 倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞 群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。 3. 去除培养基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇：冰醋酸﹦ 3:1)，室 温下静置10 min。 4. 去除固定液，水洗二次。 5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室温下静置染色2-3 min。 6. 去除染液，水洗二次。 7. 以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不 佳，则丢弃之。 基础篇-抗生素 1. 细胞库之细胞培养基不加抗生素 1.1. 培养自ATCC 引进之细胞株，培养基中不加抗生 素。 1.2. 培养自其它实验室引进之细胞株，制作token freeze 前培养基须添加抗生素，待token freeze 通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。 2. 寄送活细胞时，须将培养液充满整个flask 时，则 须添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。 3. 若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加 gentamicin，因gentamicin 会抑制 4. 去除细菌污染之抗生素混合配方: penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml，注意混合使用后药物毒性会增强。 5. 抗生素使用种类与浓度： 工作浓度. 储存温度. 杀灭细菌 penicillin 100 units/ml -20℃ G(+) bacteria streptomycin 100 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria chlotetracycline 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria gentamicin 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma amphotericin B 2.5 ug/ml -20℃ yeast and molds nystatin 50 ug/ml -20℃ yeast and molds fungizone 2.5ug/ml -20℃ yeast and molds 基础篇-血清 1. 血清必须贮存于–20 ～ -70℃，若存放于4℃，请 勿超过一个月。如果一次无法用完一 瓶，可将40～ 45 ml 分装于无菌50 ml 离心管中，由于血清结冻时 体积会增加约10 %， 必须预留此膨胀体积之空间， 否则易发生污染或容器冻裂之情形。 2. 一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若 发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起 过滤，勿直接过滤血清。 3. 瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法): -20℃ 或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装， 一般以50 ml 无菌离心管可分装40～45 ml。在溶解 过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成 分均一，减少沈淀的发生。勿直接由–20℃直接至 37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而 发生沈淀。 4. heat-inactivation 是指56℃, 30 分钟加热已完 全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理 之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活 化。除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沈 淀物之显著增多，且会影响血清之品质。补体参与之反 应有：cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell type。 5. 勿将血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清 会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此 受到破坏，而影响血清之品质。 6. 血清之沈淀物 6.1. 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是 血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性及解冻后血清中 存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沈淀物不 会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沈淀物， 可用离心3000 rpm, 5 min 去除，或离心后上清液 可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除 这些凝絮沈淀物，因为会阻塞过滤膜。 6.2. 显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之 血清，沈淀物的形成会显著的增多。有些沈淀物在显 微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污 染，而将血清放在37℃中欲培养此“微生物“，但在 37℃环境下，又会使此沈淀物增多，更会误认为微生 物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。 一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀 疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。 附-血清之生长测试 材料： MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 ) 6-well TC plate (or 35mm TC dish) methanol glacial acetic acid 10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013) 步骤： 1. 以a-MEM with 10 % FBS (已测试过) 培养MDCK 细胞 于T75 flask 至80% confluency。 2. 以trypsin-EDTA 处理细胞，离心后，加入适量不加血清之 a-MEM 制成细胞悬浮液，并测细胞浓度。以不加血清之aMEM 稀释细胞浓度为1×102活细胞数/ ml。 3. 将1 ml 细胞悬浮液接种入6-well plate 中，并另加入1 ml 含不同浓度的血清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之a-MEM，使血清最终浓度为10% , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已测试过之血清同时进行对照组 4. 37 oC，5 % CO2 培养箱培养5-7 天，期间不需更换培 养基，待细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触即 可。 5. 去除培养基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇:冰醋酸﹦ 3:1)，室温下静置10 min。 6. 去除固定液，水洗二次。 7. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室温下静置染 色2-3 min。 8. 去除染液，水洗二次。 9. 以肉眼计数群落数 10. 计算SPE ( Serum Plating Efficiency )： SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100 % 11. 计算RPE(Relative Plating Efficiency)： SPE = [ total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) ] x100 % 比较各浓度血清培养基之RPE，即可得知待测血清对细胞生长 的影响。订购多量同一批号的优良血清，置于–70℃ 保存之 基础篇-细胞传代培养 1. 细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为1:3 至 1:6，依细胞种类而异。 2. 材料： 2.1. 无菌磷酸生理缓冲液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010) 2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA4Na, GibcoBRL 25300-062)： 以10 ml 分装于15 ml 无菌离心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃ 水 槽回温。 2.3. 新鲜培养基 2.4. 无菌吸管/离心管/培养瓶 3. 步骤： 3.1. 附着型胞(adherent cell) 3.1.1. 吸掉旧培养液。 3.1.2. 用D-PBS 洗涤细胞一至二次。 3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液 (1ml/25cm2, 2ml/75cm2)，37 ℃作 用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要 分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA 溶液。(若不移去trypsin-EDTA，则在 trypsin-EDTA 作用后，加入适量含血清之 新鲜培养基终止trypsin 作用，离心后再吸 掉上清液。) 3.1.4. 轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入 适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数次以打 散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至 新的培养瓶中，以正常培养条件培养。 3.2. 悬浮型细胞(suspension cell) 3.2.1. 吸出细胞培养液，放入离心管中， 离心1000 rpm 5 分钟。 3.2.2. 吸掉上清液，加入适量之新鲜培养 基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培 养瓶中，以正常培养条件培养。 3.3. 融合瘤(hybridoma) 3.3.1. 有些hybridoma cell 需培养三天 以上才会产生抗体，若是更换培养基，则可 能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更 换培养基，直接添加新鲜培养基稀释细胞浓 度即可。若体积太大，可倾斜放置，或分殖 至新培养瓶中。 基础篇-细胞冷冻保存 （一） 1. 注意事项： 1.1. 欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率 高之状态，约为80 – 90 ％致密度。 1.2. 冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如 hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。 1.3. 注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级，无菌 且无色(以0.22 micronFGLP Telflon 过滤或是直接购买无 菌产品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小体积分装， 4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol 亦应为试剂级等级， 以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存 后对细胞会有毒性。 1.4. 冷冻保存之细胞浓度： 1.4.1. normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml 1.4.2. hybridoma: 1~3 x 106cells/ml，细胞浓度 不要太高，某些hybridoma 会因冷冻浓度太高而在解冻 24 小时后死去。 1.4.3. adherent tumor lines: 5~7 x 106，依细 胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度， 而HeLa 只需1-3 x 106cells/ml。 1.4.4. other suspensions: 5~10 x 106cells/ml, human lymphocyte 须至少5 x 106cells/ml。 1.5. 冷冻保护剂浓度为5 或10 ％ DMSO，若是不确定 细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个 backup culture，以防止冷冻失败。 1.6. 冷冻方法： 1.6.1. 传统方法: 4℃ 10 分钟---> -20℃ 30 分钟--> -80℃ 16 - 18 小时(或隔夜) ---> 液氮槽vapor phase 长期储存。 1.6.2. 程序降温：利用等速降温机以–1 ～ -3℃/分钟之 速度由室温降至–120℃，放在液氮槽vapor phase 长期 储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma 之保存。 基础篇-细胞冷冻保存 （二） 2. 材料： 2.1. 生长良好之培养细胞 2.2. 新鲜培养基 2.3. DMSO (Sigma D-2650) 2.4. 无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 50000020) 2.5. 0.4 ％ w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) 2.6. 血球计数盘与盖玻片 2.7. 等速降温机(KRYO 10 Series II) 3. 步骤： 3.1. 冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长 情形。 3.2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO 加入新 鲜培养基中，最后浓度为5-10％，混合均匀，置于室温下 待用。 3.3. 依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细 胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细胞浓度及冻前存活率。 3.4. 离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细 胞浓度为1-5 x 106 cells/ml，混合均匀，分装于已标 示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial，并取少量细胞悬浮 液作污染检测。 3.5. 冷冻保存方法1: 冷冻管置于4℃ 10 分钟→ -20℃ 30 分钟→ -80℃ 16～18 小时(或隔夜) → 液氮槽 vapor phase 长期储存。 3.6. 冷冻保存方法2: 冷冻管置于已设定程序之等速降温机 中，再放入液氮槽中。程序为: program 7: HB CELL 基础篇-冷冻细胞活化 1. 冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰 晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。 2. 细胞活化后，约需数日，或继代一至二代， 其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生 单株抗体或是其它蛋白质)。 3. 材料 37℃ 恒温水，新鲜培养基，无菌吸管/ 离心管 / 培养瓶，液氮或干冰容器 4. 步骤： 4.1 操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂 之伤害。 4.2 自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧， 由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。 4.3 将新鲜培养基置于37 °C 水槽中回温，回温后喷以 70 % 酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。 4.4 取出冷冻管，立即放入37 °C 水槽中快速解冻，轻摇 冷冻管使其在1 分钟内全部融化，以70 % ethanol 擦拭 保存管外部，移入无菌操作台内。 4.5 取出0.9 ml 解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之 培养容器内(稀释比例1:10～1:15)，混合均匀，放入 CO2 培养箱培养。另取0.1 ml 解冻细胞悬浮液作存活测 试。 4.6 解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO 或 glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即 去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液 加入含有5-10 ml 培养基之离心管内，离心1,000 rpm, 5 分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入 CO2 培养箱培养。 4.7 若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更 换培养基。 基础篇-收到细胞的处理方式 (一) 1. 收到细胞株包裹时， 请检查细胞株冷冻管是否有解 冻情形， 若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养， 或立即冷冻保存(置于–70 °C， 隔夜后， 移到液氮)。 2. 冷冻细胞解冻程序: 2.1. 依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清 种类和其它指定之成份和比例，制备培养基。绝大多数 之细胞均无法立即适应不同之基础培养基或不同之血清 种类， 若因实验需要， 必须有所不同时， 务必以缓慢 比例渐次改变培养基组成， 确定细胞适应后， 方进行 所需之实验。 2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 马 血清)，对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料 单指定之血清种类培养之。 2.3. 将培养基置于37 °C 水槽中回温， 回温后喷以70 % 酒精并擦拭之， 移入无菌操作台内。取出冷冻管， 立 即放入37 °C 水槽中快速解冻， 水面高度不可接近或高 过冷冻管之盖沿， 否则易发生污染。轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化后， 以70 % ethanol 擦拭冷冻管外部， 移入无菌操作台内。 2.4. 依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取10 ml 培 养基加至T25 或T75 flask中。取出已解冻之细胞悬浮 液，缓缓加入T25 或T75 flask 内之培养基， 混合均匀， 放入37 °C，5 % CO2 培养箱培养。 2.5. 对绝大多数细胞而言，1 % 以下之冷冻保护剂 DMSO，不会对细胞之贴附或活化有不良影响，不需立刻 由解冻细胞中去除， 待第二天确定细胞生长或贴附良好后 再去除即可。惟对极少数因对DMSO 敏感或会造成细胞 分化之细胞，需立即去除DMSO 者， 则可将解冻后之细 胞悬浮液放入5 - 10 ml 培养基中，离心300 xg (约 1000 rpm)，5 分钟，小心移去上清液，加入适量新鲜 培养基，将细胞均匀混合后， 转移至培养瓶中， 再放入 37 °C， 5 % CO2 培养箱培养。 基础篇-收到细胞的处理方式 (二) 收到T25 flask 细胞时， 处理方式为︰ 1. 于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡， T25 flask 均加满培养基。请检查flask 外观， 并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象， 若有任何问题， 不要打开盖子，请立即通知细胞 实验室。 2. 将原封之T25 flask 静置于37 °C， 5 % CO2 培养箱中，使细胞回温至37 °C， 并让运送过程 中少数脱落的细胞可再附着生长。隔天后，于无 菌操作箱内取出flask内之培养基，(取出之培养 基可以再使用)，仅留约5-10ml 培养基于flask 内，依一般培养方式再将细胞置入培养箱中，或 细胞已长满盘， 则将细胞做传代培养。 附-细胞计数与存活测试（一） 1. 原理： 1.1. 计算细胞数目可用血球计数盘或是Coulter counter 粒子计数 器自动计数。 1.2. 血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber 中细刻9 个1 mm2 大正方形，其中4 个角落之正方形再细刻16 个小格，深度均为 0.1 mm。当chamber 上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞 数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml 中之细胞数目。 1.3. 存活测试之步骤为dye exclusion，利用染料会渗入死细胞中而 呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用 蓝色之trypan blue 染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红 色之Erythrosin bluish。 附-细胞计数与存活测试（二） 2. 材料： 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) Erythosin bluish stain 取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca++/Mg++ free saline 血球计数盘及盖玻片(Hemocytometer and coverslip) ，计数器(counter) ， 低倍倒立显微镜 粒子计数器(Coulter counter, Coulter Electronics) 3. 步骤： 3.1. 取50ml 细胞悬浮液与50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等 体积混合均匀于1.5ml 小离心管中。 3.2. 取少许混合液(约15ml) 自血球计数盘chamber 上方凹槽加入，盖上盖 玻片，于100 倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色 - Erythrosinbluish)。 3.3. 计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与 trypan blue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。 若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。 4 大格*细胞总数x 2 x 104 / 4= 细胞数/ml *每一大格的体积= 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml 3.4. 若不用血球计数盘，可用Coulter counter 作自 动计数，惟无法辨别死细胞或活细胞。 3.5. 范例： T75 monolayer culture 制成10ml 细胞悬浮液，取 0.1 ml 溶液与0.1ml trypan blue 混合均匀于试管 中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内 之细胞数目。 活细胞数/方格：55 ,62, 49, 59 死细胞数/方格：5, 3, 4, 6 细胞总数= 243 平均细胞数/方格= 60.75 稀释倍数= 2 细胞数/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106 细胞数/flask： 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106 存活率：225/243﹦92.6 % 升级篇-细胞培养1 1 冷冻管应如何解冻？ 取出冷冻管后， 须立即放入37 °C 水槽中快速 解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污 染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须 注意安全， 预防冷冻管之爆裂。 2 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除 DMSO？ 除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大 部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角 瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或 贴附之问题。 3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之 细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养 条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。 4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ 不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养 来源， 所以血清的种类和品质对于细胞的生 长会产生极大的影响。来自不同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同， 血清使用错误常会造成细胞无法存活。 升级篇-细胞培养2 5 何谓FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛 血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。 CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。 6 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根 本没有影响？ 一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作 为pH 的缓冲系统， 而培养基中NaHCO3 的含 量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培 养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞 培养时应使用10 % CO2；当培养基中 NaHCO3 为每公升1.5 g 时， 则应使用5 % 7 何时须更换培养基？ 视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按 时更换培养基即可。 8 培养基中是否须添加抗生素？ 除于特殊筛选系统中外， 一般正常培养状态下， 培养基中不 应添加任何抗生素。 9 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处 理？ 一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试 管中， 保存于–20 °C，避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活 性降低， 并可减少污染之机会。 10 悬浮性细胞应如何继代处理？ 一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中， 稀释细胞浓度即 可， 若培养液太多时， 可将培养角瓶口端稍微抬高， 直到无法 容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角 瓶， 加入新鲜培养基稀释至适当浓度， 重复前述步骤即可。 升级篇-细胞培养3 11 欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转 速？ 欲回收动物细胞， 其离心速率一般为300xg (约 1,000rpm)，5 - 10 分钟， 过高之转速， 将造成细 胞死亡。 12 细胞之接种密度为何？ 依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接 种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长 之一重要原因。 13 细胞冷冻培养基之成份为何？ 动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原 来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于 DMSO 稀释时会放出大量热能， 故不可将DMSO 直接 加入细胞液中， 必须使用前先行配制完成。 14 DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？ 冷冻保存使用之DMSO 等级， 必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即为无菌状况， 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于4°C， 避 免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质， 并可减少 污染之机会。若要过滤DMSO， 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。 15 冷冻保存细胞之方法？ 冷冻保存方法一: 冷冻管置于4 °C 30~60 分钟→ (-20 °C30 分钟*) → -80 °C 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽 vaporphase 长期储存。 冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分 钟降1-3 °C 至–80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase 长期储存。*-20 °C 不可超过1 小时， 以防止冰晶过大，造 成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中，惟 存活率稍微降低一些。 升级篇-细胞培养4 16 细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？ 冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial， 融合 瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。 17 应如何避免细胞污染？ 细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉 浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境 不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、 清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低 污染之最好方法。 18 如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？ 加入相应抗生素。直接灭菌后丢弃之。 19 支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉 眼观察出异状？ 不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染 的细胞株，无法以其外观分辨之。 20 支原体污染会对细胞培养有何影响？ 支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数， 代谢及 研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。 21 侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？ 直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。 22 CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？ 定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水 更换之。 升级篇-细胞培养5 23 为何培养基保存于4 °C 冰箱中， 颜色会偏暗红色， 且pH值会越来越偏碱性？ 培养基保存于4 °C 冰箱中， 培养基内之CO2 会逐渐溢 出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂 (通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗 红。培养基偏碱之结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。 若培养基偏碱时， 可以通入无菌过滤之CO2， 以调整 pH 值。 24 各种细胞培养用的dish，flask是否均相同？ 不同厂牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 虽对大部分细胞没有太大之影 响， 惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异。 25 购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情 形？ 研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少， 大都是因为离 心过程操作上的失误， 造成细胞的物理性损伤， 以及细胞流失。 建议细胞解冻后不要立刻离心， 应待细胞生长隔夜后再更换培养 基即可。 26 购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？ 研究人员在细胞培养时出现存活率不佳， 常见原因可归纳为：培 养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不 佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后， 加以洗涤细胞和离心。悬 浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80 °C 太久。 27 收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？ 冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时 用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻 管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因 此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻 将冷冻管再一次扭紧 升级篇-细胞培养6 28 如何选用特殊细胞系培养基？ 培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM 中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样 很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、 RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始， 各种目的无血清培养最好首选AIM V（12005） 培养基（SFM）。 29 L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液 中不稳定吗？ L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后， L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋 白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经 过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没 有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成， 而氨对于一些细胞具有毒性。 30 GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用 GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？ GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其 不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶 逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20 分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果 在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。 31 什么培养基中可以省去加酚红？ 酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为 红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚 红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。 为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时， 用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究 人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 升级篇-细胞培养7 32 培养基中丙酮酸钠的作用是什么？ 丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾 向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细 胞也可以代谢丙酮酸钠。 34二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入 EDTA的目的是什么？ 二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的 镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰 蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养 基中所有的二价离子。 33 目录上说，Hank‘s 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用， 不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank’s 平衡盐溶液 (HBS)和Earle‘s平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？ HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠 需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles 液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在 CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组 织，需要用Eagles液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培 养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。 升级篇-细胞培养8 35 当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有 血清培养基中所使用浓度的50%。血清蛋白会结合和灭 活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活， 可能对于细胞达到毒性水平。 36 一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您 应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基 本成分在解冻后就开始降解。 37 大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数 更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀， 将会影响它的性能。 38 在溶解的一周内使用贮存在4℃冰箱中的液体胰蛋 白酶溶液。胰蛋白酶在4℃就可能开始降解，如果在室温 下放置超过30分钟，就会变得不稳定。 细胞分离试剂（1） 大部分连续细胞系，强贴壁细胞系，许多早代细胞 HBSS或无钙镁PBS 0.25％胰蛋白酶溶解在无钙镁平衡盐溶液中 细胞表面蛋白完整性重要的连续细胞系 HBSS或无钙镁PBS 0.05％胰蛋白酶溶解在0.53mM EDTA 弱贴壁表皮细胞转化成纤维细胞（要求细胞表面完整性），原代细胞 HBSS或无钙镁PBS EDTA,甘油 溶解在柠檬酸钠中 强贴壁早代细胞系 HBSS或无钙镁PBS 0.25％胰蛋白酶溶解在1mM EDTA，Dispase 0.6-2.4单位/ml 溶解在 PBS 细胞分离试剂（2） 上皮细胞 0.5mM -1mM EDTA 0.5mM -1mM EDTA，Dispase 0.6-2.4单位/ml 溶解在PBS 强贴壁细胞，上皮细胞，一些肿瘤细胞 0.5mM -1mM EDTA 0.25％胰蛋白酶1mM EDTA，Dispase 0.6-2.4单位/ml 溶解在无钙镁 PBS 厚培养物，多层富含胶原的密集培养 1mM EDTA 0.25％胰蛋白酶，200单位/ml胶原酶，1mM EDTA溶解在无钙镁平衡 盐溶液中 培养液pH 值变化太快 CO2 张力不对。培养瓶盖拧得太紧。NaHCO3 缓冲系统缓 冲力不足。培养液中盐浓度不正确。细菌、酵母或真菌污 染。 （1）按培养液中NaHCO3 浓度增加或减少培养箱内CO2 浓 度，2.0g/L 到3.7g/L 浓度NaHCO3 对应CO2 浓度为5％ 到10％。（2）改用不依赖CO2 培养液。 松开瓶盖1/4 圈。 加HEPES 缓冲液至10 到25mM 终浓度。 在CO2 培养环境中改用基于Earle′s 盐配制的培养液，在 大气培养环境中培养改用Hanks 盐配制的培养液。 丢弃培养物或用抗生素除菌。 培养液出现沉淀，但pH值不变 用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成分沉淀下来。冰冻 保存培养液。 用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌。 将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢 弃培养液。 培养液出现沉淀， 同时pH 发生变化 细菌或真菌污染 丢弃培养物。或用抗生素除菌。 培养细胞不贴壁 胰蛋白酶消化过度。支原体污染。培养液中无贴壁因子。 缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。 分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支 原体污染，丢弃培养物。 悬浮细胞成簇 培养液中含钙、镁离子。支原体污染。蛋白酶过度消化使 得细胞裂解释放DNA。 用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞 悬液。 分离培养物，检测支原体。如发现支原体污染，丢弃培养 物。 用DNase I 处理细胞。 原代细胞培养物污染 原代培养组织在进入培养前已污染 培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织。 培养细胞死亡 培养箱内无CO2。培养箱内温度波动太大。细胞冻存或复苏过程中损 伤。培养液渗透压不正确。培养液种有毒代谢产物堆积。 检测培养箱内CO2 检查培养箱内温度 取新的保存细胞种 检测培养液渗透压。注意：大多数哺乳动物细胞能耐受渗透压为260 – 350 mOsm/kg。加入额外试剂如HEPES或药物都有可能影响培养液 渗透压。 换入新鲜培养液 培养细胞生长减慢 由于更换不同培养液或血清。培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或 生长因子耗尽或缺乏或已被破坏。培养物中有少量细菌或真菌污染。试剂保 存不当。 比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验。 增加起始培养细胞浓度。 让细胞逐渐适应新培养液。 换入新鲜配制培养液。 补加谷氨酰胺或生长因子。 用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。或用抗生素除菌。 血清需保存在-5℃ 到-20℃。培养液需在2－8℃避光保存。含血清完全培养 液在2-8℃保存，并在2 周内用完。 接种细胞起始浓度太低 细胞已老化 支原体污染 增加接种细胞起始浓度。 换用新的保种细胞。 分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培 养物。 血清 （1） 1. 保存血清最好的方法? 建议血清应保存在-5℃至-2O℃。然而，若存放于4℃时，请勿超过一个月。 若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回 冷冻。 2. 如何解冻血清才不会使产品质量受损? 建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室温下 使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。 3. 血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理? 血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的 变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后，也会存在 于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响 血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管 内，以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您 以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。 4. 为什么要热灭活血清? 加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩， 细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究，培养ES 细胞，昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。 血 清（2） 5. 有必要做热灭活吗? 实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。 经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚 至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经 过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下 观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清 放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂 扩增。 6. 为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀? GIBICO的胎牛血清 没有预老化，储存在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂 蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可 见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在－20℃储存胎牛血清，避免 反复冻融。 7. 如何避免沉淀物的产生? 解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻 时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，实验显示非常容易产生沉淀物。 解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。 请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清 中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。 血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。 若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。 温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。