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微生物与环境检测实验
——多管发酵法测量水中大肠菌群
一、目的要求
1、学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法
2、了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性
二、基本原理
若水源被粪便污染，则有可能也被肠道病原菌污
染，然而肠道病原菌在水中易死亡、易变异，数量
少，难检测，这就要找到一个合适的指示菌，此指
示菌要求是：粪便中大量出的非病原茵，易检出。
最广泛应用的指示菌是大肠菌群，其特点：
好氧和兼性厌氧；
革兰氏阴性；
无芽胞的杆状细菌；
在乳糖培养基中37℃培养24～48h能产酸产气。
我国规定每升自来水中≤3个；
加氯消毒即供饮用水的水源水≤ 1 000个；
净化及加氯消毒后供饮用水的水源水≤ 10 000个。
检查大肠菌群的方法有多管发酵法与滤膜法两种。
多管发酵法又称水的标准分析方法，为我国大多数卫生单
位与水厂所采用。多管发酵法包括：初步发酵试验、平板
分离和复发酵试验三个部分。
1．初步发酵试验
利用大肠菌群能发酵乳酸而产酸产气的原理来检测。
乳糖能起选择作用；
德汉氏小管收集产生的气体；
溴甲酚紫作为pH指示剂，产酸后即由紫色变为黄色。
溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽胞菌生长的作用。
1、平板分离
平板分离使用EMB(伊红美蓝琼脂培养基)。大肠菌群发
酵造成酸性环境时，EMB中伊红与美蓝作为指示剂，结合
成复合物，使大肠菌群产生带核心的、有金属光泽的深紫
色(龙胆紫)菌落。初发酵管24h内产酸产气和48h产酸产
气的均需在以上平板上划成分离菌落。
2、复发酵实验
以上大肠菌群阳性的菌落的，再通过与第一步相同的
原理来进一步确认。
三、实验器材
1、培养基：
乳糖蛋白胨发酵管(内有倒置小套管)，
三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管 (内有倒置小套管)，
伊红美蓝琼脂平板，灭菌水。
2、仪 器：干热灭菌锅，高压蒸汽灭菌锅，洁净工
作台，培养箱，灭菌吸管，灭菌试管，培养皿，灭
菌三角瓶。
四．操作步骤
1．培养基配置
(1)．乳糖蛋白胨培养液：
蛋白胨
10g
牛肉膏
3g
乳糖
5g
NaCl
5g
蒸馏水
1000ml
调pH至
7.2～7.4
1.6％溴甲酚紫乙醇溶液 1ml
充分混匀，分装于有小倒管的试管中。115℃灭菌20min。
(2)．三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液
具体配置方法同上，除水以外每组分量为原来3倍。
(3)．伊红美蓝培养基：(EMB培养基)
称取伊红美蓝琼脂干粉35g，加热溶化溶解于
1000ml水中，116℃灭菌30min。灭菌后，冷却至
60℃左右时倒平板备用。
每升中含以下成分：蛋白胨
10g
乳糖
10g
磷酸氢二钾
2g
2% 伊红水溶液
20ml
0.65% 美蓝水溶液 10ml
琼脂
15g
2．自来水检查
(1)．水样的采取：火焰烧灼水龙头3min灭菌，放水
5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，待分析。
(2)．初发酵试验：在2个含有50ml三倍浓缩的乳糖蛋
白胨发酵烧瓶中，各加入100ml水样。在10支含有
5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，各加入10ml水样。
混匀后，37℃培养24h。24h未产气的继续培养至48h。
(3)．平板分离：经24h培养后，将产酸产气及48h产
酸产气的发酵管(瓶)，分别划线接种于伊红美蓝琼脂
干板上。再于37℃下培养18～24h，将符合下列特征
的菌落的一小部分，进行涂片。革兰氏染色，镜检。
①．深紫黑色、有金属光泽
②．紫黑色、不带或略带金眉光泽
③．淡紫红色、中心颜色较深
(4)．复发酵试验：经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴
性无芽抱杆菌，则挑取该菌落的另一部分。重新接种于
普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一
初发酵管的同类型菌落1～3个，37℃培养24h，结果若
产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。
证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管
(瓶)数查表2.3，即得大肠菌群数。
3．池水．河水或湖水等的检查
(1)．水样的采取：取距水面10～15cm的深层水样，
先将灭菌的带玻璃塞瓶瓶口向下浸入，然后翻转过来，
除塞后盛满水样，再从水中取出，即得所测水样。须
及时检测，否则应放入后冰箱中保存。
(2)．初发酵试验
①．将水样稀释成10-1、10-2。
②．分别吸取1ml 10-1、10-2的稀释水样和1ml原
水样各注入装有10ml普通浓度乳糖蛋白胨发酵管中，
另取10ml和100ml原水样，分别注入装有5ml和50ml
三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中。
③．混匀，37℃培养24h，观察细菌产酸产气情况。
(3)．平板分离实验
将产酸产气(阳性)发酵管分别接种于EMB上，37℃下
培养18～24h，观察是否为阳性菌落。
(4)．复发酵实验：（同上），查表2-4，2-5。
五．实验结果
1．自来水 100 ml水样的阳性管数是多少？10 ml水
样的阳性管数是多少?查表－2.1得每升水样中大肠
菌群数是多少?
2．池水、河水或湖水 阳性结果记“+”，阴性结果记“-”。
水样管溶液/ml
现象
初发酵
平板分离
复发酵
100
10
1
10-1
10-2
查表－2.2得每升水样中大肠菌群数是多少?
查表－2.3得每升水样中大肠菌群数是多少?
发酵结果
实验日程安排
周一
1、领取器材
500ml三角瓶 ×1 （取自来水）
150ml具塞三角瓶 × 1 （取湖水）
250ml三角瓶 ×4（1个无菌水、2个自来水初发酵、1个湖水初发酵）
试管 × 25（10支自来水初发酵，4支湖水初发酵，3支配湖水梯度，
8支预留复发酵）
9cm培养皿 ×8 （预留复发酵）
1ml移液管 ×3 （配湖水梯度用）
10ml移液管 ×3（1支配培养基用，1支自来水，1支湖水）
试管架 ×1
记号笔 × 1
2、配培养基
（1）普通浓度蛋白胨培养基 200ml
每支试管分装10ml，装入德汉氏小管，共10支。其中3支湖
水初发酵，7支预留复发酵。
（2）3倍浓度蛋白胨培养基 400ml
1> 每个250 ml三角瓶中分装50ml，装入德汉氏小管，共3个。
其中2个自来水初发酵，1个湖水初发酵。
2 >每支试管分装5ml，装入德汉氏小管，共11支。其中10支
自来水初发酵， 1支湖水初发酵。
（3）无菌水 250ml三角瓶中装入蒸馏水150ml，灭菌待用。
3、灭菌
（1）干热灭菌
培养皿 ×8
1ml移液管 ×3
10ml移液管 ×3
500ml三角瓶 ×1
150ml具塞三角瓶 × 1
（2）湿热灭菌
试管×25
250ml三角瓶 ×4
周二：初发酵实验
1、采样
自来水
湖水（九曲桥）
2、接种
（1）自来水
2个50ml三倍培养基三角瓶中分别接100ml水样
10支5ml三倍培养基试管中分别接10ml水样
（2）湖水
1个50ml三倍培养基三角瓶中接100ml水样
1支5ml三倍培养基试管中接10ml水样
3支10ml普通培养基试管中分别接入10-1稀释、10-2稀释、原水样各1ml
3、培养：37摄氏度培养箱中培养
4、配EMB培养基 100ml，装入250ml三角瓶中灭菌。取出后在洁净工作台上
倒入无菌培养皿中，制成EMB平板
周三：平板分离
1、观察24h初发酵实验结果，并记录产酸产气结果。未产酸产气的
继续培养至48 h。阳性管记“+”，阴性管记为“-”。
2、初发酵阳性管划线接种到EMB平板中，37度倒置培养。
周四：观察平板分离结果，染色，复发酵实验
1、取培养24h的EMB平板观察，挑选出具有以下特征的菌落
①．深紫黑色、有金属光泽
②．紫黑色、不带或略带金眉光泽
③．淡紫红色、中心颜色较深
2、挑取符合特征的菌落其中一小部分做革兰氏染色观察，是否为革兰
氏阴性、无芽胞的杆状细菌，是则记为阳性。
3、在阳性平板中挑取涂片观察过的菌落1-3个接种到复发酵培养基中。
周五：观察复发酵结果
1、观察复发酵结果，确认阴性或者阳性。
2、查表计算出水样中大肠菌群数量。
3、清洗平板、试管等实验器材并归还。
周六
个别初发酵需48h的观察实验结果