Transcript 单增李斯特菌
单核细胞增生李斯特菌的检验 2010年10月 李斯特菌概述 • 李斯特菌在环境中分布广泛，是食品污染重要的感染源。 肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都可能受到李斯特菌的 感染。 • 分类学上分为七个种 1、单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes) 2、绵羊李斯特菌 (L.ivanovii) 3、英诺克李斯特菌 (L.innocua) 4、威尔斯李斯特菌 (L.iwelshimeri) 5、西尔李斯特菌 (L.seeligeri) 6、格氏李斯特菌 (L.grayi) 7、默氏李斯特菌 (L.murrayi) 其中单增李斯特菌是唯一能引起人类疾病的。 单核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是 一种常见的土壤细 菌，在土壤中它是一种腐生菌， 以死亡的和正在腐烂的有机物为食。它也是某些食 物（主要是鲜奶产品）中的一种污染物，能引起严 重食物中毒。 单核细胞增生李斯特菌是一种人畜共患病的病 原菌。它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要 表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存 在于自然界中，食品中存在的单增李斯特菌对人类 的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁 殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。 • 特点 1．分布广：存在于土壤、水域(地表水、污水、 废水)、昆虫、植物、蔬菜、鱼、鸟、野生动物、 家禽。 2．生存环境可塑性大：能在2-42℃下生存(也 有报道0℃能缓慢生长)能在冰箱冷藏室内较长时 间生长繁殖。 3．适应范围大：酸性、碱性条件下都适应。 4．带菌较高的食品有：牛奶和乳制品；肉类 (特别是牛肉)；蔬菜；沙拉；海产品；冰淇凌等。 流行情况 • 1999年底，美国发生了历史上因食用带有 李斯特菌的食品而引发的最严重的食物中 毒事件，据美国疾病控制和防治中心资料 显示，在美国密歇根州有14人因食用被该 菌污染的“热狗”和熟肉而死亡，在另外 22个州97人患此病，6名妇女流产。 流行情况 • 1992-1995年法国出产的奶酪及猪肉中发现李斯特 菌，2001年11月以来，我国质检部门多次从美国、 加拿大、法国、爱尔兰、比利时、丹麦等二十多 家肉类加工厂进口的猪腰、猪肚、猪耳、小排等 三十多批近千吨猪副产品中检出单增李斯特菌、 沙门菌等致病菌。 • 李斯特菌潜伏期长，从食用受污染食品至发病， 一般间隔1至8周。李斯特菌比常见的沙门菌和某 些大肠杆菌更为致命。 • 美国疾控中心2011年9月28日报道说，美国已有18 个州72人因食用受李斯特菌污染的甜瓜而染病.美 国卫生官员7日称,现在全美已有24个州报告了李 斯特菌感染病例，死亡人数21人，感染人数升至 109人。 • 这是美国自1998年以来致死人数最多的一次食源 性疾病疫情。 单增李斯特菌形态学 李斯特菌为G+短小的无芽孢杆菌，大小为0.40.5μm×0.5～ 2.0μm, 幼龄细菌呈球杆状，成单个、V形或Y形排列。在普通 营养琼脂平板上菌落形态为细小、半透明，微带珠光的露水滴 样菌落。在血琼脂平板上有β溶血环。在显色培养基上呈蓝绿 色。 • 兼性厌氧、无芽胞，一般不形成荚膜，但在营养 丰富的环境中可形成荚膜，在陈旧培养中的菌体 可呈丝状及革兰氏阴性。该菌有4根周毛和1根端 毛，但周毛易脱落。 • 该菌营养要求不高，在20--35℃培养有动力，穿 刺培养2－5天可见倒立伞状生长，肉汤培养物在 显微镜下可见翻转运动。 单增李斯特菌生物化学特性 • 该菌触酶阳性，氧化酶阴性。 • 发酵多种糖类，产酸不产气。 • 不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉 子糖、卫矛醇和纤维二糖。 • 不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解。 • 吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、 鸟氨酸均阴性。 • VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。 • 对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20min可杀死，70%酒精 5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min 可杀死此菌。该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺 均敏感。 检验程序 检样25g 增菌 EB增菌液225ml 30℃， LB1增菌液225ml 30℃，24h 48h～7d LB2增菌液10ml 选择性培养基MMA 分离培养 SIM动力培养基 纯培养 确证试验 30℃，18～24h TSI琼脂 25℃，2～5d TSA-YE培养基 革 兰 染 色 镜 检 生 化 鉴 定 溶 血 试 验 致 病 力 30℃，24h 实验目的 • 掌握食品中单核增生李斯特菌的检验方法。 • 了解食品微生物检验的一般程序。 • 掌握微生物无菌操作。 实验步骤 1 样品的收集及处理 取25g（25ml）样品放入均质 器，加225ml增菌液，充分搅拌成均质。 2 增菌培养 EB增菌液；LB1增菌液－LB2增菌液 3 分离培养 划线至MMA选择性培养基， 30℃培养 48h。 4 接种TSI和SIM动力培养基 5 纯培养 可疑者接种TSA-YE培养基； 6 染色镜检 革兰染色；菌悬液（翻滚运动）； 7 生化鉴定 结果观察判断 • 分离培养 在MMA平板上单增李斯特菌的菌落蓝色 或者兰灰色,扁平圆润，稍有凸起,边缘整齐 菌落较小，约为0.5mm左右。 在SIM动力琼脂培养基上，可出现倒伞状李斯特菌 的鞭毛运动轨迹。 革兰染色:镜下可见革兰阳性短小杆菌。 水浸片下：可见非常活泼的翻转运动。 EB增菌液 • 配方：（g/L） 胰蛋白胨 17.0g 大豆胨 3.0g 酵母粉 6.0g 氯化钠 5.0g 磷酸氢二钾 2.5g 葡萄糖 2.5g pH 7.3 LB1和LB2增菌液基础 • LB1、LB2 （L/G） • 胰胨 5.0 多价胨 5.0 酵母粉 5.0 氯化钠 20.0 磷酸二氢钾1.35 磷酸氢二钠12.0 七叶苷 1.0 在225毫升LB基础液中加 入盐酸吖啶黄素2.7毫克、 萘啶酮酸4.5毫克配套试 剂即为LB1增菌液。 在200毫升LB基础液中加 入盐酸吖啶黄素5.0毫克、 萘啶酮酸4.0毫克配套试 剂即为LB2增菌液。