Transcript 方勇飞--感染与类风湿关节炎

方勇飞简介
主任医师、教授、博士研究生导师
第三军医大学西南医院中西医结合科
与风湿病专科主任
学术任职：
中国中西医结合学会风湿病分会副主任委员
中华中医药学会风湿病分会常务委员
中华医学会风湿病分会委员
中国医师协会风湿免疫科分会常务委员
重庆市中西医结合学会风湿病专业委员会主任委员
重庆市中医药学会风湿病专业委员会主任委员
感染与类风湿关节炎
第三军医大学西南医院 方勇飞
2013年8月25日 东莞
类风湿关节炎的病因
• 类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是
一种病因未明的系统性自身免疫病。其病理特
点为慢性滑膜炎，以及由此造成的关节软骨和
骨质破坏，最终导致关节畸形。
• 病因：遗传和环境因素在RA发病中均发挥重要
作用，两者共同参与RA发病
• 机体内外环境中微生物感染与RA之间的相关性
一直是RA病因学研究的热点
RA发病:基因与环境相互作用
McInnes IB N Engl J Med 2011
遗传因素
• 类风湿关节炎患者1级亲属中患病的风险
较普通人群高1.5倍。
• 同卵双胞胎中RA发病的一致率为15%30%,异卵双胞胎的RA发病一致率仅为5%
• 与类风湿关节炎发病相关的易感基因包
括HLA-DR、PADI4和PTPN22等。
•PTPN22 蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型22(protein tyrosine
phosphatase nonreceptor 22，PTPN22)基因。调节淋巴细胞的激活
•PADI4 Protein-arginine deiminase type IV 精氨酸脱亚胺酶
精氨酸到瓜氨酸转化的酶，对自身抗原的产生起重要作用
感染因素
• 某些病毒和细菌感染可能作为始动因子，
启动携带易感基因的个体发生免疫反应，
进而导致类风湿关节炎的发病。
• 与类风湿关节炎发病相关的病原体包括EB
病毒、细小病毒B19、流感病毒及结核分
枝杆菌等
微生物与风湿热
早在1932年人们就开始研究风湿热和乙型溶血
型链球菌的关系,之所以 关注二者的联系，是
因为临床流行病学发现，风湿热和乙型溶血链
球菌感染密切相关
微生物与反应性关节炎
反应性关节炎是微生物感染后引起的无菌性关节炎
①非淋病性尿道炎后发病型：主要为衣原体；
②细菌性腹泻后发病型：主要为沙门菌、志贺菌等
③链球菌感染后发病型：主要为链球菌
微生物与RA
•在关节滑膜组织中发现细
菌肽聚糖（图A、B）其中红
色是肽聚糖成分，说明细菌
细胞壁可能影响RA
•用双染法免疫组化，发现
细菌的肽聚糖，箭头所示
•(图C)
Schrijver IA,(2000). Arthritis Rheum 43:2160
牙龈卟啉单胞菌与RA
McInnes IB N Engl J Med 2011
牙龈卟啉单胞菌与RA
• 牙龈卟啉单胞菌
Porphyromonas
gingivalis，Pg是革兰
氏阴性、 厌氧和无动力
的不解糖杆菌
• 是牙周病尤其成人牙周
炎病变区最主要的优势
菌。
• 牙周炎与RA密切相关。
Ann Rheum Dis 2012;0:1 –6.
牙龈卟啉单胞菌与RA
• RA患者有较高的牙周炎发病率，同样牙周炎患者
有较高的RA发病
(Georgiou et al.,
2004)
• RA和牙周炎有相同的易感基因HLA-DR4
(Katz et al., 1987; Wegner et al., 2010)
• RA病人血液中发现抗Pg抗体
(Loyola-Rodriguez et al., 2010)
• RA滑液中能检测Pg菌DNA
牙龈卟啉单胞菌与RA
• Pg是目前知道唯一能够表达肽基精氨酸
脱亚氨酶(PAD)的菌,PAD能够瓜氨酸化蛋
白，是RA重要致病因子。菌PAD酶跟人类
的PAD并不完全相同，但是它的作用不可
取代。(McGraw et al., 1999) (Schellekens et al.,
2000)
• 治疗药物：噢硝唑、克拉霉素、多西环
素、米诺环素（RA治疗有效 ） 。
肠道菌群与RA
McInnes IB N Engl J Med 2011
胃肠微生物群影响RA的发生
• The gastrointestinal microbiome（微生
物群系） is now recognized to influence
the development of autoimmunity in
articular models, and specific (and
potentially tractable) clinical bacterial
signatures that are associated with
autoantibody-positive rheumatoid
arthritis are emerging出现.
McInnes IB N Engl J Med 2011
Microbiome(微生物组)
• “ A microbiome is the totality of microbes（
微生物）, their genetic elements （要素）
(genomes基因组), and environmental
interactions交互作用 in a particular
environment. The term ”microbiome“ was
coined创立 by Joshua Lederberg, who
argued that microorganisms inhabiting the
human body should be included as part of
the human genome, because of their
influence on human physiology.
8 JUNE 2012
VOL 336
SCIENCE
• microbiome微生物群系是微生物、 其
遗传物质 (基因组) 和在特定环境中与环
境相互作用的整体。
• microbiome“微生物组”一词由 Joshua
Lederberg 创立
• 由于其对人体生理的影响，他们认为居
住在人体的微生物群系应列为人类基因
组的一部分。
Microbiota(微生物丛/区）
微生物触发自身免疫？
• Characteristic oral and intestinal
microbiota in rheumatoid arthritis
(RA): a trigger for autoimmunity?
• Scher JU, Ubeda C, Pillinger MH, eta Arthritis Rheum,
2010;62:Suppl:1390. abstract.
微生态学(microbiology)
• 研究正常微生物群的结构、功能及其与
宿主相互依赖和相互制约关系的科学称
为微生态学。它涉及生物体与其内环境
（包括微生物、生物化学和生物物理环
境)相适应的问题。
• 人类医学经历了治疗医学和预防医学，
正在向保健医学迈进，微生态学则是保
健医学的理论和实际应用的基础学科。
肠道微生物
• 在2007年美国国立卫生研究院，就颁布了人类
微生物基因组计划，来更好的研究微生物在人
体中所起的作用
• 肠道内大约含有1.5kg的细菌，它们能够编码
的基因有300万个，是人类编码基因的100倍
•
Scher JU (2011) Nat Rev Rheumatol 7 (10):569-578
肠道微生物与RA
• RA患者粪便中的产气荚膜梭菌含量显著多于
正常组，并且与RA病情活动度相关
SHINEBAUM R Br （1987） J Rheumatol, 26(5): 329-333
• 在RA患者滑膜中分离出耶尔森菌属等细菌
的抗体
Rheum Dis 48 (7):577-581
Stahlberg TH (1989) . Ann
肠道微生物与关节炎
人体肠道细菌细胞壁能够诱发实验动物产生
关节炎
Chen T. (2002). Clin Exp Rheumatol 20 (2):193-200
体外研究发现，肠道菌细胞壁的肽聚糖能够激
发细胞因子的释放，细菌的细胞壁成分能够激
发RF的分泌
MM .(2002) .Clin Immunol 104 (1):1-13.
Newkirk
肠道微生物与RA
• 但迄今为止还未能找到引起RA发病的直接致病
菌。与某种单一微生物感染相比，总微生物负
荷量和微生态平衡是影响RA发病更重要的因素
• 芬兰风湿病学家发现早期RA患者（病程≤6个
月）粪便中双歧杆菌、拟杆菌属、脆弱类杆菌
亚群、直肠真杆菌-球形梭菌亚群等含量明显
少于对照组，提示肠道菌群失调参与了RA的发
病
•
Vaahtovuo J .(2008). J Rheumatol. 35(8): 1500-5.
肠道菌群与RA相关性的中医思考
《素问.至真要大论篇》
• 诸湿肿满，皆属于脾；
• 诸痉项强，皆属于湿；
• 《灵素节注类编》 “痉者，经脉强急，不
得屈伸，湿闭气血，不得流通，故皆属
于湿也。”
研究病原微生物方法
科赫法则通常是用来确定侵染性病害病原物的操
作程序法则
• 在每一病例中都出现相同的微生物，且在健康者
体内不存在
• 要从寄主分离出这样的微生物并在培养基中纯培
养
• 用这种纯培养的微生物接种健康而敏感的寄主，
同样的疾病会重复发生
• 从试验发病的寄主中能再度分离培养出这种微生
物来
脾虚湿困型类风湿关节炎患者
肠道正常菌群分析
活菌培养计数
30例脾虚RA患者和21例健康人粪便菌群培养结果
分组 双歧杆菌
乳杆菌
脆弱类杆菌
梭菌
肠杆菌
肠球菌
正
常
人
RA
8.55±0.9
0
6.78±1.1
8
8.73±0.90
8.41±0.40
7.85±0 .84
6.71±0.8
2
6.21±1.4
8*
6.40±1.2
2
6.54±1.28
8.34±1.01
7.95±0 .88
6.45±1.21
P
0.000
0.111
0.007
0.889
0.728
0.182
*
注 ** ： p<0.01
• 我们通过活菌培养发现RA患者脆弱类杆菌和双歧杆
菌数量显著少于健康受试者(p<0.01)。
早期类风湿关节炎患者肠道
益生菌乳杆菌群落分析
• 科赫法则认为病原微生物必须是可培养
的活菌，但是人体内80%的菌是无法培养
的
• 现代DNA测序技术为研究不可培养的微生
物提供了技术支持。
16S rRNA基因检测技术
• 16s rRNA基因：是细菌染色体上与rRNA相对应的
DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中
• 16s rRNA具有高度的保守性和特异性，随着PCR技
术的出现及核酸研究技术的不断完善，16s rRNA
基因检测技术已成为病原菌检测和鉴定的一种强
有力工具
•
Weisburg, W. G J. (1991) Bacteriol. 173, 697–703
具体步骤
• 提取肠道细菌总DNA， 设计通用引物，
扩增所有细菌的16S rRNA 片段，电泳
时不同序列在凝胶上所处位置不同，横
向分析图谱，相同水平位置条带代表同
一种属细菌， 比较各泳道同水平位置变
化能够揭示此种属菌在各样本中组成的
变化
• 优点：可以发现不可培养的菌。
RA患者肠道菌群构成的差异
对电泳图谱条带数及亮度信息进行数值化， 根据肠道
菌群相似性聚类分析
构成差异研究方法与结果
结果：样本可以聚合为两类， RA 患者聚合为一类;
多数健康人样本也能聚合为一类
RA与对照组乳杆菌差异
条带1唾液乳杆菌,
条带2惰性乳杆菌,
条带3瘤胃乳杆菌
RA与对照组乳杆菌差异
• 唾液乳杆菌 、惰性乳杆菌、瘤胃乳杆菌
在RA患者中检出率是增高的；在健康志
愿者图谱中未观测到 黏膜乳杆菌
• 乳杆菌增加可能是RA疾病发展的结果，
RA患者肠道乳杆菌反应性的增加，乳杆
菌数量增加、肠道定植增多，有利于形
成更厚的黏膜屏障防止致病菌侵袭
早期类风湿关节炎患者肠道梭菌对
II型胶原诱导性关节炎模型的影响
• 文献报道梭菌对RA发病有重要作用，为验证条件
致病细菌能否加重RA疾病病情，我们分离RA患者
肠道梭菌，灌肠接种到DBA/1小鼠体内，
• 2周后进行II型胶原免疫诱导关节炎，观察DBA/1
小鼠在胶原诱导后关节炎发病情况。
• 胶原诱导性关节炎
(collagen-induced
arthritis,CIA)模型，
该模型优点是与RA临床
表现类似，是研究RA发
病机制，以及药物疗效
的重要模型。
• 图示为本实验中DBA/1
小鼠肿胀关节
实验分组
• II型胶原诱导组
• II胶原诱导并且接种
梭菌组
• 无胶原诱导，但接种
梭菌组
• 空白对照组
评分标准
•
•
•
•
•
•
•
初次注射II型胶原后，记录小鼠关节评分3次/周。
参考 Nat Protoc, 2007. 2(5): p. 1269-75.
0分：无红斑、肿胀
1分：跗骨或者踝关节，单一部位的轻微红斑、肿胀
2 分：踝关节延伸至跗骨的轻度红斑、肿胀
3 分：踝关节蔓延至跖骨的中度红斑、肿胀
4 分：踝关节蔓延至跖骨的严重红斑、肿胀，关节僵
直、畸形
.
• 图a表示后肢关节评分4分，图b表示后肢关节评分3分
• 图c表示后肢关节评分2分，图d表示前肢关节评分4分
• 图e表示前指关节评分3分
关节炎发病率
• 发病率：患病小鼠占总体小鼠比例，分析组间整体发病差异
•
仅II型胶原诱导模型组DBA/1小鼠，关节炎发病率100%(6/6)。 II胶原诱导且接种梭菌模型组DBA/1小鼠，发
病率83%(5/6)，两组发病率无显著差异（P=0.296>0.05），发病起始时间为第30.66±8.91天迟于仅II型胶原
诱导模型组第28.33±14.55天，但两组差异无统计学意义（P=0.745>0.05）
左图：每组中每只小鼠肿胀的肢体数目
右图：每组中每只小鼠肿胀关节的评分
统计分析发现在初次免疫后第13周，仅胶原诱导组小鼠关节
评分3.74±0.39，患病肢体数2.67±1.03；均低于胶原诱导且
接种梭菌模型组小鼠关节评分3.93±0.15（P=0.315>0.05），
患病肢体数3.00±0.70(P=0.557>0.05)，差异无统计学意义。
病理切片
A：对照组小鼠关节切片
B：接种梭菌且胶原诱导组
小鼠关节切片
C：组仅胶原诱导组小鼠关
节切片
D：接种梭菌且胶原诱导组
小鼠皮下切片
炎性细胞因子的差异
胶原诱导组
α
TNF-
239.7±59.9
胶原诱导且接种梭
菌组
**
301.1±19.2
** ▴▴
仅接种梭菌组
空白对照组
174.2±25.6▴
158.1±17.6
128.7±31.0▴
128.5±19.0
71.0±13.3▴▴
64.0±4.1
▴
IL-1β
190.0±55.0
**
247.2±32.0
** ▴
▴
IL-23
95.6±8.2**
105.7±7.3**
附注：与空白组比较，* P<0.05，** P<0.01；与仅胶原诱导组比较，▲P<0.05，
▲▲P<0.01。
附注：与空白组比较，* P<0.05，** P<0.01；与仅胶原诱导组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01。
ELISA 检测发现，在初次免疫后第13周，胶原诱导且接种梭菌模型组血清中
TNF-α、IL-1β含量显著高于胶原诱导模型组（P<0.05）。
• II型胶原诱导且接种
梭菌组IL-23含量
105.7±7.3 ，
• 仅胶原诱导组IL-23含
量95.6±8.2
• 均显著高于空白对照
组64.0±4.1（P
<0.01）。
研究结论
• RA患者肠道菌群结构发生改变，肠道中双歧杆菌、
脆弱类杆菌含量显著减少。
• 乳杆菌16SrRNA总量增加，肠道乳杆菌菌群结构
发生改变，并未检测到致病乳杆菌。
• RA患者肠道梭菌可以增加胶原诱导性关节炎小鼠
外周血中TNF-a、IL-1分泌水平。
• 我们研究发现灌肠接种梭菌虽无法直接诱发关节
炎症状产生，但能显著增加CIA小鼠外周血IL-1、
TNF-α水平。
• 文献报道IL-1作为RA疾病进程中重要的细胞因子，
介导炎症反应、促进免疫应答等生物学效应。
• TNF-α促进滑膜细胞增殖 ,滑膜增生,炎性细胞
浸润、聚集,血管翳形成,软骨降解,骨侵蚀等。
微生物影响细胞因子的分泌
 无菌条件下，K/BxN小鼠的自发关节炎明显减弱
 通过注射分段发丝状细菌能够引发自身免疫反应，
细菌能够影响IL-1, IL-6, IL-17的分泌，增加抗
体的产生最终产生关节炎
Wu HJ. (2010) .Immunity 32 (6):815-827
 在无特定病原体环境下,,昆明小鼠灌服大肠杆菌
能够直接诱导产生关节炎症状，关节有炎性细胞
的侵入，TNF-α分泌水平增加
P. Wu, et al. (2012). PLoS One, 7(3):e34494.
微生物影响TNF-α分泌
• 细菌脂多糖和内毒素可以激发机体细胞分
泌大量的TNF-α
•
. Rahman MM, McFadden G (2006) . PLoS Pathog 2: e4
• 瘤胃乳杆菌可以激发单核细胞分泌TNF-α
•
Taweechotipatr, FEMS Microbiol Lett, 2009. 293(1): p. 65-72.
TNF-a在RA病理中的作用
促进滑膜细胞增殖
滑膜增生
诱导趋化因子分泌→募集白细胞
上调血管粘附分子表达→白细胞渗出
TNF
炎性细胞
浸润、聚集
抑制细胞调亡
促进血管生长细胞因子分泌→新生血管
血管翳形成
增加前炎性细胞因子等炎性介质产生
滑液渗出
刺激基质金属蛋白酶(MMPs)表达
软骨降解
促进破骨细胞分化、成熟
骨侵蚀
Choy, E. H.S. et al. N Engl J Med 2001;344:907-916；M M J Herenius,1 R M Thurlings
et al. Ann Rheum Dis. 2011 June 1; 70(6): 1160–1162.
临床实践
• 虽然迄今为止还未能在滑膜组织或关节
积液中获得单一的微生物，也未能找到
引起RA发病的直接致病菌
• 临床实践中，柳氮磺胺吡啶和米诺环素
等具有抗生素特性的药物用于RA治疗，
显示出明显疗效
• 中药对微生物与人体相互作用的干预是
未来重要的研究方向
他山之石
肠道微生物组与代谢综合症
8 JUNE 2012
VOL 336
SCIENCE
肠道菌群与肥胖
• （Jeffrey I. Gordon）是美国华盛顿大
学医学院的微生物学家。
• 戈登和他的同事用实验表明，肥胖症和
小鼠肠道中的菌群存有关联。
• 2006 年，他开始了一种饮食疗法，食
谱中包括山药和苦瓜，同时对自己的体
重以及肠道中的菌群进行监测。
肠道菌群与肥胖
• 将小鼠从正常饮食转换到高脂肪饮食，
然后再换回到正常饮食，期间每两周监
测一次小鼠肠道中菌群的变化
• 观测发现，大约有 80 种细菌与饮食的
转变存在关联
• 更为可喜的是，由高脂肪饮食所引发的
菌群改变，是完全可逆的。
脾胃为后天之本
• Traditional doctors “
don“
’t have any idea
about gut microbiota,”“But they think
that the gut is the foundation for
human health —
and that the foundation
is acquired after birth.”
出生后定植正确细菌有益健康
• (The microbiome is acquired after
birth, and there is increasing
evidence that early colonization by
the right bacteria is important for
health later in life.)
传统食品调节肠道菌群
益气健脾与苦寒
燥湿代表药膳：
山药与苦瓜有助
于肠道益生菌的
生长
中药调节肠道菌群并减轻肥胖
• 山药和苦瓜里面含有益生元，可以被肠
道细菌发酵利用，调节人体肠道菌群生
长。再加上以粗粮为主的饮食，赵立平
在两年内减掉了 20 公斤。他的血压、
心率和胆固醇水平也都降了下来。
• 一种抗炎细菌 Faecalibacterium
prausnitzii 的数量大幅增加，从最开始
根本检测不到，到后来增加为他肠道细
菌总量的 14.5％
中药调节肠道菌群并减轻肥胖
•93人完成了为期待4周的观察，体重呈中等水平
下降，减轻了大约 7 公斤
•肠道中产生毒素的细菌减少，有益细菌数量增加
苦寒燥湿药物黄连提取物
有助于减肥并减轻胰岛素抵抗
• 给小鼠高脂肪饮食的同时喂养小檗碱，
小鼠便不会发展为肥胖或产生胰岛素抵
抗，而且其肠道中的已知病原体种群数
量下降，已知的有益菌数量也出现上升
问题与方向
• 我们只能发现微生物与疾病的关联，还
不能进行致病机理的研究
• 用动物研究中提取出的数据来制定人体
实验时需要监测的代谢参数
• 最终目标是在分子层面上确立微生物与
疾病之间的联系
赵立平的电子邮件签名
• EAT RIGHT,
• KEEP FIT,
• LIVE LONG,
• DIE QUICK
• （吃得对，身材好，活得长，死得快）
谢谢