Transcript 发酵工程实验-曾小群
实验一 双酶法制备淀粉糖 综合实验一 面包酵母高 密度发酵实验 实验一 双酶法制备淀粉糖 • 一、 实验目的 • 1、了解淀粉糊化及酶法制备淀粉糖浆的基 本原理。 • 2、掌握淀粉双酶法制备淀粉糖浆的实验方 法，以及酶的使用。 淀粉的组成 • 由D-葡萄糖单体组成的同聚物。包括直链淀粉（α1,4-糖苷键）和支链淀粉两种类型。（α-1,4-糖苷键， α-1,6-糖苷键 ） CH2OH CH2OH O OH O OH O O O OH OH CH2OH OH CH2 CH2OH O O OH O O OH a-1，6糖苷键 OH CH2OH O OH O OH a-1，4糖苷键 O O OH O OH 淀粉颗粒 • 麦芽、辅料中的淀粉，一般由细胞壁包围， 以颗粒状存在。这种颗粒不溶于水，也不 受淀粉酶的作用。 Wheat starch Potato starch 糖 化 中 的 淀 粉 分 解 淀粉的糊化、液化、糖化 糊化是指淀粉在热水中能吸收水分而膨胀，最后 淀粉粒破裂，淀粉分子溶解于水中形成带有粘性 的淀粉糊，这一过程称为糊化。简而言之，糊化 就是淀粉颗粒在热溶液中膨胀破裂的过程。 液化是指利用液化酶将糊化淀粉水解成糊精和低 聚糖小分子等，使粘度降低，流动性增高。 糖化是指利用利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步 水解，转变为葡萄糖的过程，在生产上称为“糖 化”。 DE值 • DE值即葡萄糖值，用以表示淀粉水解程度 及糖化程度，指的是葡萄糖占干物质的百 分率，即： 还原糖% DE值 100% 干物质% 二、实验原理——淀粉的糖化 许多微生物不能直接利用淀粉，除分泌胞外淀粉酶微生物外。 淀粉 水解 葡萄糖，才能被酵母菌利用。 酸解法 酶解法 酸酶（或酶酸）结合法 酸酶法 酶酸法 淀粉糖化的方法 1.酸解法 淀粉 酸 高温高压 葡萄糖 2.酶解法（双酶法） 淀粉 a-淀粉酶 糊精和低聚糖 糖化酶 葡萄糖 (液化) （糖化） 3.酸酶法 淀粉 酸解法 糊精和低聚糖 糖化酶 葡萄糖 4.酶酸法 淀粉 a-淀粉酶 糊精和低聚糖 酸解法 葡萄糖 双酶法制备淀粉糖 • 酶法糖化投资少，工艺稳定，对设备要求 也不高，产品质量好，消耗小，收率高， 条件温和，对环境影响小。 三、试验材料 • 玉米淀粉、液化型α-淀粉酶（酶活力6000 单位/g），糖化酶（葡萄糖淀粉酶、酶活 力为4-5万单位/g），10%NaOH, 5%Na2CO3, 5%CaCl2。 • 500ml烧杯，pH试纸、秒表，玻璃棒，恒 温水浴锅，电炉，石棉网、温度计、恒温 水浴、手持糖度仪（可溶性固形物）。 四、方法和步骤 • 1、双酶法生产淀粉糖浆工艺流程 50g淀粉（加水 200ml，搅拌均匀）——淀粉浆——5%碳酸钠调节 pH≈6.2-6.3——2ml 5%CaCl2溶液——90-95℃水浴 上加热（不断搅拌）——淀粉糊化——加入液化型α淀粉酶60mg（不断搅拌）——液化——70-80℃搅拌 20分钟，（取样分析DE值——至电炉（隔石棉网） 加热到95℃至沸，灭活10分钟——过滤，滤液冷却 至55℃——加入糖化酶200mg——调节pH≈4.5, 于 60-65℃恒温水浴中糖化3-4小时，（3小时取样分析 控制DE≈42）即为淀粉糖浆。 • 2、检测 用手持糖度计测定，直接读取固形物含量。 （3）糖化过程中DE值的变化 DE 值 糖化时间 • 实验二、面包酵母活化和种子液培养 试验材料 • 面包酵母、葡萄糖、酵母浸膏、牛肉膏、 氯化钠、 • 试管（10×150mm）、培养皿、烧杯 （500mL）、锥形瓶（300mL）、接种环、 酒精灯、牛皮纸、pH试纸、恒温摇床、培 养箱、离心机、生物安全柜、血球计数板、 光学显微镜、盖玻片 配制培养基 • （1）制备平板分离培养基： 葡萄糖 20g，蛋白胨 20g，酵母抽提物 10g，琼脂 20g，水 1000 mL。 灭菌115℃，20min。每三角瓶分装100mL，灭菌后 倒平板。 • （2）制备斜面保藏培养基：葡萄糖 20g，蛋白胨 20g，酵母抽提物 10g，琼脂 20g， 水 1000mL。 灭菌115℃，20min。每试管分装5mL，灭菌后摆斜 面待用。 • （3）制备种子培养基：葡萄糖 20g，蛋白胨 20g， 酵母抽提物 10g, 水 1000mL。灭菌115℃，20min。 每三角瓶分装30mL，灭菌待用。 培养基的配制 培养基的制备过程 称量---溶解----调节pH值----过滤---分装及包扎----灭菌----灭菌后试管 摆放斜面 • 1.称量 按照培养基配方，准确称量各成份放于瓷缸中。 • 配方：牛肉膏5.0g,蛋白胨10.0g，NaCl5.0g,琼脂 20.0g,蒸馏水1000ml,pH7.0。 • 2.溶解 • 向上述瓷缸中加入所需要的水量，搅拌，加热使 其溶解。如是配制固体培养基，在琼脂的熔化过 程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢 出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水分。 • 3.调节pH值 • 用玻璃棒沾少许液体，测量PH值。用氢氧化钠和 盐酸调节PH。 • 4.过滤 用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省 去。 • 5.分装及包扎 • 根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试 管内（用分装漏斗）或三角瓶内，管（瓶）口 塞上棉塞。最后用牛皮纸将棉塞部分包好。 • 6.灭菌：高压蒸汽灭菌，1210C灭菌20分钟。 7. 灭菌后试管摆放斜面 注 意 事 项 1、称取药品时严防药品混杂，一把牛角匙称一种药品； 2、蛋白胨极易吸湿，称取时动作要迅速； 2、配制固体培养基时，先将其他药品加热溶解到快沸时，再将称好 的琼脂加入，继续加热至琼脂完全熔化，此过程要不断搅拌，以免 琼脂糊底，并控制火力，防止沸腾外溢； 4、分装量根据试管大小和实际需要而定，固体培养基装量约为管高 的1/5，液体培养基的装量约为管高的1/4，三角瓶的装量不超过瓶 体的1/2 ； 5、分装过程中注意不要将培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞 而引起污染。 返 回 • 2、平板分离 • 称取0.1g即发性干酵母，转移至无菌水试管，振 荡5min，制成菌悬液。划平板，30℃培养2d。 • 用接种环沾取单菌落，划斜面，30℃培养30h。 • 3、种子培养 • 无菌条件下，用接种环挑取斜面上菌落，接种至 种子培养基。30℃，150r/min，培养30h。血球 计数板测种子培养液中酵母菌体密度。 （三）平板划线分离法 交叉划线法 连续划线法 实验二 微生物数量的测定 • （一）实验目的 • （二）实验原理 • （三）实验器材 • （四）实验方法 • （五）实验作业 （一）实验目的 1、了解显微镜计数的原理； 2、学习并掌握使用血球计数板进行微生 物直接计数的方法。 （二）实验原理 利用血球计数板在显微镜下直接计数，是微 生物实验中一种十分重要的常用微生物计数方 法。此法的优点是直观、快速，不论微生物的 生理状况如何，都可以在显微镜下一一计数。 由于此法得到的是活菌和死菌的总和，故又称 为总菌计数法。 血球计数板是一块特制的 载玻片，其上四条纵槽构成 了三个平台，中间的平台又 被一短横槽隔成两半，每一 边的平台上各刻有一个方格 网，每个方格网共分成9个 大方格，中央的大方格为计 数室。计数室边长1mm，共 有400个小方格，加盖玻片 于突起部分上时，即形成一 个体积为0.1mm3的计数室。 即1mm×1mm×0.1mm方格的 计数板。 在血球计数板上，刻有一些符号和数字(见图一)，其含 义是：XB-K-25为计数板的型号和规格，表示此计数板分 25个中格；0.1mm为盖上盖玻片后计数室的高；1/400mm2 表示计数室面积是1mm2，分400个小格，每小格面积是 1/400 mm2。 计数室通常也有两种规格： 一种是16×25型，即大方格内分为16中格，每一中格又 分为25小格； 另一种是25×16型，即大方格内分为25中格，每一中格 又分为16小格。 但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同的特 点，即每一大方格都是由16×25=25×16=400个小方格组 成。 1．16×25型的计数板 含16中格，每中格有25个小格， 一般取四角：1、4、13、16四个中方格（含100个小方格） 计数计数重复3次，取其平均值。 1ml 菌 液 中 的 总 菌 数 = 100 个 小 方 格 细 胞 总 数 A/ 100 ×400×10 × 1000×稀释倍数B， 或计数总数A／4×16×10×1000×稀释倍数B。即计数总数A×4×10000×稀释 倍数B 2．25×16型的计数板含25中格，每中格有16个小格。一 般计数四个角和中央（1 、5、13、21、25）的五个中方 格（含80个小方格）的细胞数。计数重复3次，取其平均 值。 1ml菌液中的总菌数 ＝80个小方格细胞总数A/ 80 × 400×10 ×1000 ×稀释倍数B， 或计数总数A／5×25×10×1000×稀释倍数B。即计数总数A×5×10000×稀释 倍数B （三）实验器材 1.菌种 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌悬 液 2.器具 显微镜、血球计数板、酒精灯、接种环、无菌 水、吸管、盖玻片、计数器。 （四）实验方法 1.稀释 将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓， 可不必稀释。 2.镜检计数室 在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若 有污物，则需清洗后才能进行计数。 3．加样品 将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无 菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片 边缘滴一小滴（不宜过多）让菌液沿缝隙靠毛 细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能 充满菌液。注意不可有气泡产生。 4.显微镜计数 静置几分钟，将计数板放在显微镜下，先用低倍镜找 到计数室，再换成高倍镜进行计数，一般以每小格5— 10个菌体为宜；每个计数室选右上右下、左上左下和 中间的五个中方格中的菌体进行计数，每个样品重复 计数两次 5.清洗血球计数板 计数完毕，将计数板在水龙头下冲洗干净后自行晾干 或用吹风机吹干，镜检观察每小格内无残留物为止。 注意事项 1、 每天同一时间，各组取出本组的试管，用血球 计数板计数酵母菌个数，并作记录，连续观察7 天。 2、 从试管中吸出培养液进行计数之前，要将试管 轻轻震荡几下，这样使酵母菌分布均匀，防止酵 母凝聚沉淀，提高计数的代表性和准确性，求得 的培养液中的酵母菌数量误差小。1、加样时先 摇匀菌液，计数室中不可有气泡产生； 3、如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时， 作为两个菌体计算； 4、清洗计数板时切勿用手或硬物刷洗。 5、 对于压在方格界线上的酵母菌应当计数同侧相 邻两边上的菌体数，一般可采取“数上线不数下线， 数左线不数右线”的原则处理，另两边不计数。计 数时，如果使用16格×25格规格的计数室，要按对 角线位，取左上、右上、左下、右下4个中格(即 100个小格)的酵母菌数；如果规格为25格×16格的 计数板，除了取其4个对角方位外，还需再数中央 的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数。 6、 计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数 值来计算，对每个样品可计数三次，再取其平均值。 计数时应不时调节焦距，才能观察到不同深度的菌 体。按公式计算每1ml（或10mL）菌液中所含的酵 母菌个数。 (五)、作业 显微直接计数结果 计 数 室 各格中菌数 1 2 3 4 5 总 菌 数 稀 释 度 菌 平 数 均 值 /ml 第一室 第二室 思考题： 1.用血球计数板计数时，哪些步骤易造成误差？ 2.血球计数板测定原理是什么？它有那些原理？ 实验三 面包酵母高密度发酵 • 一、实验目的 • 1、掌握面包酵母的发酵流程。 二、实验原理 • 酵母高密度发酵技术是一种新型的生化工 程技术，其产品在化工，食品，环保，医 药等方面都存在极大的潜在能力。一般认 为发酵液中酵母干重浓度达到30 g/L以上， 即为高密度发酵。 三、试验材料 • 面包酵母、葡萄糖、酵母浸膏、牛肉膏、 氯化钠、 • 试管（10×150mm）、烧杯（500mL）、 锥形瓶（300mL）、涂布棒、酒精灯、牛 皮纸、pH试纸、 • 恒温摇床、培养箱、离心机、生物安全柜、 血球计数板、光学显微镜 • 发酵培养基: • 酪蛋白胨15 g/ L ,酵母粉25 g/ L ,葡萄糖30 g/ L ,KH2PO4 2. 4 g/ L , K2HPO4·3H2O 16. 34 g/ L • 高密度培养发酵培养基: • 蔗糖75 g/ L ，酵母浸膏33 g/ L ，蛋白胨 16 g/ L ，硫酸镁1.0 g/ L ，K2HPO4·3H2O 3.4 g/ L ，甘氨酸2 g/ L 高压蒸汽灭菌，1210C灭菌20分钟。 高压灭菌锅压强指示指到0时才能打开灭菌锅。 四、实验步骤 • 菌粉----分离纯化-----斜面保藏菌种------种 子培养-----发酵培养（发酵培养基、高密度 培养发酵培养基） • 1、取300mL锥形瓶，加入50mL发酵培养 基，灭菌待用。 • 2、种子液稀释10-3倍后，血球计数板计数。 • 3、将种子液接入装有50 mL发酵培养基的 锥形瓶中，控制接种量使菌液初始细胞密 度为5 ×105/mL。 • 4、30 ℃、150 r/ min培养，每隔12h 取样 测定。 五、结果与讨论 实验四 活性干酵母的制备 • 一、实验目的 • 1、掌握酵母细胞的一般提取方法、以及活 性干酵母的制备方法。 二、实验原理 • 发酵液的后处理包括离心、浓缩、洗涤、 压榨或过滤。滤饼可挤压成半固体酵母块 (含固形物30%) ,包装后作为鲜酵母使用。 如果生产活性干酵母,可将压榨酵母挤压成 细条状,采用快速低温干燥。在干燥过程中 使用添加剂,以生产出稳定性极好的低水分 的活性干酵母,而且减少活性的损失。活性 干酵母含固形物大约为95%。对面包酵母 培育的结果应使其色泽浅,富有生鲜气味。 菌体细胞应各自分开,大小均一。 三、试验材料 • 脱水山梨醇单硬脂酸甘油酯 (乳化剂) • 离心管、烧杯。 • 恒温摇床、培养箱、离心机、生物安全柜、 血球计数板（全班4块）、光学显微镜（全 班两台）、滤纸 四、实验步骤 • 1、乳化剂用80～90 ℃的热水配制, 可按每 100 mL水里加12.5 g 配制, 配好后保持 65～70 ℃, 在抽滤之前加入酵母乳中(加入 的百分比为酵母乳折干后的百分比)，采用 2.0 %的添加量并保证混合均匀。 • 2、将发酵液离心并收集菌体，按上述比例 加入乳化剂，抽滤后，切成小细条干燥 （10oC 烘箱烘干），收集后称重（干酵母 净重=烘干后总重-烘干前滤纸重）。 五、结果与讨论 • • • • 1、活性干酵母成品的质量。 2、活性干酵母的外观特征。 六、思考题 1、加入乳化剂的目的？ 柠檬酸发酵预实验 一、预备实验： • 1.斜面培养基制备：PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂， Potato Dextrose Agar （Medium）） ：（马铃薯 200 克 葡萄糖 20克琼脂 15~20克 自来水 1000毫升自然 PH ）。取PDA培养基粉约43g，加水至1000mL； 121℃灭菌20min。 • 2. 柠檬酸发酵培养基：硝酸铵2.0g，KH2P04 1.0g， MgS04 0.25g，蔗糖150g，水1000ml；pH控制在 5.5~6.5左右，加1mol／L NaOH约2滴。取100ml上述 培养液，加入500ml或300ml三角瓶中，包扎灭菌， 待用。 • 1．菌种活化与种子的制备 • 菌种活化：对于已长久保存的菌种，需经斜面培 养基活化培养一次，即取保存的斜面菌种黑曲霉， 移至斜面培养基，经25~28℃斜面培养至孢子长 好，作为活化后的种子（由实验员准备）。发酵 用的种子制备：用同样方法，移接斜面培养基， 得到的培养物作为发酵用的种子。 • 2．接种与发酵 • 取柠檬酸发酵培养基（液）3瓶，用接种环向每瓶 接入黑曲霉孢子2~3环，26~28℃摇床培养5~7d， 摇床转速120~150rpm，另1瓶不接种留作对照。 今天实验安排 • 1. 配柠檬酸发酵培养基，每组400ml，分装4瓶， 灭菌备用。 • 2. 酵母发酵培养和高密度发酵培养细菌密度（2 组合用一组样品，分别测发酵和高密度发酵培养 结果）、离心测上清液葡萄糖浓度（各组用自己 的样品）。 • 3.酵母离心收集、加乳化剂、抽滤、干燥、称重。 • 4. 接种黑曲霉孢子至柠檬酸发酵培养基（3瓶接 种，1瓶不接种留做对照）。 综合实验二 柠檬酸发酵实验 一些柠檬酸制品 • 1.物理性质 • 在室温下，柠檬酸为无色半透明晶体或白色颗 粒或白色结晶性粉末，无臭、味极酸，在潮湿的 空气中微有潮解性。它可以以无水合物或者一水 合物的形式存在：柠檬酸从热水中结晶时，生成 无水合物；在冷水中结晶则生成一水合物。加热 到78 °C时一水合物会分解得到无水合物。在15 摄氏度时，柠檬酸也可在无水乙醇中溶解。 • 柠檬酸结晶形态因结晶条件不同而不同，有无 水柠檬酸C6H8O7也有含结晶水的柠檬酸 2C6H8O7.H2O、C6H8O7.H2O或C6H8O7.2H2O。 2.化学性质 化学性质：从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸 类化合物，并因此而与其他羧酸有相似的 物理和化学性质。加热至175 °C时它会分 解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。 柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+可以 电离； 加热可以分解成多种产物，与酸、 碱、甘油等发生反应。 • 中文名称： 柠檬酸（ citric acid） • 化学名称： 2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸 • 分子式： C6H8O7 柠檬酸发酵微生物 • 1) 黑曲霉（Aspergillus niger）的形态特 征 • 2) 黑曲霉（Aspergillus niger）的生理 特征 • 黑曲霉生产菌可在薯干粉、玉米粉、可 溶性淀粉糖蜜、葡萄糖麦芽糖、糊精、 乳糖等培养基上生长、产酸。 • 黑曲霉以无性生殖的形式繁殖，具有多 种活力较强的酶系，能利用淀粉类物质， 并且对蛋白质、单宁、纤维素、果胶等 具有一定的分解能力。 一、 实验目的 • 1、了解利用黑曲霉生产柠檬酸的原理与流 程，掌握柠檬酸的发酵生产工艺与发酵分 析方法。 • 2 、通过本实验能较熟练地掌握真菌发酵的 接种、培养与发酵产物的分析测定等技术。 二、实验原理 • 黑曲霉产柠檬酸多，耐酸力强；pH1.6~1.7时尚 能生长，且酸度大时产生葡萄糖酸、草酸等副产 物较少，故进行柠檬酸发酵时，培养液以pH2~3 为宜。 • 用于柠檬酸生产的原料有淀粉、废糖蜜等；本实 验以糖等为发酵原料，黑曲霉为产生菌。在一般 发酵中，均产生多种酸，其中，低碳链的直链脂 肪酸如甲酸、乙酸等称为挥发酸，而乳酸、柠檬 酸等称为非挥发酸。挥发酸和非挥发酸的总和称 总酸。酸的测定方法常采用中和法、电位滴定法 及比色法等；若待测液色泽很深，可采用外指示 剂法。本试验用中和法测定柠檬酸发酵中的总酸； 柠檬酸的定性检验用Deniges试剂。 三、试验材料 • 1．菌种 黑曲霉斜面菌种 • 2．实验器材 0.1mol／L标准NaOH； 0.1mol／L H2S04； 展开剂：正丁醇：甲酸：水=40：55：5； Deniges试剂(HgO 1g溶于20ml 0.2mol／L H2S04中)； 酒精灯；滤纸，漏斗；烧杯：200ml，500ml； 18X180试管；吸管10ml、5ml，150ml三角瓶； 碱滴定管，铁台、蝴蝶夹：酚酞指示剂：200ml 量筒；广范pH试纸；pH酸度计；玻璃棒；布氏漏 斗，抽滤纸，抽滤水泵，离心机和离心管，滴管， 天平。层析缸（ø 10cm×15cm）、毛细管(ø 0.5mm)、玻棒、喷雾器、烘箱、尺、铅笔、干燥 器，等。 • 3. 柠檬酸发酵培养基：硝酸铵2.0g，KH2P04 1.0g，MgS04 0.25g，蔗糖150g，水1000ml； pH控制在5.5~6.5左右，加1mol／L NaOH约2滴。 取100ml上述培养液，加入500ml或300ml三角瓶 中，包扎灭菌，待用。 四、方法和步骤 一、预备实验： • 1.斜面培养基制备：可用PDA培养基或其它霉菌培养 基，用于霉菌的培养。 • 2.发酵培养基的制备：参见实验器材中的柠檬酸发酵 培养基及其制作方法。 二、具体步骤 • 1．菌种活化与种子的制备 • 菌种活化：对于已长久保存的菌种，需经斜面培 养基活化培养一次，即取保存的斜面菌种黑曲霉， 移至斜面培养基，经25~28℃斜面培养至孢子长 好，作为活化后的种子（由实验员准备）。发酵 用的种子制备：用同样方法，移接斜面培养基， 得到的培养物作为发酵用的种子。 • 2．接种与发酵 • 取柠檬酸发酵培养基（液）3瓶，用接种环向每瓶 接入黑曲霉孢子2~3环，26~28℃摇床培养5~7d， 摇床转速120~150rpm，另1瓶不接种留作对照。 • 注意：观察细胞生长情况及变化并记录；观察发 酵过程中pH的变化并记录。 • 当pH3左右是积累柠檬酸的最佳时期。。 • 3．发酵液预处理 • 取发酵液经过滤 将3瓶培养液一并过滤，菌丝用 蒸馏水略加洗涤后弃去。 • 4.发酵产物的检验与分析 • 定性检验（略）： 取过滤液和对照液各约5ml， 放入试管内，加Deniges液lml，在酒精灯上缓缓 加热至沸。逐滴加入20g／L KMn04溶液，若有 柠檬酸存在，则出现白色沉淀。 • 纸层析法：展开剂：正丁醇：甲酸：水=40：55： 5（V/V/V）；显色剂：0.25g的甲基红和0.25g的 溴酚蓝溶于100mL 70%的乙醇中，再用0.1mol/L 的NaOH调成蓝绿色。层析纸：新华层析纸5号， 裁成14cm×23cm，裁剪时，纤维长丝方向与窄 边平行，与长边垂直。 • 方法：将展开剂配好后在钟罩内平衡3小时，在层 析纸上距底边处用铅笔划一条直线（约距离层析 液面1cm），每隔2.5~3cm铅笔轻点一下作一记 号，并点上标样与试验样，置于层析缸中展开至 展层溶剂到达距薄析顶端约1cm处时取出，用电 吹风吹干，喷上显色剂，有机酸在蓝紫色背景下 显示黄色斑点。计算Rf值。 （此方法在室温下 需要3~4h，可方便地检出发酵液中柠檬酸的纯 度。） 5．柠檬酸含量的初步测定 • 酸度滴定法： 将过滤液充分摇匀，用吸管 吸取10ml放入150ml三角瓶中，加2滴酚酞 指示剂，用0.1mol／L NaOH滴定酸度。对 照亦按同法滴定。二者消耗NaOH毫升数的 差额乘以0.64，即得柠檬酸(g／L)的大约数。 • 粗略法：pH值变化的测定 柠檬酸含量测定 • • • • • 在一定量柠檬酸溶液中加入适量的去离子 水，加入2-3滴酚酞指示剂，然后以0.1mol ／L NaOH标准溶液滴定，记下体积v，柠 檬酸总量按下式计算。 式中 vl――0.1mol／L NaOH标准溶液体 积(m1) c1――NaOH标准溶液浓度(mol／L) v2――所取柠檬酸样品体积(m1) Vo――柠檬酸溶液总体积(L) 五、实验结果与与讨论 • 1、记录发酵过程细胞生长变化的现象； • 2、记录发酵过程产酸变化情况并进行结果 分析(pH变化曲线)； • 3、柠檬酸定性、定量测定结果与分析，并 对菌种产酸能力等进行评定。 • 4.完成实验报告 六.思考题 • 1.柠檬酸发酵除了主产物柠檬酸外，还有那 些副产物？ • 2.本实验对PH的要求是什么？ • 3.柠檬酸的得率是多少？ 培养基配置 • 附 培养基： • 1） 查（察）氏培养基：成分：NaNO3 2g， K2HPO4 1g，MgSO4. 7H2O 0.5g，KCL 0.5g， FeSO4.7H2O 0.01g，蔗糖30g，琼脂15~20g， 蒸馏水1000mL，pH值自然。 制法：加热溶解，分装后121℃灭菌20min。 2）马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：称取 200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸 半个小时，纱布过滤，再加10-20g葡萄糖和1720g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装后 121℃灭菌20min • 3）发酵培养基：见实验器材