Transcript Slide 1
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
آزمایش مدفوع برای مشاهده تک یاخته ها ،تخم و الرو کرم ها و برخی اشکال بالغ آنها انجام
می شود .کرم های بالغ و قطعات کرم های نواری را با چشم غیر مسلح می توان مشاهده کرد.
ولی تخم ها ،الروها ،تروفوزوئیت ها و کیست ها را تنها با میکروسکوپ می توان دید .برای
مشاهده این اجسام در مدفوع ،باید جمع آوری و آزمایش نمونه ها به درستی انجام گیرد .عالوه
Stool Examinationبر این خون مخفی ،چربی و کشت مدفوع نیز ممکن است درخواست شود.
روش های جمع آوری نمونه مدفوع :Collection of Faecal Specimens
چون تعدادی از تخم کرم ها و تک یاختگان جداره نازک و شکننده ای دارند ممکن است دیواره آنها به سرعت از
بین رفته و تغییر شکل دهند ،بنابراین نمونه مدفوع باید با روش صحیحی جمع آوری شود تا بتوان به وسیله
میکروسکوپ آنها را شناسایی کرد.
برای جمع آوری صحیح نمونه مراحل زیر ضروری است :
-1وسایل مورد نیاز را به شرح زیر در اختیار بیمار قرار می دهیم :
یک قوطی درب دار که درب آن به خوبی و محکم بسته شود. -اپلیکاتور چوبی
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله
بوسیله ناقلین
دستورالعمل جمع آوری نمونه
اگر قوطی یا لیوان پالستیکی موجود نباشد می توان از ظروف دیگری استفاده کرد ولی برای
جمع آوری و نگهداری مدفوع بکار بردن قوطی کبریت و ظروف غیر ثابت مناسب نمی باشد.
برای شناسایی دقیق عوامل بیماری زای انگلی دست کم نمونه برداری تا 3روز متوالی باید
تکرار شود .در اینگونه موارد می توان ظرف حاوی 7 -10میلی لیتر فرمالین 10درصد را
در اختیاربیمار قرار داد و به او آموخت که هر روز مقدار مشخصی از مدفوع ( 0.5 -1گرم)
را در ظرف مزبور قرار داده و پس از پایان روز سوم آن را به آزمایشگاه بیاورد .خاطر نشان
می سازد برخی ازمواد مانندآنتی اسیدها ،برخی آنتی بیوتیک ها و موادی که برای رادیوگراف
خورده می شود ،ممکن است سبب ایجاد پاسخ های کاذب شود.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
-2به بیمار تذکر داده شود که مدفوع را مستقیما به وسیله اپلیکاتور وارد ظرف کند.
-3بعضی از تک یاخته ها ،به خصوص تروفوزوئیت آمیب ها در مدت کوتاهی شکل خود را
از دست می دهند و غیر قابل تشخیص می شوند ،گرما به این تغییرات سرعت می بخشد.
بنابراین نمونه را باید هر چه زودتر (ظرف نیم ساعت) به آزمایشگاه برساند .اگر این امر
امکان پذیر نبود ،باید نمونه ها را در مواد نگهدارنده Preservativesقرار داد.
-4روی ظرف مدفوع باید عالوه بر نام و یا شماره بیمار ،زمان نمونه گیری نیز یادداشت
شود.
-5نمونه مدفوع باید به اندازه کافی ( حدود یک تخم پرنده کوچک) باشد همچنین با ادرار یا
آشغال و گرد و خاک نیز آلوده نباشد ،چون ادرار سبب تخریب ساختمان تروفوزوئیت ها می
شود و آشغال و گرد و غبار در نتیجه آزمایش تداخل ایجاد می کند.
اگر نمونه مدفوع خیلی کم باشد و یا آلوده به ادرار یا گرد و خاک باشد از پذیرفتن آن باید
خودداری شود و نمونه گیری مجدد صورت می گیرد.
-6ظرف محتوی نمونه مدفوع بهتر است در یخچال نگاهداری شود و اگر این امکان پذیر نبود
باید در خنک ترین محل آزمایشگاه قرار داده شود .از قرار دادن نمونه ها در گرما یا در
مجاورت نور خورشید موکدا پرهیز شود.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
ب) آزمایش های ماکروسکوپی مدفوع Macroscopic Stool Examination
حال مدفوع حکایت کند از سر بدن (مزاج) ،واقعیت این است که با یک نگاه ظاهری به مدفوع
،قوام و شکل آن تا حد زیادی می توان به حاالت مزاجی فرد پی برد.
سفتی مدفوع ،آبکی بودن آن ،قطعه قطعه بودن یا ممتد بودن آن ،تکه های چربی و بلغم ،شدت
رنگ و بوی مدفوع و غیره هر کدام حکایت از حال مزاجی فرد دارد.
-1به محض رسیدن نمونه های مدفوع به آزمایشگاه باید شکل ،قوام و رنگ مدفوع را بررسی
کرد و با یکی از حروف زیر قوام آن را مشخص نمود :
( آبکی ( ، )wateryشل( ، )Looseنرم( ، )Softشکل دار.)Formed
قوام مدفوع تا حدودی مشخص می کند که باید انتظار دیدن چه شکلی از انگل (کیست یا
تروفوزوئیت) را داشت.
-2بند بارور کرم های نواری ،کرم بالغ آسکاریس ،اکسیور و غیره بدون استفاده از
میکروسکوپ باید گزارش کرد.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
-3اگر در یک زمان نمونه های متعددی به آزمایشگاه رسید ،ابتدا باید نمونه های حاوی موکوس و خون
بررسی شوند ،و سپس نمونه های آبکی مورد آزمایش قرار گیرند.
اینگونه نمونه ها بیشتر حاوی تروفوزوئیت آمیب ها هستند که بعد از گرفتن نمونه توسط بیمار به سرعت
از بین می روند و باید حداکثر ظرف یک ساعت بعد از گرفتن نمونه بررسی شوند.
حال آنکه نمونه های قوام دار را می توان چندین ساعت پس از نمونه گیری مورد آزمایش قرار داد .این
زمان نباید بیش از یک شب به درازا بکشد( .جز در مواردی که نمونه در فیکساتیو باشد).
ج) روش های میکروسکوپی آزمایش Microscopic Examination
ج ) 1-آزمایش مستقیم Direct Exam
ساده ترین روش بررسی مدفوع تهیه الم مرطوب است .الم مرطوب را می توان به طور مستقیم از نمونه
مدفوع یا از نمونه های تغلیظ شده تهیه کرد.
برای تهیه الم های مرطوب ،wet mountاز سرم فیزیولوژی ،ید و متیلن بلوی بافر شده استفاده می
شود.
از الم مرطوبی که با سرم فیزیولوژی تهیه شده باشد برای بررسی اولیه نمونه ها استفاده می شود .دراین الم می توان تخم کرم ها ،الروها ،تروفوزوئیت و کیست تک یاخته ها را مشاهده کرد .بررسی گلبول
های سفید و قرمز نیز در این نوع الم امکان پذیر است.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله
ناقلین
از الم مرطوبی که با لوگل تهیه شده باشد عموما برای رنگ آمیزی واکوئل گلیکوژنی وهسته کیست ها استفاده می شود .تشخیص نوع کیست ها در این نوع الم بهتر صورت می
گیرد.
اگر در الم مرطوب که با سرم فیزیولوژی تهیه شده است تروفوزوئیت آمیب مشاهده شود یااحتمال وجود آن برود باید از متیلن بلوی بافر شده )Buffered Methylene Blue) BMB
استفاده کرد .این محلول فقط برای نمونه های تازه و فاقد مواد نگهدارنده مناسب است و برای
نمونه هایی که حاوی مواد نگهدارنده هستند (ارگانیسم ها کشته شده اند) قابل استفاده نیست.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله
ناقلین
مواد و معرف های الزم
-1الم و المل
-2ظروف دارای قطره چکان حاوی :سرم فیزیولوژی ،محلول 1درصد ایزوتونیک لوگل ،
متیلن بلوی بافر شده.
-3قلم الماس برای شماره گذاری و یا نام نویسی
-4لوپ سیمی یا اپلیکاتور چوبی
ج )1-1-تهیه الم مرطوب یا سرم فیزیولوژی Saline Wet mounts
-1با یک قلم الماس نام بیمار یا شماره بیمار و تاریخ را در یک طرف الم بنویسید.
-2یک قطره سرم فیزیولوژی روی الم بریزید.
اگر انتظار وجود تروفوزوئیت آمیب ها را دارید از سرم فیزیولوژی گرم ( ) 37cاستفاده کنید.
به وسیله یک اپلیکاتور چوبی قسمت کوچکی از نمونه را برداشته و .به آرامی آن را با سرم
فیزیولوژی مخلوط کنید.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
-4به آرامی المل را روی قطره سرم فیزیولوژی رها کنید .این کار
احتمال تشکیل حباب را کم می کند.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
این روش برای تشخیص تروفوزوئیت تک یاخته ها در مدفوع اسهالی به کار می رود .ارگانیسم
های مذکور را با درشت نمایی ×40میکروسکوپ می توان به خوبی تشخیص داد.
در نمونه های تازه مدفوع تروفوزوئیت ها متحرک هستند و این حرکت به شناسایی گونه های
مختلف تک یاخته ها کمک می کند .ساختمان کامل کیست یا تروفوزوئیت ها همچنین انکلوزیون
هایی Choromatoid bodiesنظیر گلبول قرمز و مخمرها را درون تروفوزوئیت آمیب ها و
اجسام کروماتوئید را درون کیست آمیب ها می توان با این درشت نمایی میکروسکوپ دید .از
دیگر اجزای ساختمانی تک یاخته ها می توان صفحات مکنده و شیارهای مارپیچی را نام برد .این
روش در نمونه مدفوع سفت یا قوام دار چندان کاربردی ندارد و اساسا ارزش تشخیصی آن پایین
است.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
ج )2-1-تهیه الم مرطوب با لوگل Iodine Wet mounts
مقدمات کار شبیه مراحل قبل می باشد ولی به جای سرم فیزیولوژی از لوگل استفاده می شود.
با این روش کیست های آمیب ها و تاژکداران آسان تر تشخیص داده می شوند.
در اینگونه الم ها سیتوپالسم کیست ها زرد یا قهوه ای روشن و هسته قهوه ای تیره می شود.
کروماتیدال بادی زرد روشن یا بی رنگ و چنانچه واکوئل گلیکوژنی وجود داشته باشد قهوه ای
تیره دیده خواهد شد.
برای بررسی وجود کیست آمیب ها و تاژکداران و مطالعه اجزای ساختمانی آنها از درشت
نمایی ×40استفاده می شود .ارزش این روش مشابه روش قبلی است.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
ج )3-1-تهیه الم مرطوب با متیلن بلو بافری شده
مقدمات کار شبیه مراحل قبل می باشد ولی به جای استفاده از سرم فیزیولوژی یک قطره بزرگ از
BMBروی الم بریزید .قبل از بررسی الم باید 5تا 10دقیقه صبر کنید تا رنگ به درون
تروفوزوئیت ها نفوذ کند .حداکثر تا نیم ساعت بعد از تهیه الم باید آن را بررسی کرد.
این روش مواقعی کاربرد دارد که در الم مرطوب با سرم فیزیولوژی تروفوزوئیت آمیب ها و
اجسام مشابه با تروفوزوئیت ها مشاهده شود .در این هنگام تهیه کردن یک الم مرطوب با متیلن بلو
بافری شده به تشخیص کمک می کند .در اینگونه الم ها سیتوپالسم تروفوزوئیت ها به رنگ آبی
روشن و هسته و انکلوزیون ها (گلبول های قرمز و مخمرها) به رنگ آبی تیره دیده می شود.
بعضی مواقع تروفوزوئیت ها 5 -10دقیقه بعد از رنگ آمیزی متحرک باقی می مانند ولی اغلب به
دور خود می پیچند که باید مراقب بود با کیست ها اشتباه نشوند (کیست با محلول BMBرنگ نمی
گیرد).
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
ج )2-روش کاتو kato-Katz Method
مواد و محلول های الزم جهت این روش عبارتند از : -1نوار سلوفان (به ضخامت 1/0میلی متر که به قطعات 22 × 30میلی متری بریده و
حداقل 24ساعت قبل از آزمایش در محلول ماالشیت گرین قرار داده می شود).
-2الم
-3گلیسرول
-4پودر ماالشیت گرین
-5اپلیکاتور
-6دستمال خشک کن
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
روش کار
-1ابتدا حدود 1/0گرم از نمونه مدفوع را روی الم بگذارید.
-2یک نوار سلوفان روی نمونه مدفوع قرار دهید و به کمک اپلیکاتور کمی فشار دهید.
-3به آرامی الم را فشار دهید تا نمونه مدفوع در حدفاصل الم و نوار سلوفان پخش شود .این کار
چند دقیقه وقت می گیرد و در پایان الیه نازکی از مدفوع بین الم و نوار سلوفان تشکیل می گردد.
-4به هنگام برداشتن الم دقت کنید که نوار سلوفان جدا نشود .الم را به مدت 30دقیقه در دمای 40
درجه ،یا یک ساعت در دمای آزمایشگاه قرار دهید.
-5الم را با درشت نمایی پایین میکروسکوپ ( )×10بررسی کنید ،و از درشت نمایی باال ()×40
برای اثبات تشخیص استفاده نمایید.
تذکر :اگر نمونه مدفوع آبکی بود ،ابتدا به وسیله سانتریفیوژ نمونه را تغلیظ نموده و از رسوب
حاصل روی الم بگذارید سپس کمی صبر کنید تا در هوای آزمایشگاه رسوب روی الم قدری خشک
شود ،و پس از آن مراحل آزمایش را انجام دهید.
این روش در عین سادگی تا حد زیادی قابل اعتماد است و برای تخم انگل های بزرگ و الروها
توصیه می شود ولی برای تک یاختگان ارزش تشخیصی ندارد.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
ج )3-روش های شناورسازیFloatation Methods
ج )1-3-روش فلوتاسیون با آب نمک اشباع Willis Method
مواد و محلول های الزم جهت این روش عبارتند از : -1لوله آزمایش معمولی 10میلی لیتری
-2الم و المل
-3محلول آب نمک اشباع
-4اپلیکاتور چوبی
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
روش کار:
-1تا نصف لوله آزمایش از محلول اشباع نمک بریزید.
-2حدود 0.5گرم از مدفوع را بوسیله اپلیکاتور به لوله منتقل کرده و مخلوط کنید.
-3لوله را از محلول پر کنید و ذرات درشت مدفوعی را که بالفاصله باال می آیند ازلوله
خارج کنید.
-4مجددا از محلول اضافه کنید تا یک سطح محدب از محلول ،در باالی لوله ایجاد شود.
-5یک المل 22×22روی دهانه لوله (سطح محدب محلول) طوری قرار دهید که حباب ،زیر
المل تشکیل نشود.
-6بدون اینکه لوله حرکتی داشته باشد 15 ،دقیقه صبر کنید و سپس المل را برداشته روی الم
بگذارید و زیر میکروسکوپ مشاهده کنید.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
تذکر :1اگر به جای نمک طعام از مخلوط مساوی سولفات منیزیم و نمک طعام استفاده کنید،
سولفات منیزیم از تشکیل بلور روی الم جلوگیری می کند.
تذکر :2اگر مدت زمان شناورسازی کمتر از 15دقیقه باشد ممکن است عناصر انگلی باال
نیامده و جواب منفی کاذب بدست آید و .ضمنا مدت زمان طوالنی نیز منجر به ته نشین شدن
مجدد بعضی از تخم انگل ها به خصوص انواع تخم های دریچه دار خواهد شد .این روش
ارزان و تا حدودی قابل اعتماد است و با آن می توان تخم انگل های سبک و کیست تک
یاختگان را مشاهده کرد.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
ج )2-3-روش فلوتاسیون با سولفات روی Ash Method
مواد و محلول های الزم جهت این روش عبارتند از : -1لوله معمولی 10میلی لیتری
-2الم و المل
-3لوپ که حلقه سیمی آن قطر 5-7میلی متر داشته و قسمت حلقه آن عمود بر خود سیم است.
-4محلول سولفات روی
-5اپلیکاتور چوبی
-6تنزیب
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
- روش کار :
-1 ابتدا تا نصف لوله محلول سولفات روی بریزید.
-2حدود یک گرم مدفوع در لوله ریخته و به کمک اپلیکاتور سوسپانسیون تهیه کنید.
-3سوسپانسیون فوق را از یک تنزیب دو الیه بگذرانید و محلول صاف شده را به لوله برگردانید.
-4از محلول سولفات روی به لوله اضافه کنید تا سطح محلول به 2-3میلی متری سطح دهانه لوله
برسد.
-5لوله را در سانتریفیوژ گذاشته و با حدود 3000دور در دقیقه به مدت یک دقیقه سانتریفیوژ
کنید.
-6یک قطره لوگل روی الم بگذارید.
-7پس از اینکه زمان سانتریفیوژ تمام شد در حالیکه هنوز لوله در داخل سانتریفیوژ است با استفاده
از لوپ سطح از محلول برداشت کرده روی الم بگذارید.
-8المل را روی الم گذاشته و با میکروسکوپ مشاهده کنید.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله
بوسیله ناقلین
ناقلین بیماریهای منتقله
تحقیقات
دکتر میترا صالحی -مرکز
بوسیله
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
تذکر :تک یاخته ها و تخم کرم هایی که پوسته نازک دارند اگر بیش از چند دقیقه در سولفات
روی بمانند چروکیده می شوند .بنابراین هر چه سریع تر باید الم تهیه شده مورد بررسی قرار
گیرد .این روش بیشتر برای تخم انگل ها و کوکسیدیاها به کارمی رود منتهی روش نسبتا
گرانی است و برای تک یاختگانی مثل آمیب و ژیاردیا مناسب نیست.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
ج )3-3-روش فلوتاسیون با ساکاروز Sheathers Sugar floatation
مواد و محلول های الزم جهت این روش عبارتند از: -1لوله معمولی 10میلی لیتری
-2الم و المل
-3لوپ که حلقه سیمی آن قطر 5-7میلی متر داشته و قسمت حلقه آن عمود بر خود سیم است.
-4محلول شیتر
-5اپلیکاتور چوبی
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
روش کار :
-1ابتدا تا نصف لوله محلول شیتر بریزید.
-2حدود 1گرم از مدفوع قوام دار (یا 2میلی لیتر از مدفوع آبکی) به محلول اضافه کند.
-3به کمک اپلیکاتور محلول را به هم بزنید.
-4از محلول شیتر به لوله اضافه کنید تا سطح محلول به چند میلی متری سطح دهانه لوله
برسد.
-5لوله را با دور 3000به مدت 5دقیقه سانتریفیوژ کنید و بدون هیچگونه دخالتی اجازه دهید
که سانتریفیوژ بایستد.
-6با استفاده از لوپ (در حالی که لوله در داخل سانتریفیوژ است) از سطح محلول برداشت
کرده و روی الم بگذارید.
-7روی الم را به وسیله المل پوشانده و با میکروسکوپ مشاهده کنید.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
توجه :به هنگام برداشت نمونه باید دقت کرد لوپ فقط با سطح محلول تماس پیدا کند .این
روش جهت تشخیص کریپتوسپوریدیوم و سایر کوکسیدیاها مناسب به نظر می رسد لیکن برای
تشخیص سایر تک یاخته های روده ای توصیه نمی شود.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
ج )4-روش رسوب گلیسیرین Glycerin Sedimentation
این روش یک متد رسوبی ساده است که جهت تخم انگل های سنگین توصیه می شود.
مقداری مدفوع را در آب حاوی گلیسیرین 0.5درصد ریخته ،خوب مخلوط کنید و از
4الیه تنزیب عبور دهید .محلول صاف شده را به مدت 40تا 60دقیقه بی حرکت
بگذارید تا تخم انگل ها ته نشین شود.
سپس مایع رویی را دور ریخته مجددا بر روی آن محلول آب گلیسیرینه اضافه کنید و
مدتی صبر کنید تا عمل ته نشینی تکرار شود .جهت صرفه جویی در وقت از
سانتریفیوژ با دور 2000به مدت 1-2دقیقه استفاده کنید.
معموال پس از 2-3بار تکرار مایع کامال زالل می شود .آن را خالی کرده و رسوب
را مورد مطالعه میکروسکوپی قرار دهید .این روش بسیار ساده و ارزان است و
روش نسبتا مناسبی است .در این روش می توان به جای آب از سرم فیزیولوژی
استفاده کرد.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
ج )5-روش رسوبی فرمل -اتر Formalin- Ether method
روش کار 10 -1میلی لیتر فرمالین را به حدود 1گرم مدفوع اضافه کرده و با اپلیکاتور چوبی مخلوط
نمایید تا یک سوسپانسیون نسبتا کدر بدست آید.
-2تنزیب چهار الیه را درون یک قیف قرار دهید و قیف را درون لوله سانتریفیوژ بگذارید.
-3سوسپانسیون مدفوع را از تنزیب عبور دهید و 7میلی لیتر از این سوسپانسیون را صاف
کنید.
3 -4میلی لیتر اتر یا اتیل استات را به لوله سانتریفیوژ اضافه کرده ،با درب پالستیکی آن را
بپوشانید.
-5لوله را به شدت تکان داده تا فرمل و اتر به خوبی در هم حل شوند.
-6در لوله را به آهستگی بردارید تا گاز حاصله خارج شود ( این عمل را چند بار تکرار کنید)
-7لوله را 1دقیقه با دور 2000سانتریفیوژ کنید ،پس از سانتریفیوژ 4الیه در لوله تشکیل
می شود الیه اول اتر و چربی ،الیه دوم مواد زائد مدفوع ،الیه سوم فرمل و الیه چهارم مواد
رسوبی است.
-8به وسیله یک اپلیکاتور چوبی الیه دوم را از جدار داخلی لوله جدا کرده ،سپس مواد رویی
را با واژگون کردن سریع لوله خالی کنید.
-9با پیپت پاستور و قطره چکان یک قطره از رسوب روی الم بریزید و المل را به آرامی
روی آن قرار دهید.
-10با عدسی های ×10و ×40میکروسکوپ ،الم را به طور منظم بررسی کنید.
این روش دارای قدرت تغلیظی باال ،معتبر ،و با ارزش است و برای شناسایی اکثر تک
یاختگان و تخم انگل ها به کار می رود .از معایب آن گرانی و خطر کار با اتر است.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
ج )6-روش رسوبی فرمالین -دترجنت Formalin Detergent method
مواد و محلول های الزم جهت این روش عبارتند از : -1اپلیکاتور چوبی -2پیپتور -3لوله آزمایش -4لوله های مدرج سانتریفیوژ -5الم و المل
-6قیف -7تنزیب -8پیپت پاستور -9محلول فرمل -دترجنت
روش کار : -1در لوله آزمایش معمولی حدود 10میلی متر محلول فرمل -دترجنت بریزید.
-2حدود نیم گرم مدفوع به محلول فرمل دترجنت اضافه کنید و خوب هم بزنید.
-3تنزیب دو الیه را در یک قیف قرار داده و مخلوط فوق را در یک لوله سانتریفیوژ صاف
کنید.
-4با محلول فرمل -دترجنت تا باالی لوله سانتریفیوژ را پر کنید.
-5درپوش پالستیکی را بر روی لوله قرار داده و به مدت 30ثانیه به شدت تکان دهید.
-6لوله فوق را به مدت 12-24ساعت بدون حرکت در آزمایشگاه قرار دهید.
-7بعد از مدت فوق محتویات لوله را خالی نمایید ،در این حالت یکی دو قطره مایع باقیمانده
درکناره های لوله ،ودر ته آن به همراه رسوب جمع می شود این مایع را با رسوب مخلوط
کرده و با پیپت پاستور یا مستقیما از ته لوله برداشت نموده و یک نمونه مرطوب جهت آزمایش
لوله آماده کنید.
-8با میکروسکوپ و عدسی ( )×40به بررسی الم تهیه شده بپردازید.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
تذکر :این روش در عین ارزانی روش تغلیظی مناسبی برای اکثر تخم انگل ها و تک یاختگان
می باشد ،و می توان آن را به عنوان روش برتر به آزمایشگاه های تشخیص طبی کشور
توصیه نمود.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
ج )7-روش تلمن Thelmen Method
این روش برای تشخیص تخم انگل هایی به کار می رود که در مجاری صفراوی کبد زندگی
می کنند .تکنیک آن شباهت به فرمل -اتر دارد ولی به جای فرمل از اسید کلریدریک 15درصد
استفاده می شود .این اسید باعث می شود چنانچه امالح صفراوی و مواد آلبومینی دور تخم ها
را گرفته باشد طی 10دقیقه امالح را از بین ببرد.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
نکته :به آزمایشگاه های تشخیص طبی کشور توصیه می شود از آنجایی که معموال تعداد انگل
در نمونه مدفوع کم می باشد از انجام روش های تشخیصی غیر تغلیظی پرهیز نمایید .و یا
اینکه از روش های مستقیم به عنوان قدم اول غربالگری و یا به هنگام فوریت ها و آن هم فقط
در موارد نمونه های اسهالی و آبکی استفاده نمایید .غیر از موارد استثناء فوق ،باید از روش
های تغلیظی مطمئن استفاده کرد.
د) روش های رنگ آمیزی مدفوع
در کارهای روزمره آزمایشگاهی رنگ آمیزی دائمی از روش های متداول نیست و کاربرد آن
عمدتا درموارد زیر می باشد :
اطمینان از تشخیص صحیح تروفوزوئیت و کیست تک یاخته ها تشخیص اووسیست های کریپتوسپوریدیوم نگهداری طوالنی مدت الم در آزمایشگاه -ارسال الم به آزمایشگاه مرجع
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
روش رنگ آمیزی تری کروم Trichrome Stain technique
روش رنگ آمیزی تری کروم ،روشی ارزشمند برای رنگ آمیزی نمونه های مدفوع و
همچنین نمونه های فیکس شده توسط پلی وینیل الکل ( )P.V. Aاست .برای بدست آمدن نتایج
قابل اطمینان باید مراقب تاریخ انقضاء مواد بود.
ظروف حاوی مواد رنگ آمیزی را عالمت گذاری کرده و به ترتیب زیر در یک ردیفبچینید.
-1فیکساتیو شاودین
-2محلول ید -الکل
-3اتانول 70درصد
-4اتانول 70درصد
-5محلول رنگ تری کروم
-6محلول رنگ بر الکل – اسید استیک
7اتانول 95درصد
-8گزیلن – کربول یا اتانول خالص (الکل مطلق)
-9گزیلن
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
روش کار:
-1نام یا شماره بیمه و تاریخ را روی الم حک نمایید.
-2با باگت چوبی مقداری از مدفوع را برداشته با سرم فیزیولوژی یکنواخت تهیه کنید
(برای چسبندگی محلول چند قطره سرم نرمال اسب یا آلبومین به سوسپانسیون اضافه
کنید) .سپس از این محلول گسترش مناسب تهیه کنید .این گسترش باید از نظر
ضخامت به گونه ای تهیه شود که حروف چاپی ریز از روی الم دیده شود ولی آن قدر
واضح نباشد که خوانده شود .زیرا گسترش های ضخیم به خوبی رنگ نمی گیرند و
در مشاهده میکروسکوپی اشکال ایجاد می شود .از طرف دیگر در گسترش بسیار
نازک نیز عناصر کافی جهت آزمایش در زیر میکروسکوپ در دسترس نخواهد بود.
نمونه تهیه شده بالفاصله قبل از خشک شدن باید به فیکساتیو منتقل شود.
اسمیر نباید از زمان تهیه تا زمان مونته کردن خشک گردد.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
روش هماتوکسیلین (هایدن هاین)Iron-Hematoxylin
این رنگ آمیزی جهت تک یاخته های روده ای بخصوص مژه داران
بسیار مناسب است.
روش ذیل نلسون اصالح شده()Modified Ziehl-Neelsen
در این روش رنگ آمیزی اووسیت های کریپتوسپوریدیوم بصورت
اجسام گرد وهاللی وبه رنگ صورتی –قرمز در یک زمینه سبز کم
رنگ دیده می شوند.
رنگ آمیزی کارمن آلوم
این رنگ آمیزی به منظور رنگ کردن کرم ها به کار می رود.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
آزمایش مواد مدفوعی اطراف مقعد Perianal-Fecal-Debris exam
این روش معموال جهت تشخیص اکسیور یا کرم سنجاقی استفاده می شود.
از آنجایی که ابتال یک کودک درخانواده موجب ابتالی سایر اعضای خانواده
می شود ،باید توجه داشت در صورت مثبت بودن آزمایش یک کودک سایر
اعضاء خانواده به خصوص کودکان نیز باید مورد آزمایش قرار گیرند.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
برای آزمایش مواد مدفوعی اطراف مقعد از دو روش استفاده می شود :
)1روش استفاده از سواب مقعدی Anal Swab technique
-1سواب را با ناحیه اطراف مقعد تماس دهید.
-2سپس آن را داخل لوله آزمایش قرار دهید و روی سواب سرم فیزیولوژی بریزید تا حدی که
سر سواب را کامال بپوشانید (حدود 5میلی لیتر).
-3پس از 4-5دقیقه سواب را از سرم فیزیولوژی خارج کرده و با جداره ی لوله تماس دهید
تا کامال سرم فیزیولوژی از آن خارج شود.
-4سواب را دور بیندازید.
-5محلول فوق را به مدت 1دقیقه سانتریفیوژ کنید تا تغلیظ شود.
-6به وسیله پیپت مایع رویی را طوری خارج کنید تا رسوب جزئی بدست آمده به هم نخورد.
-7با یک پیپت پاستور رسوب را روی الم منتقل کرده و با عدسی ×10میکروسکوپ به
جستجوی تخم اکسیور بپردازید.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
ب) استفاده از نوارچسب یا تست گراهام Scotch-tape technique
-1به هنگام صبح قبل از تخلیه مدفوع چند سانتی متر نوارچسب را بریده و آن را روی مقعد
بیمار قرار داده به طوریکه چین و چروک اطراف مقعد کامال باز باشد.
-2با ته یک مداد یا خودکار کمی چسب را فشار داده تا مقداری داخل شود.
-3پس از کمی تأمل آن را بردارید (حدود 15-30ثانیه)
-4نوارچسب را مستقیم روی الم بچسبانید یا ابتدا روی الم یک قطره تولوئن یا گلیسیرین
ریخته سپس نوارچسب را به گونه ای به الم بچسبانید که کامال صاف و بدون تاخوردگی باشد.
-5با عدسی ×10میکروسکوپ به جستجوی تخم اکسیور بپردازید.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
روش های کمی مدفوع Stool Quantitative methods
اصوال این روش ها جهت تعیین درجه و شدت آلودگی می باشد .ولی در عین حال در تفسیر و
تخمین باید با احتیاط عمل کرد .در این جا دو روش بازگو می شود :
روش بیور Beaver
به روش آزمایش مستقیم یک الم برداشته ،یک قطره سرم فیزیولوژی روی آن بریزید .سپس به
مقدار 1میلی گرم مدفوع را روی آن گذاشته و مخلوط کنید و بر روی آن المل نهاده و در زیر
میکروسکوپ تمام الم را بررسی کرده ،تخم انگل ها را بشمارید .شمارش شده را در 1000ضرب
کنید تا تعداد تخم در یک گرم مشخص شود.
در حالت عادی معموال هر انسان بین 200-300گرم مدفوع ،دفع می کند .بدین ترتیب تعداد تخم
دفع شده در یک روز محاسبه می شود و با توجه به اطالعات قبلی ما از نحوه تخمگذاری انگل ها
می توان تعداد کرم بالغ ماده را در روده انسان تخمین زد.
تعداد تخم دفع شده در یک روز= ×1000 × 250تعداد تخم شمارش شده در یک میلی گرم
مثال آسکاریس در یک روز بین 100-200هزار و کرم های قالبدار 10-12هزار و تریکوسفال
10هزار تخم می گذارد که با تقسیم تعداد تخم دفع شده بر این اعداد ،تعداد انگل محاسبه می شود.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
-2روش استولstoll
درارلن مایر مخصوص استول که در قسمت دهانه دو خط دارد تا خط اول به مقدار 54میلی
لیتر سود 4/0درصد ریخته و سپس به آن مدفوع اضافه کنید تا به خط دوم که در روی آن رقم
60میلی لیتر نوشته است برسد( .این مقدار مدفوع 4گرم است) این مخلوط را به کمک پرل
های شیشه ای آنقدر تکان دهید تا یکنواخت شود .سپس یک شب آن را گذاشته تا سود مواد جامد
را در خود حل کند .صبح روز بعد ابتدا ارلن را تکان داده بعد با پیپت مخصوص ( 0.075یا
)0.15از قسمت وسط مایع برداشت کنید ،روی الم گذاشته و در زیر میکروسکوپ تخم انگل
های موجود را بشمارید .چنانچه از پیپت 0.075استفاده کرده باشید تعداد تخم را در 200
ضرب کنید تا مقدار آن در یک گرم بدست آید .و اگر از پیپت 0.15استفاده کرده باشید تعداد را
در 100ضرب کنید.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
ضریب دیگری نیز در نظر گرفته می شود و آن قوام و شکل مدفوع است .چنانچه مدفوع سفت
و شکل دار باشد تعداد را در 1ضرب کنید و اگر مدفوع نرم و خمیری باشد تعداد را در 2
ضرب کنید .و اگر مدفوع شل باشد تعداد را در 3ضرب کنید و باالخره اگر مدفوع اسهالی و
آبکی باشد تعداد را در 4ضرب کنید.
ضریب دیگر سن بیمار می باشد که زیاد معمول نیست.
این روش دقیق تر ،قابل اطمینان تر و استاندارد است.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
کشت مدفوع Hatch technique
)1روش کشت مدفوع برای تشخیص الروها
چنانچه در مدفوع شخص مشکوکی نتوانید تخم کرم های قالبدار را تشخیص دهید و یا شباهت
تخم کرم های قالبدار و تریکواسترانژیلوس شما را در تشخیص گمراه کند ،روش کشت مدفوع
را به کار ببرید تا تخم تبدیل به الرو شده و وجود افتراق مشخص شود.
روش هارادا موری Harada-mori
در یک ظرف گیالسی شکل حدود 3میلی لیتر آب بریزید.
یک کاغذ صافی از باال در آن وارد کرده تا به آب برسد و رطوبت بگیرد .سپس یک الیه
مدفوع در سراسر کاغذ پخش کنید و در ظرف را سرپوش گذاشته ،مدت 7-8روز درحرارت
آزمایشگاه ( 24-28درجه سانتی گراد) قرار دهید .از روز دوم و سوم ته ظرف را جستجو
کنید.
الروها در این مدت آزاد شده ،به ته ظرف آمده و در آب ته ظرف بطور فعال و زنده وجود
دارند که تشخیص آنها بسیار ساده است.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
ب) کشت تک یاخته های روده ای
یکی از روش های تشخیص تک یاخته های روده ای کشت آنها است .محیط مناسب ،سرم
منعقده اسب می باشد که در لوله آزمایش بلند بطور مورب تهیه شده است.
در هنگام کشت مقداری محلول استریل رینگر ،مقداری نشاسته برنج و کمی استرپتومایسین
جهت جلوگیری از رشد بیش از حد باکتری ها به محیط اضافه کنید.
کمی مدفوع را در شرایط استریل (مقابل شعله) به وسیله میله پالتین برداشت کرده و داخل مایع
لوله کشت دهید.
سپس درلوله را با پنبه محکم مسدود نمایید و به مدت 24-48ساعت در اتوکالو 37درجه
سانتیگراد قرار دهید .پس از انقضای مدت از ته لوله برداشت کرده بین الم و المل گذاشته و
زیر میکروسکوپ به جستجوی فرم فعال (تروفوزوئیت) تک یاخته بپردازید
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
آزمایش شیمیایی جهت جستجوی خون مخفی در مدفوع Occult-Blood
آزمایش OBبطور معمول توسط پزشکان آزمایشگاه درخواست می شود .مشاهده OBدر
مدفوع کمک شایانی در تشخیص زخم های لوله گوارش و کانسر کولون می نماید.
اصوال برای انجام آزمایش OBجهت اجتناب از جواب کاذب باید به بیمار از 3روز قبل رژیم
غذایی فاقد گوشت سبزیجات( ،از نظر کلروفیل) توصیه شود .جهت انجام آزمایش OBتست
های مختلفی وجود دارد :
تست بنزیدین Banzidin Testمکانیسم عمل تست بنزیدین بدین صورت است که آب اکسیژنه تحت تاثیر
پراکسیدازها ،اکسیژن خود را از دست می دهد .این اکسیژن بنزیدین را اکسید نموده و
آن را تبدیل به ماده سبزرنگی می نماید.
-2تست گایاک Guiac Test
از محلول 2درصد گایاک استفاده می شود که به صورت قرص های تجاری دربازار
موجود می باشد.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
ارسال نمونه های مدفوع به آزمایشگاه مرجع Sending Specimens to Reference lab
گاهی اوقات الزم است نمونه های مدفوع را به آزمایشگاه دیگر و یا آزمایشگاه مرجع ارسال
کرد .در این هنگام استفاده از یک ماده نگهدارنده یا محافظت کننده ضروری می باشد تا انگل
های درون نمونه در وضعیت خوبی نگهداری شوند و همچنان قابل تشخیص بمانند .برای آن
منظور معموال از دو ماده محافظت کننده استفاده می شود:
-1فرمالین 10درصد :این ماده تخم و الرو کرم ها ،همچنین کیست تک یاخته ها را به همان
صورت اول برای آزمایش مستقیم حفظ می کند.
-2فیکساتیو : P.V.Aاین ماده تروفوزوئیت و کیست تک یاخته ها را به گونه ای حفظ می کند
که بتوان آنها را نگهداری نمود.
-
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
نگهداری نمونه ها
-1روی دو ظرف مخصوص حمل نمونه ،نام و یا شماره بیمار را بنویسید داخل یکی از آنها فرمالین 10درصد
و داخل دیگری P.V.Aبریزید و هر یک را عالمت گذاری کنید تا مشخص شود کدامیک حاوی فرمالین
10درصد و .کدامیک P.V.Aاست.
-2پس از به هم زدن مدفوع مقداری از آن را با اپلیکاتور برداشته و به ظرف حاوی فرمالین 10درصد منتقل
کنید .سپس آن را به خوبی با فرمالین 10درصد مخلوط کنید به طوری که سوسپانسیون یکنواختی تهیه شود
(مدفوع برداشته شده به اندازه ای باشد که سوسپانسیون حاصله تا ظرف را پرکند).
-3با اپلیکاتور دیگری قسمتی از مدفوع را برداشته و به ظرف حاوی P.V.Aمنتقل کنید و مثل مرحله قبل
عمل کنید.
-4در ظرف ها را محکم بسته و یک تکه نوارچسب دور هر ظرف بپیچید تا از هر گونه نشتی جلوگیری کند.
-5ظرف ها را با دقت درون جعبه ارسالی قرار داده و به محل مورد نظر بفرستید .بهتر است دور ظرف ها
را با پنبه یا روزنامه بپوشانید تا در اثر ریختن احتمالی هر کدام ،بقیه ویال ها و یا جعبه آلوده نشود.
توجه داشته باشید که اطالعات ضروری مثل نام یا شماره بیمار ،تاریخ ارسال و ارگانیسم هایی را که در
بررسی نمونه ها یافته اید ،همراه نمونه ها ارسال شود.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
سیل کردن Seal
گاهی اوقات الزم است نمونه های تازه رنگ نشده برای مدتی نگهداری شود و یا به آزمایشگاه
مرجع یا آزمایشگاه دیگری فرستاده شود.
بدین منظور مخلوطی از پارافین جامد و وازلین به طور مساوی تهیه کنید ( درصورت در
دسترس نبودن پارافین از موم یا شمع و یا رنگ غلیظ نیز می توانید استفاده کنید) .وسیله ای
فلزی که دارای لبه های تیزی به ابعاد مختلف المل می باشد و به آن ابزار سیل می گویند را
روی چراغ گرم کنید و بعد آن را در پارافین و یا موم قرار دهید .پارافین ذوب شده و به لبه
های ابزار سیل می چسبد .سپس با این وسیله دور المل روی الم را بگیرید ،به طوری که هیچ
منفذی باقی نماند .باید دقت نمود که زیر المل حباب هوا نباشد .این عمل باعث می شود که
محلول زیر المل تبخیر نشود و تخم انگل یا کیست چند روز سالم بماند .بهتر است نمونه های
سیل شده را در اطاقک مرطوب (بوات دوپتری همراه با پنبه مرطوب) قرار دهید.
باید توجه داشت الیه مومی ضخیم نباشد همچنین روی المل را اشغال نکند .با تکرار این عمل
پس از چند بار می توان الم هایی مناسب بطور موقت تهیه کرد.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
کنترل کیفی آزمایش مدفوع Quality Control for Faecal Exam
جهت حصول اطمینان از نتایج دقیق و قابل اعتماد ،در مورد تشخیص عفونت های انگلی ،باید
اقدام های مربوط به کنترل کیفی انجام پذیرد.
کنترل کیفی تمامی مراحل جمع آوری نمونه ها ،آماده سازی معرف ها ،روش انجام آزمایش و
بررسی نهایی میکروسکوپی الم را به شرح زیر شامل می شود:
چنانچه نمونه های مدفوع به درستی جمع آوری نشده و مراقبت های الزم قبل از آزمایش
درمورد آنها به عمل نیاید تشخیص دقیق عوامل ایجاد کننده الودگی به خوبی امکان پذیر نیست.
این مطلب بخصوص در مورد میکروارگانیسم های کوچکتر مانند تک یاخته ها بیشتر صدق
می کند.
ساختمان تروفوزوئیت تک یاخته ها 1-2ساعت پس از خروج از بدن تخریب شده و تغییرات
ظاهری آنها سبب اشتباه در تشخیص می شود.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
کیست تک یاخته ها نیز پس از گذشتن ساعت ها و یا یک شب (بخصوص در درجه حرارت باال)
از بین می رود و یا تغییر شکل می دهد.
تخم و الرو کرم ها نسبت به تک یاخته ها مقاوم ترند ولی گذشتن زمان طوالنی از نمونه گیری
باعث تغییراتی در آنها می شود که ممکن است در تشخیص اثر بگذارد.
به عنوان مثال تخم کرم های قالبدار الروه شده و تخم های آسکاریس نیز ممکن است مولتی
سلوالر شوند .عالوه بر این ممکن است ساختمان الوها تخریب شده و تشخیص گونه آنها را غیر
ممکن سازد.
به منظور حصول اطمینان از نحوه صحیح نمونه گیری توجه به نکات زیر ضروری می باشد :
-1از ظروف خشک و تمیز برای جمع آوری مدفوع استفاده کنید زیرا گرد و خاک سبب تداخل
در آزمایش شده و ممکن است مواد موجود در خاک باعث اشکال در تشخیص شوند .ادرار و آب
نیز در صورت وجود در ظرف نمونه گیری سبب متالشی شدن تروفوزوئیت ها می شود.
-2به بیمار تذکر دهید به محض نمونه گیری آن را به آزمایشگاه بیاورد (جز مواردی که نمونه
در فیکساتیو جمع آوری گردد) تا از نابودی تروفوزوئیت تک یاخته و تغیرات مرفولوژیک تخم
کرم ها جلوگیری شود .همچنین به نام بیمار و تاریخ نمونه گیری توجه داشته باشید.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
-3از پذیرش نمونه های کهنه و یا آلوده به گرد و خاک ،آب و ادرار خودداری نموده و
ازبیمار بخواهید دوباره نمونه گیری کند.
-4اگر آزمایش سریع نمونه امکان پذیر نبود ،آن را در یخچال 4-5درجه سانتیگراد و یا در
سایه و خنک ترین محل آزمایشگاه قرار دهید .دقت کنید آنها را در آفتاب نگذارید.
ب) آماده سازی معرف ها
معرف ها باید دقیقا براساس دستورالعمل های ذکر شده ساخته شوند.
محتویات ،مقدار و یا روش تهیه آنها را به هیچ وجه تغییر ندهید ،همچنین ذخیره کردن آنها نیز
باید طبق دستورالعمل ساخت باشد.
محلول هایی مثل فرمالین ،سرم فیزیولوژی ،فیکساتیوها و محلول های الکلی (اگر تبخیر
نشوند) چنانچه به درستی در ظرف های دردار و دور از نور مستقیم خورشید نگهداری شوند،
برای مدت های طوالنی قابل استفاده می باشند.
سایر معرف ها ممکن است فقط برای مدت کوتاهی پایدار بمانند و اگر تاریخ مصرف آنها
گذشته باشد ،نباید از آنها استفاده کرد.
تاریخ مصرف هر یک از محلول ها در دستورالعمل ساخت آنها ذکر شده است.
توجه داشته باشید که روی تمام محلول ها تاریخ ساخت آنها را بنویسید و محلول های تاریخ
گذشته را دور بریزید.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
ج) روش آزمایش
برای بدست آوردن بهترین نتایج با دقت کار کنید .همچنین باید مطمئن باشید که از مناسب ترین
روش ها برای بررسی نمونه استفاده کرده اید.
روش های مستقیم
-1در روش مستقیم از مناسب بودن غلظت گسترش اطمینان حاصل کنید .گسترش مناسب
دارای غلظتی است که حروف چاپی ریز از روی آن مشخص باشد ولی قادر به خواندن آن
نباشید.
-2از محلول های لوگل تازه که هر 10-14روز یکبار تهیه شده اند استفاده کنید .زیرا کیست
ها با محلول های لوگل کهنه به خوبی رنگ نمی گیرند.
همچنین غلظت لوگل نیز باید مناسب باشد .اگر محلول لوگل خیلی غلیظ باشد ارگانیسم ها به
خوبی دیده نمی شوند و برعکس چنانچه خیلی رقیق باشد کیست ها به خوبی رنگ نخواهند
گرفت.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
ج )2-روش های تغلیظی
-1سرعت و زمان سانتریفیوژ صحیح باشد.
-2غلظت مناسبی داشته باشد.
-3لوله محتوی مواد تغلیظ شده را تا زمان پایان آزمایش نگه دارید تا اگر نیاز به گسترش
دیگری داشتید با مشکل مواجه نشوید.
د) روش رنگ آمیزی
-1اگر مدفوع دارای مخاط است از قسمت های نرم و مخاط دار آن برای گسترش و
رنگ آمیزی استفاده کنید.
-2محلول های رنگ آمیزی رادور از نور مستقیم آفتاب نگهدارید.
-3در ظروف رنگ آمیزی غیر از زمانی که الم ها را داخل یا خارج می کنید باید
بسته باشد .در غیر این صورت ممکن است محلول تبخیر شده و یا مواد زائد داخل
ظروف شود و به الم ها بچسبد.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
کوپرو آنتی بادی ها Copro Antibodies
آنتی بادی های موجود در ترشحات روده یا مدفوع را کوپرو آنتی بادی می نامند.
تست های ایمنولوژیک جهت اندازه گیری کوپروآنتی بادی ها
از روش های مختلفی جهت ارزیابی کوپروآنتی بادی ها استفاده شده است .تست فیکساسیون
کمپلمان ( )CFTاز جمله اولین روش هایی است که جهت اندازه گیری کوپروآنتی بادی ها به
کار رفته است .اما از آنجایی که IgAترشحی ندرتا قادر به تثبیت کمپلمان است ،تست CFTدر
این مورد کاربرد مفیدی ندارد.
روش ELISAدر بررسی کوپروآنتی بادی ها بسیار حساس و اختصاصی است و هیچگونه
واکنش مشترکی با سایر انگل های روده ای ندارد.
از روش های IHAو IFAنیز در بررسی کوپرو آنتی بادی ها استفاده می شود.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
آزمایش های ادرار و نمونه های واژینال ()Vaginal & Urethral examination
نمونه های ادرار ()Urine Specimens
نمونه های ادرار معموال برای جستجوی تخم شیستوزوماهماتوبیوم مورد بررسی قرار می
گیرند .همچنین تروفوزوئیت تریکوموناس واژینالیس نیزممکن است در ادرار دیده شود .گاهی
اوقات دررسوب ادرار شیری رنگ بیماران ،میکروفیالریاهای ووشرریا بانکروفتی و
اونکوسرکوس و لولوس مشاهده می شود.
اولین عالمت غیرمستقیم یک عفونت شیستوزومیایی درمناطق آندمیک هماچوری و پروتئینوری
می باشد که با استفاده از تست های نواری قابل تشخیص است .هماچوری ماکروسکوپی بر یک
عفونت شدید داللت دارد.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله
بوسیله ناقلین
الف) روش جمع آوری نمونه ادرار برای تشخیص بیالرزیوز
از آنجایی که تعداد تخم های دفع شده شیستوزما هماتوبیوم از ادرار در طول روز متغیر می
باشد و بیشترین میزان دفع تخم بین ساعات 10-14میباشد ،لذا نمونه باید این ساعات از بیمار
گرفته شود .این نمونه حداقل باید 10میلی لیتر حجم داشته باشد و بهتر است از قسمت انتهایی
ادرار باشد.
همچنین می توان ادرار 24ساعته را جمع آوری کرد (در این موارد تمام نمونه برای وجود
تخم بررسی شود) .برای جمع آوری ادرار 24ساعته به بیمار تذکر دهید نمونه ادرار را
دریک ظرف دهان گشاد تمیز و بزرگ جمع آوری کند .این نمونه را بالفاصله آزمایش کنید.
اگر این امکان وجود نداشت به ازاء هر میلی لیتر ادرار 1 ،میلی لیتر فرمالین رقیق نشده
(محلول %37فرمالدئید) به ظرف اضافه کنید .فرمالین به عنوان یک ماده نگهدارنده ،سبب
حفظ و نگهداری تخم انگل میشود.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله
بوسیله ناقلین
روش رسوبی ( )sedimentation Methodبرای نمونه 24ساعته
وسایل مورد نیاز جهت این روش عبارتند از : -1سانتریفیوژ در دار
-2الم و امل
-3فالسک مخروطی برای جمع آوری ادرار
-4پیپت پاستور دارای قطره چکان
روش کار: -1نمونه ادرار را خوب تکان داده و داخل فالسک مخروطی شکل ادرار بریزید.
-2فالسک را مدت 1ساعت حرکت ندهید تا رسوب در ته آن تشکیل شود .سپس محلول رویی
را دور ریخته و رسوب موجود را به لوله سانتریفیوژ منتقل کرده و به مدت 2دقیقه با دور
2000سانتریفیوژ کنید.
-3رسوب را با پیپت پاستور به روی الم منتقل کرده و پس از قرار دادن المل روی آن با
درشت نمایی پایین میکروسکوپ بررسی کنید.
توجه داشته باشید زمان و سرعت سانتریفیوژ از میزان ذکر شده بیشتر نباشد چون سبب پاره
شدن تخم ها و آزاد شدن میراسیدیوم خواهد شد.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
نمونه های واژینال و اورترال ()Vaginal & Urethral Material
آزمایش روی نمونه های واژینال و اورترال (پیشابراهی) برای بررسی وجود تریکوموناس
واژینالیس که یک انگل تاژکدار دستگاه ادراری -تناسلی است انجام می شود .این انگل دردستگاه
ادراری -تناسلی زنان و مردان دیده می شود .ولی مردان مبتال ،دربسیاری ازموارد فاقد عالئم
بالینی هستند .تریکوموناس واژینالیس را معموال در الم های مرطوب نمونه های واژینال و
اورترال را می توان یافت (درنمونه های رنگ آمیزی شده این ارگانیسم ها پیچ خوردگی پیدا می
کنند و ممکن است قابل تشخیص نباشند).
جمع آوری نمونه ها ()Collection of Specimens
مواد الزم جهت جمع آوری نمونه عبارتند از : -1سانتریفیوژ
-2الم و المل
-3سواب های پنبه ای استریل
-4پیپت پاستور همراه با قطره چکان
-5قلم الماس
-6لوله های آزمایش کوچک ( 13×100میلی لیتری) با درپوش های پنبهای یا درپیچ دار.
-7سرم فیزیولوژی -
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
روش کار :
-1بوسیله یک سواب پنبه ای ترشحات واژینال یا اورترال را جمعآوریکنید.
-2سواب را بالفاصله درون یک لوله استریل محتوی حدودا 3میلی لیتر سرم فیزیولوژی
استریل قرار دهید .اگر چوب سواب خیلی بلند است می توانید انتهای آن را بشکنید.
-3اگر بخواهید گسترش هایی جهت رنگ آمیزی تهیه کنید با یک سواب دیگر نمونه بیشتری
بگیرید و رویالم گسترش تهیه کنید.
-4نام و یا شماره بیمار را روی لوله ها و الم ها بنویسید .عالوه بر این تاریخ جمع آوری نمونه
را نیز یادداشت کنید.
نحوه انجام آزمایش ()Direct Examination of Specimens
ب )1-آزمایش مستقیم بر روی گسترش های واژینال و اورترال
اگر بیماربتواند به آزمایشگاه مراجعه کند ،به وسیله یک سواب استریل مقداری ازترشحات
واژینال یا اورترال را بگیرید .روی الم یک قطره سرم فیزیولوژی گذاشته و سواب را روی آن
قرار دهید .پس از قرار دادن المل بادرشت نمایی ×10و ×40میکروسکوپ الم را بررسی کنید
تا تاژکداران متحرک را ببینید.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
آزمایش بر روی نمونه سانتریفیوژ شده
-1اگر سواب درون سرم فیزیولوژی به آزمایشگاه ارسال شد مایع اضافی سواب را به وسیله
فشار دادن آن به کنار لوله بگیرید و سواب را دور بیندازید.
-2لوله را به مدت 2دقیقه سانتریفیوژ کنید .اگر سانتریفیوژ در دسترس نبود لوله را 10دقیقه
دریک محل ساکن قرار دهید تا مواد درون آن ته نشین شود.
-3مایع رویی را به وسیله پیپت پاستور خارج کند.
-4یک قطره از رسوب لوله را برداشته و رویالم قرار دهید.
-5روی آن یک المل گذاشته و با عدسی ×10و ×40میکروسکوپ به جستجوی تاژکدار
متحرک بپردازید.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
آزمایش هاي خون و نسج ()Blood & Tissue Examination
در خون به جستجوي عوامل مختلف انگلي مثل عامل ماالریا ،تریپانوزومیازیس و غیره مي
پردازیم.
رنگ آمیزي گسترش هاي خوني معمول ترین روشي است كه براي مطالعه انگل هاي خوني به
كار مي رود .براي رنگ آمیزي گسترش ها بیشتر از رنگ هاي گروه رومانفسكي بخصوص
گیمسا استفاده مي شود .هنگامي كه به تشخیص سریع نیاز باشد مي توان از رن فیلد ()feilds
استفاده كرد .ضمن اینكه رنگ آمیزي دالفیلد هماتوكسیلین ()Delafield,s Haem atoxylin
براي تشخیص میكروفیالریا مناسب است.
براي بررسي نمونه هاي خون معموال از دو نوع گسترش ضخیم و نازك استفاده مي شود .در
گسترش هاي ضخیم به جهت تراكم انگل شانس دیدن آن افزایش مي یابد ولي اصوال تشخیص
در این نوع گستره ها به آشنایي و تبحر بیشتري نیاز دارد .لذا به افراد مبتدي توصیه مي شود
علیرغم تراكم كمتر انگل در گسترش هاي نازك در شروع كار میكروسكوژیك از این روش
استفاده كنند .به تعبیري گسترش هاي ضخیم براي جستجوي اولیه انگل و گسترش هاي نازك
براي شناسایي مراحل و اشكال مختلف انگل مناسب است.
بهتر است كه گسترش هاي نازك و ضخیم را روي یك الم تهیه كنید.
گسترش هاي تهیه شده قبل از رنگ آمیزي باید كامال خشك شوند .چنانچه گسترش ها به طور
جداگانه تهیه شود توصیه مي شود گسترش نازك را با روش گیمسا و گسترش ضخیم را با
روش فیلد رنگ آمیزي كنید.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
تهیه گسترش هاي خوني ()Stained Blood Films
الف) جمع آوري نمونه ها
جمع آوري و كار با نمونه هاي خون باید با دقت و احتیاط كافي همراه باشد چون بسیاري از بیماري
هاي ویروسي ،باكتریایي و انگلي به وسیله خون منتقل مي شود .به خصوص باید مراقب HIVو
هپاتیت بود كه از این نظر كاركنان آزمایشگاه همیشه در معرض خطر هستند.
مواد و معرف هاي الزم جهت جمع آوري نمونه عبارتند از :
الم و جاي قرار دادن الم
شیشه كوچك در پیچ دار 30تا 100میلي لیتري و داراي قطره چكان
استوانه اي مدرج 10و 25و 50میلي لیتري
پنس
گاز و النست استریل
میله شیشه اي
ظروف رنگ آمیزي
كاغذ خشك كن
الكل ( %70اتانول یا ایزوپروپانول)
بافر فسفات (معرف شماره )1
ظرف داراي قطره چكان حاوي متانول
رنگ رقیق شده
گیمساي رقیق شده تنها براي 8ساعت مناسب است .این گونه رنگ ها را فقط هنگام استفاده تهیه
كنید و در پایان روز دور بریزید.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
ب) روش كار
ب )1-گسترش نازك ()Thin-Smear
گسترش نازك باید از یك الیه سلول هاي خوني (گلبول ها) تشكیل شود .لذا باید یكنواخت و
غیرمتراكم و فاقد فضاي خالي باشد و انتهاي گسترش به شكل منحني یا نیم دایره باشد (شعله
شمعي) جهت برداشت خون از انگشت سبابه استفاده كرده (البته در نوزادان از پاشنه پا خون
گرفته مي شود) ابتدا سرانگشت را با الكل 70درجه خوب تمیز كنید آن را با گاز استریل ماساژ
داده تا خشك شود و بعد با النست ( )Lancetیك ضربه به نوك انگشت وارد كرده با كمي فشار
خون بیرون مي آید .معموال قطره اول را پاك كرده ،قطره دوم را روي یك الم تمیز قرار دهید
(قطره كوچك باشد) الم را در یك دست گرفته و با دست دیگر المي را كه لبه آن كامال صاف
باشد جلوي الم حاویي قطره خون قرار داده و با زاویه 30-45درجه به قطره خون مماس كنید ،
تا خون در سراسر لبه الم پخش شود .آنگاه با دقت و سرعت مناسب یكنواخت خون را در سطح
الم بگسترانید (پس از چندین بار تكرار مي توانید گسترش هاي مناسب تهیه كنید) الم را در
فضاي آزاد قرار داده تا خشك شود .سپس آن را با متانول به مدت چند ثانیه فیكس كنید اگر زمان
فیكساسیون طوالني شود تشخیص دانه هاي شوفنر ( )schuffner,s Dotsو ذرات مورر
( )Murrer,s Dotsمشكل مي شود.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
گسترش ضخیم ()Thich-Smear
گسترش ضخیم معموال از 15-20الیه سلول هاي خوني تشكیل مي شود در نتیجه به علت دارا
بودن تعداد بیشتري از عناصر انگلي تشخیص را آسان تر مي كند براي تهیه گسترش ضخیم 3
قطره خون را در گوشه همان الم قبلي (گسترش نازك) قرار داده با گوشه الم با گوشه الم
دیگري آن را مخلوط كرده هم بزنید تا فیبرین ها جدا شود .بدین ترتیب كه گوشه الم را داخل
قطره خون بطور دوراني و آرام حركت داده تا دایره اي به قطر 5/1سانتي متر ایجاد گردد این
زمان معموال 30ثانیه طول مي كشد.
پس از تهیه گسترش باید آن را در هوا خشك كرد .گسترش ضخیم احتیاجي به فیكس كردن و
حرارت دادن ندارد .چنانچه این گسترش فیكس شود دهموگلوبینیزاسیون
( )Dehaemoglobinizationصورت نمي گیرد و تشخیص عمال غیرممكن مي شود.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
رنگ آمیزي گسترش هاي خون ()Blood Smear Staining
گسترش هاي خون را مي توان یك ساعت پس از تهیه كه كامال خشك شده اند رنگ آمیزي كرد
براي رنگ آمیزي از رنگ هاي گروه رومانفسكي استفاده مي كنند .این رنگ ها شامل گیمسا ،
رایت ،فیلد -دالفیلد و غیره مي باشد كه معموال جهت رنگ آمیزي انگل هاي خون در
آزمایشگاه ها بیشتر از رنگ گیمسا استفاده مي شود .در رنگ آمیزي ،كیفیت رنگ ،تامپون
هاي رقیق كننده ،تمیزي ظروف رنگ آمیزي والم ها حائز اهمیت فراواني است.
-1روش گیمسا ()Giemsa Staining
گیمسا بهترین روش رنگ آمیزي جهت انگل هاي خوني بخصوص عوامل ماالریا مي باشد 1-2
قطره محلول غلیظ گیمسا (معرف شماره )25را در یك میلي لیتر آب مقطر خنثي حل كرده ،
محلول فوق را به مدت 20-30دقیقه بر روي الم حاوي گسترش ضخیم و نازك ریخته ،به گونه
اي كه حالت رنگین كمان در روي الم ظاهر شود .پس از این مدت با آب مقطر خنثي شستشو
داده پس از خشك كردن با استفاده از ایمرسیون روغني ابژكتیو 100به جستجوي انگل
بپردازید.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
كنترل كیفي آزمایش خون ()Quality Control for Blood Exam
براي حصول اطمینان از نتایج بدست آمده ،كاركنان آزمایشگاه باید به نكات زیر توجه داشته باشند :
-1به هنگام نمونه گیري
وسایل و ابزار كار باید تمیز باشند .الم ها نباید روغني ،آلوده به ماده تمیز كننده ،داراي اثر انگشت،
آشغال و یا گردوخاك باشند .در غیر این صورت ممكن است گسترش به خوبي تهیه نشود و یا به طور
كامل رنگ نگیرد.
النستي كه براي نمونه گیري از انگشت ،شست پا یا گوش استفاده مي شود .باید استریل باشد تا سبب
انتقال بیماري از یك فرد به فرد دیگر نشود.
ضربه اي كه با النست به انگشت و یا گوش زده مي شود باید شدت مناسبي داشته باشد تا خون مورد
نیاز براي تهیه گسترش فراهم شود .براي تمیز كردن انگشت بهتر است به جاي پنبه از گاز استریل
استفاده كرد (ممكن است رشته هاي پنبه روي انگشت باقي مانده وارد گسترش شوند) .قبل از ضربه
زدن با النست انگشت را باید كامال تمیز كرد تا قارچ ها و یا سایر آلوده كننده ها از بین بروند.
براي تهیه گسترش به شرط تهیه بالفاصله آن مي توان از خون وریدي استفاده كرد .مواد ضد انعقاد
در چسبیدن خون به الم و رنگ آمیزي اختالل ایجاد مي كنند.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
-2به هنگام تهیه گسترش گسترش ها را باید با غلظت مناسب تهیه كرد.
غلظت گسترش باید به گونه اي باشد كه از پشت آن قادر باشید حروف چاپي را بخوانید .اگر
گسترش خیلي ضخیم باشد ممكن است قسمتي از آن در طول رنگ آمیزي پاك شود و آن قسمت
از گسترش را از دست بدهید.
اگر گسترش خیلي نازك باشد تراكم انگل كم بوده ،لذا فاقد مزیت گسترش ضخیم مي باشد.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
-3آماده سازي گسترش
گسترش ها را باید افقي قرار دهید تا خشك شوند و زمان نیز كافي باشد تا بهترین نتایج حاصل
شود .اگر گسترش هاي ضخیم را تكان دهید و یا بطور مایل قرار دهید ممكن است خون به لبه
ي الم سرازیر شود و گسترش یكنواختي خود را از دست بدهد.
توجه داشته باشید اگر گسترش ها به خوبي خشك نشوند به خوبي رنگ نمي گیرند.
هنگامي كه گسترش ها هنوز خشك نشده اند باید آنها را در مكاني دور از گردوخاك ،قارچ،
مگس و سایر حشرات قرار دهید تا در تشخیص سبب اشكال نشده و آسیب نبیند.
گسترش هاي نازك را باید قبل از رنگ آمیزي با متانول فیكس كنید تا گلبول قرمز لیز نشوند.
متانول باید خالص و فاقد رطوبت باشد ،در غیر این صورت ممكن است گلبول هاي قرمز
تخریب شده و رنگ آمیزي به خوبي انجام نشود.
گسترش هاي ضخیم را نباید فیكس كنید و مراقب باشید متانول به آن نرسد.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
در بطري رنگ ذخیره گیمسا باید كامال بسته باشد و دور از نور خورشید نگهداري شود.
اگر رطوبت وارد رنگ شود ممكن است رنگ كیفیت خود را از دست بدهد .توصیه مي شود
براي استفاده قسمتي از رنگ ذخیره را در یك بطري خشك و تمیز بریزید .این كار سبب حفظ
مابقي رنگ ذخیره از رطوبت و آشغال مي شود .از قرار دادن پیپت مرطوب درون بطري
رنگ ذخیره جدا خودداري كنید .رنگ گیمساي رقیق شده حدود 8ساعت براي استفاده مناسب
است .بنابراین رنگ را در همان روزي كه استفاده مي شود ،رقیق كنید.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
روش هاي تشخیص كاالزار ()Special Techniques for Kalazar
در لیشمانیوز احشایي باید به دنبال اشكال آماستیگوتي در مغز استخوان ،گره هاي لنفاوي و
آسپیره هاي طحالي بود البته گاهي اوقات مي توان لكوسیت هاي آلوده را در الیه بافي كوت
( )Buffy Coat layerلوله میكروهماتوكریت مشاهده كرد .انگل ها را از آسپیره هاي طحال
( %98موارد مثبت) مغز استخوان ( 54-%86موارد مثبت) و گره هاي لنفاوي ( %64موارد
مثبت) گزارش مي كنند.
پونكسیون طحال اولین اقدام تشخیصي است ولي زماني كه طحال كوچك نرم و غیرقابل لمس
باشد آسپیراسیون مغز استخوان و سپس غدد لنفاوي توصیه مي شود .از مواد برداشت شده هم
مي توان گسترش ضخیم تهیه كرد و هم آن را كشت داد .محیط كشت هاي مورد استفاده محیط
غني ( N N N )Novy-Nicolle-M,cNealو محیط مغذي اشنایدر مي باشد .گسترش هاي
تهیه شده را مي توان با روش هاي گیمسا رنگ آمیزي نمود .روش هاي سرولوژیك نیز در
تشخیص كاالزار كاربرد فراواني دارند و امروزه در بعضي مراكز كشور انجام مي شود.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین
روش هاي االیزا ( )ELISAو ایمونوفلورسانس غیرمستقیم ( )IFATو آگلوتیناسیون ()DAT
بیشترین كاربرد را در تشخیص سرواپیدمیولوژیك دارند .روش IFATروش اختصاصي و
ویژگي نسبتا باالیي دارد و آزمایش ELISAروي معتبر و داراي حساسیت خوبي است .ولي
بهترین روش در دسترس و حساس كه همخواني زیادي با عالئم بالیني دارد روش DATمي
باشد.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله
بوسیله ناقلین
كشت لیشمانیا در محیط N.N.N
گاهي اوقات كشت عوامل لیشمانیا الزم مي آید كه در این صورت نمونه هاي اطراف
زخم را در شرایط استریل كشت مي دهند.
بهترین محیط كشت ،محیط (Nicol,Novy,M ,cNeal) N N Nمي باشد.
پس از آماده نمودن محیط كشت نمونه برداشته شده را در شرایط استریل در قسمت مایع
محیط كشت قرار داده در حرارت 22تا 24درجه به مدت 48تا 72ساعت بگذارید
پس از انقضاي مدت مذكور قطره اي از مایع محیط كشت را برداشته زیر میكروسكوپ
مطالعه كنید.
اشكال لپتومونایي انگل به صورت فعال و متحرك مشاهده مي گردند انگل ها را تا 20
روز بدین ترتیب مي توان نگهداري كرد .ولي بهترین روش نگهداري انگل لیشمانیا
تلقیح آن به حیوان حساس آزمایشگاهي است كه در این رابطه مي توان از موش هاي
سوري و هامستر استفاده كرد.
دکتر میترا صالحی -مرکز تحقیقات بیماریهای منتقله بوسیله ناقلین