Transcript expresní systémy - oddělení molekulární biologie crh

Expresní systémy
živé systémy využívající rekombinantních DNA technologií pro
produkci bioorganických látek (především proteinů)
Heterologní expresní systémy
• Bakteriální
• Kvasinkové
• Hmyzí buňky
• Savčí buňky
• Transgenní rostliny
charakteristika
E. coli
kvasinky
hmyzí buňky
savčí buňky
buněčný růst
rapidní (30min)
rapidní (90min)
pomalý (18-24h)
pomalý (24 h)
požadavky na růstové
medium
minimální
minimální
komplexní
medium
komplexní
medium
cena růstového media
nízká
nízká
vysoká
vysoká
množství exprimovaného
proteinu
velké
malé až velké
malé až velké
malé nebo
střední
extracelulární exprese
sekrece do
inkluzních tělísek
sekrece do
media
sekrece do
media
sekrece do
media
obvykle nutné
dodatečné složení
v některých
případech nutné
dodatečné
složení
řádně složené
proteiny
řádně složené
proteiny
N-glykosylace
-
vysoký obsah
manosy
jednoduché,
bez sialové
kyseliny
komplexní
O-glykosylace
-
+
+
+
fosforylace
-
+
+
+
acetylace
-
+
+
+
acylace
-
+
+
+
γ-karboxylace
-
-
-
+
posttranslační modifikace
skládání proteinů
Bakteriální expresní systémy
Escherichia coli
+ rychlá produkce
+ nejvýkonnější (až 0.5 g na 1 litr kultury)
+ levné a jednoduché na manipulaci
-
chybí posttranslační úprava proteinů
(neaktivní produkty eukaryotních genů)
-
přirozeně neprobíhá sekrece do média
preferují jiný genetický kód než vyšší eukaryota
rekombinatní genetická informace je vklonována do
vhodného expresního plasmidu, nedochází k integraci
do genomu
TA klonování
TA TOPO klonování
rekombinační klonování
• místně specifický rekombinatní systém bakteriofága lambda – att
• attB x attP ↔ attL x attR (“x” znamená rekombinaci).
• vzájemná rekombinace mezi nimi probíhá podle daných pravidel
• obě rekombinace jsou katalyzovány proteiny kódované jak αDNA tak bakteriální.
• selekce antibiotikum a gen ccdB mezi rekombinantními místy, protein ccdB inhibuje
bakteriální DNA gyrasu a způsobuje smrt buněk nesoucí prázdný vektor
LR reakce
se účastní integrasa a ekscionasa (αDNA)
a IHF (integration host factor) z bakterie
BP reakce
se účastní IHF a integrasa
rekombinační klonování
• Invitrogen dodává všechny typy vektorů kompatibilních pro rekombinantní klonování
• Reakce trvá 1 hodinu při laboratorní teplotě
• zachovávání čtecích rámců (ORF), žádné složité plánování
N-terminal 6xHis tag
umožňuje velice účinnou purifikaci
proteinu
pomocí
metal-chelatační
chromatografie popř. detekci pomocí
Anti-HisG protilátky
EK
rozpoznávací sekvence pro specifickou
enterokinasu, odštěpuje His-tag
T7 transcription termination region
silný terminační systém T7 bacteriofága
T7 promoter
proteinu
přesná
exprese
heterogenního
Ribosome binding site
TOPO klonovací místo pro PCR produkt
Xpress™ epitop (Asp-Leu-Tyr-Asp-Asp-Asp-AspLys) umožňuje detekci fúzního proteinu pomocí
Anti-Xpress™ protilátky
gen pro rezistenci k ampicilinu
umožňuje selekci plasmidu v E. coli
pUC origin zajišťuje vysokou replikaci
plasmidu a růst E. coli
C-terminal V5 epitope tag
umožňuje detekci fúzního
pomocí Anti-V5 protilátky
proteinu
exprimovaný protein
reverse primerTAG
„“
signální peptid
exprimovaný protein
V5 epitop
his tag
ATGforward primer
detekce

his tag
x-press
exprimovaný protein
forward primer
izolace
detekce
reverse primerTAG
„“
signální peptid
izolace
usnadnění izolace rekombinantního proteinu
koncové značky
nejpoužívanější N a C-terminální značky (tagy):
 His-tag pro metal chelatační chromatografii (Ni)
 FLAG epitope - tag DYKDDDDK
(Sigma; specifická protilátka)


CBP - calmodulin binding peptide
(26 AK)
CBD - cellulose binding domain
TRANSFORMACE baktérii a kvasinek
přímý přenos genetické informace z okolí do organismu
•
•
•
•
buňka schopná přijmout DNA (plasmid) se nazývá KOMPETENTNÍ
přirozeně kompetentní jsou některé kmeny Bacillus subtilis, Hemorheae influenze
atd.
všechny ostatní se mohou transformovat po uvedení do kompetentního stavu
dvěma způsoby:
A) ELEKTROPORACE
buňky se pořádně promyjí diH2O
smíchají s plasmidovou DNA rozpuštěnou
také v diH2O a vloží do elektroporátoru
B) CHEMICKÁ METODA
buňky se ošetří roztokem rubidné
a vápenaté soli, které způsobují
větší permeabilitu membrány
DNA se smísí s těmito buňkami a
provede se tzv. HEAT SHOCK (45
sec. 42°C)
 EFEKTIVITA 
 NÁROČNOST 
Který kmen E.coli zvolit?
tonA mutace chrání bakterii před napadením T1 a T5 fágem, chrání tak vaše klony
lacZ.M15 částečná delece wild-typového lacZ genu, po vložení plasmidu dochází k tzv.α- komplementaci
potřebné pro blue/white screening na miskách s X-gal
endA1 deficience endonukleasy I zaručuje kvalitní izolaci plasmidové DNA
lacIq produkuje lacZ represor negativně regulující transkripci z lacZ promotoru; zrušení přídavkem IPTG
mcrA, mcrBC, a mrr mutace v těchto genech zaručuje možnost klonování i methylované genomové DNA
recA1 zabraňuje rekombinaci mezi plasmidovou a bakteriální DNA
F´ episom je potřebný pro produkci ssDNA kóduje protein tvořící tzv pilus na vnější membráně E.coli
regulace exprese pod T7 promotorem
• exprese naklonovaného genu je kontrolována velice silným
promotorem z bakteriofága T7, který původně řídí expresi genu 10
pro obalový protein
• pro expresi je nutno dodat do hostitelským buněk T7 RNA
polymerasu a to buď infekcí bakteriofágem, nebo její indukovanou
expresi.
• v sytému pCR®T7 TOPO® TA Expression je exprese T7 RNA
polymerasy indukována lacZ promotorem pomocí IPTG a tento
systém je uložen v genomu hostitelských buněk
kmeny E.coli vhodné pro expresi - BL21(DE3) nebo BL21(DE3)LysS
• před indukci IPTG probíhá bazální exprese T7 RNA polymerasy, pokud je
exprimovaný produkt toxický pro bakterii, nedojde k selekci, selektují se
pouze mutované klony, které neprodukují rekombinantní protein
• kmen E.coli BL21(DE3) nese v genomu T7 RNA polymerasový gen pod
lacZ promotorem, tento konstrukt je vložen do genu pro integrasu, jehož
inaktivaci se zabrání lyzi, vyštěpení fágové částice v nepřítomnosti
pomocného fága. Přirozený lac represor, jehož gen je taktéž vložený
genomu bakterie, brání expresi bez přítomnosti induktoru (IPTG)
• někdy ovšem i přesto dochází k bazální expresi T7 RNA polymerasy a
pokud je pod T7 promoter vložen gen produkující toxický produkt pro
E.coli může docházet k redukci růstu, smrti baktérie či nestabilitě
plasmidu. Kmen BL21(DE3)LysS navíc obsahuje T7 lysozym
(produkovaný genem LysS), uložený na speciálním vektoru s nízkou
expresí a nezávislou selekci na chloramfenikol.
• T7 lysozym je schopen se vázat na T7 RNA polymerasu a inhibovat
bazální transkripci, exprese indukovaná IPTG je daleko silnější a T7 RNA
polymerasa se dostane z této inhibice
• T7 lysozym je bifunkční enzym, který má navíc vlastní lytickou funkci,
naštěpuje bakteriální peptidoglykanovou stěnu a usnadňuje tak následnou
izolaci exprimovaného proteinu.
Jaké geny lze v E.coli exprimovat?
• většinu z prokaryotických organismů
• eukaryotní geny jejichž produkty nepodléhají posttranslačním
modifikacím
• většina cytosolárních proteinů (není glykosylovaná)
• geny kódované chloroplastovou nebo mitochondriální DNA
(podobný genetický kód, evoluční příbuznost)
• všechny geny jejichž produkty nepotřebujeme v aktivní formě
odchylky v genetickém kódu?
snižují výtěžek heterologní exprese
výjimky:
jiná preference:
kodón pro arginin (6 různých):
CGU
CGA
CGG
CGC
E. coli
AGA 2.2%
AGG 1.6%
AGA
AGG
Arabidopsis th.
H. sapiens
AGA 18.9%
AGG 11.0%
AGA 11.9%
AGG 12.1%
mutace místně cílená
(site-directed mutagenesis)
• gen, či sekvenci kterou budeme chtít mutovat, je třeba
naklonovat do vhodného vektoru
• navržení dvou komplementárních primerů, v místě kde
chceme mutovat, nesoucí tuto mutaci
M
G
A
L
L
W
L
původní sekvence
5’ ATG GGA GCT CTA TTA ACC TTA 3’
forward primer
reverse primer
3’ TAC CCT CGA GAT AAT TCG AAT 5’
5’ ATG GGA GCT CTA TTA AGC TTA 3’
M
G
A
L
L
S
L
• PCR s těmito primery na templátový plasmid a s Pfu
polymerasou (se samoopravnou funkcí)
• vytváří se nové cirkulární DNA nesoucí mutaci, jsou k
sobě komplementární a drží u sebe, mají přerušení v
místě konce primerů (tzv. nick)
• ošetření restrikční endonukleasou DpnI (štěpí pouze
methylovanou DNA, tedy templátový plasmid)
• transformace do bakterie a namnožení mutovaného
plasmidu
Stratagene
stabilizace exprimovaného proteinu
2004
SUMO peptide – Small Ubiquitin like MOdifier
ochrana před proteolýzou
zvyšování rozpustnosti proteinu
zvyšuje množství exprimovaného proteinu
Sumo proteasa
testování exprese - optimalizace
• po transformaci expresního plasmidu do vhodných buněk se namnoží
prvotní kultura, selektuje se na vhodném antibiotiku (1.den)
• prvotní kultura se pak vhodně naředí čistým médiem na OD600 0.3 – 0.5
(2.den)
• indukuje se exprese přídavekem IPTG (0.1-1.0 mM) do kultury (2.den)
• kultura se inkubuje na třepačce (aerace) při 18-37°C (2.-5. den) a
odebírají se vzorky ve kterých se detekuje exprimovaný protein.
teplota:
25-18°C – pomalý růst, pomalá exprese, protein je
vylučován do cytosolu
37°C - intenzivní růst, mohutná exprese, pokud je
ale protein toxický pro bakterii (většina) je ukládán
do tzv. INCLUSION BODIES mikrotělíska
zůstávající v bakteriální cytoplasmě – ztížená
izolace!!!
E.coli nikdy nesekretuje protein do média!
izolace proteinu z bakteriální kultury:
• pokud je protein ukládán do inkluzních tělisek, rozbití buněk tepelným
šokem, případně sonifikací nebo lysozymem
IB
wash I
wash II
100mM
200mM
imidazol
0.5mM
1M
IB
marker
• poté je nutno protein renaturovat - SLOŽITÉ!!!!
bakt.extrakt
• pokud je ukládán do inkluzních tělísek, oddělení nerozpustné frakce a
denaturace 9M močovinou nebo guanidium chloridem
exprese proteinů ve velkém měřítku:
FERMENTORY
regulace:
• teplota
• pH
• obsah kyslíku
(případně jiných plynů)
• přesné dávkování
problémy a nedostatky exprese v E.coli
problém
příčina
řešení
buňky umírají, nedaří
se selekce
toxický produkt, vysoká
bazální exprese
slabší promotor, kontrola
bazální exprese, snížení
teploty kultivace
nerozpustný produkt
(ukládá se do
inkluzních tělísek)
redukce disulfidických
můstků v redukčním
prostředí cytoplasmy
transport do periplasmy
snížení teploty
snížení exprese
fúze s hydrofilní značkou
neaktivní protein
redukce v cytoplasmě
afinitní značka ovlivňuje
aktivitu
změna typu a polohy značky
zvýšení osmotického tlaku
média (1M sorbitol)
žádný protein
preference jiného
genetického kódu
dodání raritních tRNA
silnější promotor
zvýšení počtu kopií plasmidů
Bacillus subtilis
alternativní prokaryotické expresní systémy
•
•
•
•
gram pozitivní půdní bakterie
není lidský patogen
má vyvinutý sekreční systém
neprodukuje žádné endotoxiny
(rek. proteiny se dají využít v medicíně)
Bacillus subtilis
alternativní prokaryotické expresní systémy
laboratorní a průmyslově využívané kmeny
B.subtilis mají tyto mutace:
• delece genu produkujícího tenzidy (sfrC)
• delece genu produkujícího červený
pigment
• delece genu pro exogenní proteasy
Bacillus subtilis
alternativní prokaryotické expresní systémy
Bacillus subtilis je přirozeně kompetentní (má systém přenášející DNA přes
buněčnou membránu do buňky)
integrace do genomu pomocí homologní rekombinace
amyE gen kóduje neesenciální alfa-amylasu
Bacillus subtilis
alternativní prokaryotické expresní systémy
využití pro průmyslovou produkci proteas (prací prášky) a amylas (sladovnictví)
a hlavně průmyslově nejdůležitější zdroj kyseliny hyaluronové (polysacharid)
operon genů pro syntézu hyaluronové kyseliny z
rodu Streptococcus vklonován do genomu Bacillus
silný sekreční mechanismus, žádné kontaminující proteiny
Streptomyces lividans - půdní bakterie
Caulobacter crescentus - vodní baktérie
Staphylococcus carnosus - nepatogenní
produkce proteinů se zabudovanými radioisotopy 13C, 15N a deuteriem
Anabaena sp. - sinice
využití rekombinantních bakterií v potravinářství
Biotech chymosin
 enzym používaný pro srážení mléka v sýr
 kvasinkový gen transformovaný do bakterie
 biotechnologie nahrazuje chymosin izolovaný
z poražených telat
bST (bovine somatotropin)
 hormon zvyšující u krav produkci mléka
 gen z genomu krávy naklonován do baktérie
 přidává se do krmiva v kravínech
Source: Rent Mother Nature
 dříve se používal hormon pracně izolovaný z
hypofýzy poražených krav
využití rekombinantních bakterií v potravinářství
využití rekombinantních bakterií ve farmacii
2002 – 250 miliónů lidí využívalo léčiv a vakcín produkovaných mikroorganismy
lidský inzulín (Humulin®)
 inzulín – polypeptid (51 ak)
 inzulín pro léčbu diabetiků byl extrahován z pankreasu prasat a krav
 prasečí inzulín se liší pouze dvěmi ak
 někteří diabetici však produkovali protilátky proti živočišnému insulinu
 lidský inzulín se začal syntetizovat uměle (drahé)
 1982 poprvé připraven pomocí rDNA technologie
 od devadesátých let se produkuje ve velkém a levně lidský insulin
pomocí transgenních E.coli nebo kvasinek (např. Humulin®)
využití rekombinantních bakterií ve farmacii
lidský růstový hormon (HGH)
 produkovaný hypofýzou je důležitý regulátor vývoje člověka
 děti s vrozenou deficienci genu pro HGH trpí dwarfismem (zakrslostí)
 pravidelné injekce toho hormonu mohou obnovit normální růst
 živočišný GH je pro léčbu značně neúčinný
 HGH se také izoloval z hypofýz lidských mrtvol
 byl zaznamenán zvýšeny výskyt Creutzfeldt-Jakobsovy choroby
(kopurifikace prionu)
 velice drahé a velká spotřeba mrtvol
(např. na izolaci 5 mg hormonu je třeba půl milionů jehněčích mozku)
 od devadesátých let produkován pomocí rekombinantních bakterií
 litr bakteriální kultury vyprodukuje 5 mg GH za 15 hodin
exprese v rostlinách
rostlinné buněčné linie se pro produkci látek nepoužívají
BY-2 tobacco cells
• odvozené z dřeně Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow-2 v Japonsku (1974)
• rychle rostou (12 hod.), netvoří kalusy
• snadno absorbují různé sloučeniny – studium metabolismu
• snadná synchronizace – studium buněčného cyklu
• snadná transformace Agrobacteriem
TAXOL
Hellwig S. et al. Plant cell cultures for the production of recombinant proteins.
Nature Biotechnology 22(11), 2004, 1415-1424.
molekulární farmářství
rostlinné – jedlé vakcíny
 jako transgeny se používají oslabené toxiny původců mnohých chorob
 stimulace mukózního imunitního systému v epitelu trávícího traktu (účinná
imunizace)
 velice levné a efektivní
 značné uplatnění v rozvojových zemích, pojídáním čerstvých plodů se získá
imunita vůči nemocem, které v těchto zemích způsobují milióny úmrtí.
 vše ve formě testů v rostlinách tabáku a bramboru – zatím úspěšné
zubní kaz – protein spaA ze Streptococcus mutans
hepatitida B – povrchový antigen HBsAg viru
cholera – termolabilní enterotoxin B z Vibrio cholerae
1 g brambor vyrobí 30µg tohoto toxinu brambory se uvaří a toxin
denaturuje testy na myši prokázaly vysokou účinnost a
neškodnost
1997 poprvé
testováno na
člověku
hlavní snaha vědců je produkce těchto vakcín v plodinách
rozšířených ve třetím světě jako je banánovník
molekulární farmářství
plantibodies
v rostlinách připravené živočišné protilátky nebo části protilátek
 v rostlinách lze produkovat i monoklonální protilátky
 protilátky jsou vylučovány do mezibuněčného prostoru
 mohou sloužit přímo v rostlině (jako ochrana proti patogenům)
 nebo mohou být extrahovány a použity v diagnostice či medicíně
 výrazně se sníží náklady a čas na tvorbu protilátek (hybridomové buňky)
molekulární farmářství
plantibodies
• hlavní problém – rozdíly v N-glykosylaci proteinů (protilátek) u živočichů a
rostlin
• plantibodies mají jinak glykosylovanou strukturu a po aplikaci do zvířete
vyvolávají nechtěnou imunitní odpověď
• řešení: společně s geny pro Ab je do rostliny vnesen gen pro lidskou β-1,4galaktosyltransferasu – rostlina pak produkovala „polidštěné protilátky“
• jako transgen stačí vložit pouze malou variabilní oblast tzv. Fv domény z
lehkého a těžkého řetězce spojenou krátkým peptidem
scFv – single chain variable fragment
 non-hodgkinský lymfom – rakovina lymfatických uzlin (B-lymfocytů)
 nádorové buňky produkují specifické protilátky (zachycené na svém
povrchu, liší se od zdravých)
 tabák infikován TMV s vloženou části genu pro scFV myši
 tabák produkuje scFv nádorových buněk
 tabák produkuje funkční antigen, který po aplikaci myši produkuje
protilátky proti nádorovým buňkám
 imunitní odpověď nevznikla na mezidruhovou odlišnost „ produkt
rostliny – odlišná glykosylace, špatně ustřižený signální peptid
 80% myší přežilo
 antigen vytvořen během 6 týdnů
 velice jednoduchá izolace – RYCHLE A LEVNĚ
 léčba (vakcína) dělaná pacientovi přímo na míru
v současné době klinicky
testované plantibodies
antigen
rostlina
typ rekomb. Protilátky
aplikace
povrchový antigen
Streptokoka
tabák
sekreční IgA
CaroRx™
terapeutická
povrchová aplikace
Herpes simplex
virus
sója, rýže
IgG
terapeutická
povrchová aplikace
sperma
kukuřice
IgG
antikoncepce ve
formě gelu
non-Hodginský
lymfom
tabák
scFv
personalizovaná
vakcína
virus vztekliny
tabák
IgG
terapeutická
intravenosně
CEA - cancer
embryonic antigen
tabák, rýže,
pšenice, rajče
scFv, diabodies,
chimerické protilátky
terapeutická
diagnostická
Stoger et al., Recent progress in plantibody technology, Curr. Pharm Design 11, 2005
molekulární farmářství
biodegradovatelné plasty
 některé bakterie jsou schopny uchovávat uhlík a energii ve formě
osmoticky inertních polymerů (polyester k. hydroxymaselné PHB)
 tyto jsou pak v přírodě rychle degradovatelné
 tři geny z baktérií byly vloženy do rostlin Arabidopsis
3-ketotiolasa
NADH-dep. acetoacetyl-CoA-reduktasa
PHB-polymerasa
 syntéza PHB navazuje na syntézu mastných kyselin, jejíž část
probíhá v chloroplastech
 pokud byly tyto geny vloženy do jaderného genomu pod 35S
promotorem docházelo k nadměrné produkci polyhydroxybutyrátu v
listech (PHB tvořil 0.14% sušiny)
 pokud byly produkty transgenů cíleny pomocí signálních peptidů do
chloroplastů zvýšila se produkce až 100x
molekulární farmářství
biodegradovatelné plasty
Arabidopsis slouží jako modelová rostlina
předpokládá se že, tento model bude
přenesen do nějaké rostliny, která produkuje
velké
hlízy
nebo
semena
a
není
konzumována ani člověkem ani zvířaty
(skočec Ricinus communis)
transgenní řepka vyprodukuje až 10 g PHB
na rostlinu
fa
MONSANTO
zatím
tento
projekt
pozastavila, jelikož to stále ještě není
ekonomicky výhodné (výroba plastů z
fosilních zdrojů je daleko levnější)
další využívané transgeny
7-metylxantin N-metyltransferasa a
theobromin N-metyltransferasa
JAPONSKO 2003
exprese genů inhibována
metodou RNAi
druh Cofea canephora
transformován Agrobaktériem
transformované rostliny stejné
jako wild type
Cofea canephora se pěstuje na
Madagaskaru a má 2x větší obsah
kofeinu než nejrozšířenější Cofea
arabica
v mladých listech:
 theobromin 30-80%
 kofein 50-70%
bezkofeinová káva
YEAST TWO HYBRID SYSTEM
HYBRIDNÍ EXPRESNÍ KNIHOVNY
systém pro studium interakce protein - protein, bait vektor (návnada) obsahuje
gen pro protein, který studujeme a fish (prey) vektor (obsahuje danou cDNA
expresní knihovnu)
PRO STUDIUM PROTEIN-PROTEIN naklonovaná
cDNA
INTERAKCÍ – význam pro studium knihovna
z libovolného
euk.organismu
regulačních a signálních drah
konstitutivní
promotor
kvasinkový
chromozom
oddělení molekulární biologie katedry
biochemie, PřF UP
 různé expresní vektory s HIS-tagy na C a N konci pro expresi v E.coli
 různé expresní kmeny E.coli
 expresní vektory s HIS-tagy na C a N konci odvozené ze systému pPICZ a
pGAPZ (Invitrogen) pro expresi v Pichia pastoris
 expresní vektory pro expresi v Saccharomyces cerevisiae – replikační i
pro integraci
 expresní kmeny kvasinek Pichia pastoris a Saccharomyces cerevisiae
 různé vektory pro transformaci jednoděložných i dvouděložných rostlin