Transcript centrdogma

Centrální dogma
molekulární biologie
Alexandr Sember
Genetika (2009)
český překlad originálu
Principles of Genetics 5th
edition (Snustad a
Simmons, 2009)
Molecular Biology of the
Gene 6th edition (2008)
J. D. Watson et al.
http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/books/bv.fcgi?rid=mb
oc4.TOC&depth=2
http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/books/bv.fcgi
?rid=mboc4.TOC&dep
th=2
Složení buňky
cca. 15% celkové
hmotnosti buňky
(55% sušiny) tvoří
proteiny
70%
voda
RNA 6%
nukleové
kys.
•
30%
ostatní
malé mol.
ionty 4%
fosfolip. 2%
DNA 1%
proteiny 15%
polysach. 2%
•
Buňka má informaci o syntéze
proteinů uloženou v DNA
Centrální dogma MB
•
•
•
Francis Crick (1956)
Směr přenosu genetické informace: chromozomální DNA funguje jako templát pro
RNA, která se poté přemístí do cytoplasmy, kde funguje jako templát pro
proteosyntézu
základní myšlenka stále platná, pouze později doplněna o možnost reverzní
transkripce (Temin, Baltimore, 1970 – objevení reverzní transkriptázy u viru
Rousova sarkomu, 1975 NC); pochopitelně je i možné přepsat RNA do další RNA
DNA jako genetický materiál
1868 – Johann Friedrich Miescher
Izolace nukleinu z buněčných jader
obvazy z gangrén nasáklé hnisem (leukocyty)
Hrubé extrakty DNA (několik desítek bp)
Unikátní poměr P/N, chybí S
1869 – 1940 – Phoebus Aaron Theodor Levene
- pracoval na složení NK
zjistil, že DNA má 4 základní kameny (báze)
Naměřil,že jejich poměr je 1:1:1:1
tetranukleotidová hypotéza – pořadí nukleotidů
je neměnné, tetranukleotid se pravidelně
opakuje, proto nemůže vyjadřovat žádnou
genetickou informaci; NK je lešení, na němž jsou
navěšené proteiny; chemickou podstatu genu je
třeba hledat ve struktuře proteinů
DNA jako genetický materiál
1928 – Frederick Griffith
- pokus se Streptococcus pneumoniae (zápaly plic u člověka; smrt u myší)
- nebezpečnost souvisí s obalením do polysacharidového pouzdra
S-kmen - aktivní gen, který kóduje enzym pro
syntézu kapsulárního polysacharidu - hladký
vzhled (S = smooth, hladký)
R-kmen (R= rough, drsný vzhled), nemají
pouzdro a nejsou proto virulentní
DNA jako genetický materiál
Griffithův experiment – došlo k přenosu genetického materiálu mezi dvěma kmeny
bakterií procesem transformace
1. virulentní S - kmen způsobí smrt myši;
2. nevirulentní R – kmen, myš přežije; 3. – mrtvé
virulentní kmeny – nic se neděje; 4. – mrtvé virulentní
kmeny smíchané s živými nevirulentními → myš
zemřela; izolace živých virulentních kmenů
DNA jako genetický materiál
1944 – Avery, McLeod, McCarty
Transformační princip – komponenta mrtvé bakterie zodpovědné za
transformaci
•
Opakování Griffithova experimentu
•
Využití rozkvětu enzymologie (proteázy, RNázy, DNázy)
•
Pouze při působení DNáz experiment přestal fungovat
•
Definitivní důkaz - DNA = gen. materiál
1941 – William Atsbury
•
jako první izoloval opravdu vysokomolekulární DNA
•
první difrakční obrazce
1950 Erwin Chargaff
•
množství všech 4 bází není ekvimolární
•
relativní podíl bází není náhodný (A=T, C=G)
•
AT se nerovná GC, zastoupení u různých organismů se liší = vyvrácení
tetranukleotidové hypotézy
•
Chargaffovo pravidlo: poměr pur/pyr se rovná vždy 1 nezávisle na tom, z jakého
zdroje DNA pochází
DNA jako genetický materiál
•
Chargaffovo pravidlo:
obsah pyrimidinů =
obsah purinů
DNA jako genetický materiál
1952 – Alfred Day Hershey, Martha Chase (NC)
•
Je DNA genetickým materiálem i u virů?
•
analýza různých složek bakteriofága T2
•
využití pokroku (radioizotopy, izolace fágů,
mikrobiologie E. coli)
•
Kapsidy fágů zůstávají na povrchu x genetický
materiál jde do bakterie
•
•
•
kultura E. coli s bakteriofágy → kultivace na médiu s radioaktivním P+S
S → chybí v DNA
P → chybí v proteinech (výjimky: fosforylace)
2 experimenty – v jednom případě značena pouze DNA a ve druhém pouze proteiny
•
značené proteiny virového obalu zůstaly mimo buňku
•
značená DNA viru se dostávala do buňky + vznik nového fágového potomstva
•
definitivní důkaz, že za přenos dědičné informace je zodpovědná DNA i u virů
•
RNA jako genetický materiál byla objevena roku 1957 u viru tabákové
mozaiky TMV (Fraenkel-Conrat + Singer)
Rentgenová difrakční analýza
William Atsbury, Maurice Wilkins, Rosalind Franklin
Rentgenová difrakční analýza – molekuly měřené struktury dokážou vychýlit
rentgenový paprsek v závislosti na struktuře a molekulární hmotnosti (typu
atomů)
1951 – Rosalind Franklinová – nejlepší difrakční obrazce
1953 – James Watson, Francis Crick
trojrozměrný model struktury DNA
Syntéza z cizích výsledků (Franklin, Chargaff..)
Důležitý ne přímo ten model, ale hlavně návrh, jak
by se DNA mohla replikovat!!
1962 Nobelova cena za fyziologii a lékařství (spolu s
Wilkinsem, ale bez Franklinové – zemřela ve 37
letech na rakovinu vaječníků, NC se neuděluje in
memoriam)
kříž = šroubovice
chybějící 4. řada pruhů ukazuje,
že DNA je double helix
Báze vrstveny kolmo k ose
Vzdálenost mezi bázemi = 3,4 Å
1 otočka = 34 Å = 10 bp
(ve skutečnosti 10,4)
Průměr šroubovice = 20 nm
1 nm = 10-9 metru
1 Ångström (Å) = 0,1 nm
Struktura NK
Primární struktura = posloupnost nukleosidtrifosfátů (NTP,
dNTP) pospojovaných fosfodiesterovou vazbou (resp.
pořadí bází);Nevětvené lineární molekuly
Nukleotid v se skládá z:
1) Sacharidová jednotka (cukr, furanóza)
DNA: 2-deoxy-β-D-ribóza
RNA: β-D-ribóza
2) Dusíkatá baze –
adenin, guanin,
thymin, cytosin, uracil
Purinové baze: A, G
Pyrimidinové baze: C, T, U
3) Zbytek kyseliny trihydrogenfosforečné
Nukleotid = nukleosid (cukr+báze) + fosfát
Struktura NK
Nukleotid v se skládá z:
1) Sacharidová jednotka (cukr, furanóza)
DNA: 2-deoxy-β-D-ribóza
RNA: β-D-ribóza
N-glykosidická vazba
2) Dusíkatá baze –
adenin, guanin,
thymin, cytosin, uracil
Purinové baze: A, G
Pyrimidinové baze: C, T, U
3) Zbytek kyseliny trihydrogenfosforečné
Pozice na cukru se
označují tzv. „s čarou“
(na bázích ne)
Největší rozdíl
mezi DNA a
RNA je 2´OH
skupina RNA
Struktura NK
Nukleotidy:
adenosin
guanosin
thymidin
cytidin
uridin
mono-di-tri -fosf
AMP – ADP – ATP
dATP x ATP
Struktura NK
Puriny: aromatické heterocyklické báze, rovinný (= planární) dvojcyklus,
v poloze 9 je navázán cukr
Adenin = 6-aminopurin (analog je mutagenní 2-aminopurin)
Guanin = 2-amino-6-ketopurin
Struktura NK
Pyrimidiny: aromat. heterocykly, jednoduchý cyklus, v poloze 1 je navázán cukr
Cytosin = 2-keto- 4-aminopyrimidin (O= na C2 a NH2 na C4)
Thymin = 2,4 – diketo – 5 – metylpyrimidin (O =na C2 a C4, metyl na C5)
Uracil = 2,4 – diketopyrimidin (O= na C2 a C4)
Thymin je vlastně 5-metyluracil
Deaminací cytosinu vzniká uracil
Deaminací 5-metylcytosinu vzniká thymin
Zapamatujte si uracil a
máte vyhráno
Tautomerismus bází
Přeskakování vodíku mění
uspořádání donor/akceptor
vodíkové vazby – jiné
preference párování
Stabilní formy bází
= keto (T, G, U), amino (A, C)
Méně stabilní izoformy
= enol (T, G, U), imino (A, C)
Nukleotidy mohou mít i jiné funkce…
TP = zdroj energie v živých systémech
Zdroj metylu pro metylace
Kofaktory enzymů
Druzí poslové v signalizaci
Kofaktor
enzymů
Sekundární struktura DNA
= 2 molekuly ssDNA spojené vodíkovými
vazbami (Watson-Crickovské párování bází)
Báze jsou komplementární (donor/akceptor
vodíkové vazby)
A-T 2 vodíkové vazby
G-C 3 vodíkové vazby
Páry AT a GC jsou stejně široké (překryv C1
deoxyribózy = N-glykosidická vazba, symetrie
helixu)
Vodíková vazba = interakce mezi silně
elektronegativním atomem (O, F, N) a vodíkem
NH2 = donor H-vazby
=O, N = akceptor H-vazby
28 typů párování nukleotidů volně v roztoku
př. Hoogsteenovo párování – rekombinace, G-kvartet;
wobble párování – využití při čtení genetického kódu
Polarita řetězců dána
fosfodiesterovou vazbou
5´ ATTGCCA 3´
3´ TAACGGT 5´
5´-P a 3´OH
Watson-Crickovské párování
Antiparalelní uspořádání
Pravotočivá dvojšroubovice
Báze jsou uvnitř, cukrfosfátová kostra vně
Malý a velký žlábek
Sekundární struktura DNA = pravotočivá/levotočivá dvojšroubovice
Terciální struktura DNA= lineární, kružnicová, nadšroubovice
Kvarterní struktura DNA = pouze ve smyslu nějakého komplexu s proteiny
Malý a velký žlábek
270°
120°
Důvody:
1)
páry bází neprocházejí přesně
středem podélné osy
dvoušroubovice
2)
N-glykosidické vazby
nevycházející z páru bází pod
úhlem 180°. Úhly mezi oběma
vazbami jsou 120° (malý žlábek)
a 270° (velký žlábek)
Důsledek:
Jiná nabídka chemických
skupin
v malém žlábku chybí
metyl – rozpoznání pouze
páru AT nebo GC
Ve velkém žlábku
rozpoznání konkrétní báze
(využití regulačními
proteiny, regulace
transkripce x TBP vazba do
malého žlábku)
Stabilita DNA
1) Stacking interakce
•
•
•
•
hlavní příspěvek ke stabilitě DNA
Vrstvení bází na sebe (hydrofobní a van
der Waalsovy interakce)
splývání oblastí výskytu delokalizovaných
π-elektronů sousedících aromatických
kruhů
GC páry mají mnohonásobně
silnější stacking interakce mezi sebou
(než AT páry)
2) Hydratační obal
•
•
•
•
•
Primární (pouze voda) a sekundární (+ ionty)
Primární obal: 20 molekul vody / 1 nt
Zeslabení odpuzování sousedních fosfátů
Hydrofobní interakce (posiluje stacking)
Doplnění dalších vodíkových můstků
3) Vodíkové vazby mezi bázemi
•
•
Velmi malý příspěvek ke stabilitě
Význam spíše pro specifitu párování
Konformace DNA/RNA
Konformační polymorfismus
Různá hydratace a koncentrace solí
Modifikace bází (př. 5-metylcytosin u Eukaryot)
Alternativní párování bází, vrtulovité zkroucení bází apod.
Konformační flexibilita ribózy a N-glykosidické vazby
Sekvenční polymorfismus – závislost struktury na lokální sekvenci
3D struktura molekuly:
Popis torzními (dihedrálními) úhly –
jejich součet = 180°
0° = syn
180° = anti
Máme atomy ABCD, které jdou ve
vazbách za sebou; torzní úhel je
úhel mezi vazbami AB a CD podle
vazby BC, která tvoří jakoby pant
mezi nimi
N – glykosidická vazba
•
•
Všechny nukleotidy preferují anti
Pouze G preferuje aspoň z 15% syn
Konformace ribózy
•
•
•
Pokud jsou C4, O4 a C1 v jedné
rovině, sledujeme, co je nad a pod
rovinou cyklu
V DNA obvykle C2-endo, fosfáty
pohodlně daleko od sebe (70 Å)
V RNA a hybridech DNA/RNA obvykle
C3 – endo (kvůli 2´OH skupině)
Konformace DNA/RNA
•
•
•
Ribóza ve C3-endo
RNA, hybrid DNA/RNA
Báze vytlačeny od
středu, uprostřed kanál
•
•
C2-endo, klasická forma
DNA
Žlábky pěkně vykreslené
•
•
•
C2-endo, G v syn
Schodovitá struktura,
opakování dvou párů bází
Levotočivá!!
Elektrické vlastnosti NK
•
•
•
•
záporný náboj, pohyb v elektrickém poli
chovají se jako polyanionty (dsDNA má dva mínus náboje/1bp)
separace na agarózovém nebo PAA gelu = elektroforéza (anionty jako např. NK jdou k
kladné elektrodě, tedy k anodě), vizualizace např. ethidiumbromidem (interkalační činidlo)
dělení podle velikosti a topologie, menší molekuly procházejí rychleji
Denaturace NK
Reverzibilní narozdíl od proteinů
•
Denaturace teplotou, pH (pod 3, nad 11), formamidem (interference H-můstků),
močovinou, enzymaticky (helikáza)
•
Denaturace a reasociace (repetitivní sekvence rychleji)
•
Stabilita duplexů klesá v řadě
RNA/RNA DNA/RNA DNA/DNA
•
Tání duplexů lze sledovat pomocí měření absorbance v UV-oblasti
•
NK mají absorpční maximum při vlnové délce 260 nm, proteiny při 280 nm
•
•
•
•
Tm = teplota tání = teplota, při které
je polovina duplexu denaturována; je
tím vyšší, čím je větší obsah GC
Hyperchromní efekt = zvýšení
absorbance i přesto, že koncentrace
DNA se nemění (při denaturaci volné
báze lépe absorbují UV)
dsDNA má absorbanci o 40% menší
než dvě ssDNA
Hybridizace
cílová DNA
denaturac
e
sonda
FISH =
Fluorescence in
situ
hybridization
X
Southern,
Northern blot
= hybridizace in
vitro
hybridizac
e
Rozdílné vlastnosti DNA/RNA v
extrémním pH
Silně kyselé pH
DNA: bude snáze docházet k depurinacím,
DNA zdenaturuje, ale i zdegraduje
Silně zásadité pH
DNA: bude pouze
denaturovat
RNA: deprotonace 2´OH
skupiny – nukleofilní
atak fosfodiesterové
vazby– vznikne 2´3´cyklický fosfát rozpad na směs 3´ +2´
monofosfátů =
denaturace+degradace
RNA: pouze zdenaturuje (stabilní při pH 4 –
5,2)
Struktura RNA
-
-
-
Vyšší flexibilita, strukturní a funkční
mnohotvárnost
Často ssRNA, menší velikost
Rozmanité sekundární struktury
(vlásenky, bubliny…)
Terciální struktury (pseudozel..)
16S rRNA
-
Stabilita: intramolekulární interakce (za přispění 2´OH a nekonvenčního párování
pází), stacking interakce, vazba dvojmocných kationtů, stabilní tetraloops (rRNA),
mnoho modifikovaných bází a případná metylace 2´OH, tautomerie bází
Využití 2°struktury
(vlásenka, SECIS) k
inkorporaci
selenocysteinu do
proteinu
Využití 3°struktury (4
pseudouzly) k oddělení
funkčních tRNA-like a mRNAlike domén ve struktuře
tmRNA (záchrana ribozomu z
aberantní mRNA u bakterií)
Funkce RNA
Fce. RNA
- Čtení genetického kódu
- Primery pro replikaci DNA
- Genom mnoha virů
- Strukturní (ribozom, SRP…)
- Ribozymy (katalytická fce.)
Riboswitch (metabolite-sensing)
RNA interference (siRNA, miRNA,
piRNA…)
Typy RNA
1) mRNA
2) „udržovací“ (housekeeping) RNA
- tRNA, rRNA, snRNA,snoRNA, telomerázová
RNA, SRP RNA, RNasaP, RNAsa MRP,
tmRNA…
3) regulační RNA
miRNA (micro), siRNA (short interfering),
piRNA (piwi interacting), riboswitch, sRNA
4)„parazitické“RNA (retrotranspozony, viroidy,
virusoidy, RNA virů)
5) jiné RNA (guide RNA)
Červeně: ribozymová aktivita (u snRNA a
rRNA jen některé – U2+U6 snRNA, 23S
rRNA)
RNA Tie Club (24 členů s kravatou báze nebo AMK)
(foto: zleva Crick, Rich, Orgel, Watson)
Adaptorová hypotéza:
•
informace v DNA není převáděna do
polypeptidu přímo
•
vodíková vazba mezi nt+AMK je
nepravděpodobná
•
existuje tRNA = adaptorová molekula,
která se kovalentně váže k AMK a
nekovalentně k NK
Mimo klub: 1953 – Zámečník a kol.
•
Užití cell-free extraktů, radioaktivně
značených AMK a ultracentrifugy
•
Objev rozpustné S (soluble) RNA (což byla
tRNA)
•
Na S-RNA se nejdříve váže AMK a až pak se
AMK dostanou do proteinů
Objev rRNA a mRNA
(1960)
•
•
•
•
•
•
•
rRNA (85% RNA v buňce), je v ribozomech = templát??
•
NE – uniformní délka + kompozice bází (GC-bohaté) u různých
organismů
objev mRNA na základě infekce E. coli fágem T4
fágová RNA má velmi podobnou kompozici bází jako fágová DNA
RNA se neváže s ribozomálními proteiny za tvorby ribozomálních
partikulí
pohybuje se napříč povrchem ribozomu
templát, který určuje pořadí AMK v proteinu
variabilita v délce a kompozici bází
Severo Ochoa – 1959 NC za syntézu RNA
- polynukleotid fosforyláza (PNPáza) – in vivo u bakterií štěpí RNA na
mononukleotidy, ale přidá k nim navíc ještě 1 fosfát – vznikají
nukleosiddifosfáty
1. Kodon – Phe (Nierenberg,
Matthaei, 1961; NC roku 1968)
Užití PNPázy na syntézu poly -U
templátu z nukleosiddifosfátů
Translace in vitro z poly-U mRNAproduktem byl polyfenylalanin
…pak CCC, AAA…(GGG nefungoval)
Genetický
kód
4 báze a kód je tripletový = 3
báze kódují 1 aminolyselinu
(AMK) = 43 kombinací = 64
kodonů, z toho 61 kóduje
AMK, 3 stop kodony; kodon
pro methionin je zároveň
iniciační
Degenerovaný kód = více
různých kodonů kóduje
stejnou AMK
Univerzální = až na výjimky je
stejný u všech organismů
Nepřekryvný = báze 1,2,3
kódují 1AMK, báze 4,5,6
kódují další, není tam překryv
tRNA
3´
5´
1
2
3
4
5
6
7
*
U*
D- rameno
16 R
D
9
A
17.1
13 12 Y 10
G*
G
22 23 R 25
D
A
25
20.120.2
27
28
29
30
antikodonové 31
Y*
rameno
polohy s praviX* delně modifikovanými basemi
20.2 někdy nejsou
U
A
C
C
73
72
71
70
69
68
67
66
akceptorové
rameno
TC rameno
65 64 63 62 C
Y 59
A*
R
49 50 51 52 G
C
T 
Y
47.18
47.17
44
45
46
47
47.1
43
42
41
40
39
38
extra
rameno
R*
34 35 36
antikodon
X
R
invarianty
semiinvarianty
Modifikované báze
Wobbling inosinu v
antikodonu
Ribozymy – objev
(80.léta, NC 1983)
GI intron ve 26S rRNA Tetrahymena
thermophila (Thomas Cech)
Rnáza P – sestřihnutí 5´konce prekurzoru tRNA u E.
coli (Sidney Altman)
Ribozymy
Hammerhead ribozym u viroidů a
virusoidů
Ribozymy obecně často něco štěpí (s výjimkou
např. ribozomu, který syntetizuje), štěpení
probíhá v jednovláknové oblasti, obvykle je
přímo či nepřímo zůčastněna 2´OH skupina,
proteiny udržují správnou konformaci
ribozymu, pro funkci je dále důležitá vazba
kationtů
Ribozymy
Riboswitch
Centrální dogma MB
Genetika - český překlad (2009) Principles of
Genetics 5th edition (Snudtad, Simmons, 2009)
RNA svět
•
•
•
•
Ribozymy a riboswitche –
náznak, že původní svět
mohl být založen na RNA
DNA – stabilnější (bez
2´OH, T místo U) – přesun
odpovědnosti za uložení
genetické informace
Proteiny – převzaly většinu
katalytických rolí
Chybí důkazy RNA světa
(fosílie)
Děkuji za pozornost..