Transcript Svět RNA
Regulace
Genová
genové
exprese
exprese
28 000
genů
6 000
-
12 000
genů
„Svět RNA“
Ústřední dogma
molekulární
biologie
Prokaryotická a eukaryotická mRNA
Úrovně regulace genové exprese eukaryot
Chemická struktura RNA
Důsledky:
Většinou jednořetězcová šroubovice s kratšími
dvouřetězcovými úseky
Variabilita prostorové organizace druhého a
dalších řádů
Komplexní trojrozměrná struktura
RNA může mít i strukturní a katalytickou funkci
Rozdíly
mezi RNA a DNA:
Ribosa (2’-OH skupina)
Uracil místo thyminu
(absence methylu v
poloze 5)
Funkční domény 23S rRNA
Katalytická RNA - ribozymy
Katalyzované reakce – substrátem většinou RNA
nejčastěji místně specifická hydrolýza fosfodiesterových vazeb
endonukleasa
obrácený směr – syntéza fosfodiesterových vazeb
RNA ligasa, RNA polymerasa
transesterifikace
sestřih
Substrátem není RNA !
hydrolýza aminoacylesterových vazeb
syntéza peptidové vazby
28S rRNA
Typy RNA v buňce
Transkripce
Dvě základní regulační úrovně:
1. Struktura chromatinu
2. Aktivita RNA polymerasy a s ní
kooperujících bílkovin
Zrání pre-mRNA - posttranskripční modifikace
exon
intron
heterogenní jaderná RNA = primární transkript
= pre-mRNA = hnRNA
Syntéza čepičky
čepička
m7G
Sestřih
m7G
Polyadenylace
poly(A) řetězec
m7G
mediátorová RNA =
mRNA
AAAAA
C-terminální doména RNA polymerasy II
Regulace aktivity RNAP II
Platforma pro asociaci RNP
komplexů posttranskripčních
modifikací primárního
transkriptu
Vytvoření čepičky, sestřih,
rozštěpení, polyadenylace
CTD platforma
RNA a RNP
RNP – ribonukleoproteinová
částice
hnRNP/mRNP – komplexní a dynamická struktura
velká množina bílkovin vážících se k transkriptu po
celou dobu jeho existence
obecné a specifické bílkoviny
bílkovinné složení se průběžně mění
Čepička
1974: mRNA několika eukaryotických virů
na 5’-konci není trifosfát, ale čepička
Dnes:
Čepička u téměř všech eukaryotických mRNA
Základní struktura čepičky: m7GpppN(m)pN(m)p
Úprava 3’-konce pre-mRNA - polyadenylace
Význam čepičky a
poly(A) řetězce
Účast při sestřihu
Export mRNA z jádra
Stabilizace mRNA
v cytoplasmě
Regulace degradace
mRNA
Komunikace obou konců
mRNA
Translace
Výjimka – histonové mRNA
Metabolismus
histonové mRNA
Replikace DNA
S-fáze buněčného cyklu: syntéza DNA
koordinovaná syntéza množství histonů
Histonová mRNA –– 70 typů H mRNA (savci)
neobsahuje introny, není polyadenylovaná
synchronizovaná regulace exprese všech H genů
S-fáze
35 x nárůst abundance H mRNA
konec S-fáze
úbytek H mRNA
aktivace transkripce
represe transkripce
zvýšení stability (T1/2 = 45-60
min)
destabilizace mRNA (T1/2 = 10
min)
Sestřih (splicing)
M
E
C
Vystřižení intervenujících sekvencí
(intronů) následované spojením
odpovídajících částí kódující
oblasti (exonů)
snRNP, spliceosom
H
Kvasinky
A
Introny v 235 z 6000 genů
N
I
S
Obratlovci a rostliny
Introny v 80 - 85 % všech genů
M
U
S
Lidský gen pro dystrofin
78 intronů:
99.4 % délky genu
Pre-mRNA: 2 500 000 nt / 79 exonů
mRNA:
14 000 nt
Katalytické jádro spliceosomu
Fosfát vážící Mg++
velice
pravděpodobně
ribozym
Místo 2’,3’,5’-fosfotriesterové vazby
s A v místě větvení
Párování k 5’-SS
Párování k místu větvení
Formování terciálních interakcí mezi U6 a U2 snRNA
(pseudoknot)
Alternativní sestřih
Sestřih pre-mRNA
• Nezbytná součást genové exprese
• Významný regulační krok
Člověk - 40 % genů
( podle 5 000 000 EST / 33 000 genů )
Arabidopsis - zatím asi 5 % genů
( podle 179 000 EST / 27 000 genů )
Drosophila
gen pro Down syndrome cell
adhesion molecule (DSCAM):
teoreticky až 38 016 isoforem
Variabilní užití potenciálních míst setřihu
Komplexní transkripční jednotka
• Jedna pre-mRNA může dát vzniknout
mnoha zralým mRNA
• Mnoho bílkovin může být kódovanáno
jedním genem
Samosestřih – introny II. typu
Samosestřih - ribozymy
Mobilní genetické elementy
Mechanismus sestřihu stejný jako u spliceosomů
• snad jejich evoluční předchůdci
• teorie vzniku snRNA rozpadem intronů II. typu
Součást
katalytickéha
jádra
ORF
ribozym
nukleofil
Úrovně regulace genové exprese eukaryot
Komplex jaderného póru
1 000 – 10 000 jaderných pórů
na jednom jádře
Obratlovci (Xenopus) – 125 MDa (30 x velikost ribosomu);
odhad: původně 50-100 bílkovin, dnes cca 30-40
Komplex jaderného póru
Hustota pórů na povrchu
jádra oocytu Xenopus laevis
Celý komplex
průměr 120 nm
Průměr kanálu
9 nm v klidu
26 nm v aktivním stavu
Export mRNP z jádra
Slinné žlázy larev
Chironomus tentans
Obrovská mRNA
~ 75 kb
> 10 MDa
Ø 50 nm
Úrovně regulace genové exprese eukaryot
Stabilita, lokalizace a translatovatelnost mRNA
Cis-elementy
Trans-faktory
Primární sekvence mRNA
Ribosomy
Strukturní elementy
RNA-vazebné bílkoviny
Čepička (5’-5’ trifosfátová vazba)
Ribonukleasy
Poly(A) řetězec
Antisense RNA
Komplexní soubor vztahů – dynamické složení mRNP
lokalizace x stabilita x translační aktivace/inhibice
Stabilita, lokalizace a translatovatelnost mRNA
Abundance mRNA – aktuální poměr rychlosti syntézy a degradace
Transkripty
Extrémně stabilní - skladované mRNA
Stabilní - konstitutivní geny
Nestabilní – regulační bílkoviny
transkripční faktory, geny buněčného cyklu, geny stresové odpovědi
regulace stability mRNA – změna poločasu života dané mRNA až 10x
fyziologická – vývojové stadium, rychlost růstu, diferenciace
podněty okolí – stres, výživa, hormony
Iron-responsive element
Vztah stability a translatability mRNA
Transferrin receptor
exprese při nedostatku Fe
Ferritin
exprese při nadbytku Fe
IRE
(iron-responsive element)
vlásenka (23-27 nt)
smyčka (6 nt)
IRP
(IRE-binding
protein)
volný – enzym
akonitasa
vazba k IRE
stabilizuje TR mRNA
regulace železem
Naprosto opačný efekt stejného elementu
v závislosti na jeho poloze v mRNA
Lokalizační cis-elementy
ash1 mRNA
Drosophila
melanogaster
Embryo
Lokalizace
některých
mRNA
Umlčování genů / gene silencing
Petunia (1990): změny barev květů po transformaci genem pro
chalcon synthasu za 35S promotorem
Obranná strategie – kontrola virové infekce
umlčování cizorodých genů
Protismyslná RNA
RNA komplementární k cílové RNA,
reguluje její funkci
ovlivnění stability cílové RNA
inhibice nebo zesílení exprese
chemická modifikace cílové RNA/DNA
Délka 22 nt až >10 kb
Umělé protismyslné molekuly –
antisense DNA oligonukleotidy
terapeutické užití
štěpeny RNasou H (štěpí DNA/RNA hybrid)
Úrovně regulace genové exprese eukaryot
Translace
Syntéza bílkovin na základě matrice mRNA
Ribosom a translace
Peptidyl transferasa ribozym
Ribosom – největší
RNP částice
4,2 MDa =
2,8 + 1,4 MDa
Translace video
Zrání
ribosomální RNA
Rozštěpení polycistronického 45S
transkriptu
endonukleasy, exonukleasy
Samosestřih pre-rRNA
ribozym
Modifikace nukleotidů pre-rRNA
účast snoRNP
Posttranskripční modifikace tRNA
Úprava 5’-konce tRNA
RNasa P, RNP ribozym
RNA + 1 či více bílkovin
3’-terminální sekvence CCA
ATP(CTP):tRNA nukleotidyltransferasa
enzymatická syntéza bez templátu
Sestřih (introny IV. typu)
introny v antikodonové smyčce
enzymatický – endonukleasa, ligasa
Modifikace nukleotidů
Modifikace
nukleotidů v tRNA
80 popsaných (2001)
nukleotidových derivátů
Význam:
Specificita aminoacylace
Rozpoznání kodónu
3D struktura molekuly
Zvýšení povrchu tRNA
(dostupnost pro bílkoviny)
Úrovně regulace genové exprese eukaryot
Závěry
Množství úrovní regulace genové exprese
Komplikovanost a vzájemné propojení regulačních mechanismů
Obrovská variabilita „světa RNA“ v současné eukaryotické buňce
Řada reakcí katalyzovaných ribozymy
Dynamika formování a přeskupování ribonukleoproteinových komplexů
Kontinuum světa RNA a bílkovin v eukaryotické buňce
Kontakt:
David Honys
ÚEB AV ČR
http://www.ueb.cas.cz/laboratory_of_pollen_biology/default.htm