Transcript Isolační a analytické techniky výzkumu přírodních látek

Isolační a analytické techniky
výzkumu přírodních látek
 Metody
získání vzorku, isolační
techniky
 Metody určení struktury, identifikační
techniky
 Určení absolutní konfigurace přírodních
látek v mikroměřítku
 Biologické metody testování aktivity
isolovaných přírodních látek
Dobrá znalost životního cyklu organismu
 produkuje
chemické signály?
 kdy je maximum produkce?
 ve kterém orgánu jsou produkovány?
volající motýlí samička
Metody získání vzorku
 destilace
s vodní parou (silice)
 extrakce rozpouštědlem (univerzální)
 „head-space“ techniky (těkavé látky)
 mikroextrakce na pevné fázi (těkavé látky)
 nástřik pevného vzorku (hmyzí žlázy)
Destilace s vodní parou
 Clevengerův
nástavec
 rozmělněný rostlinný materiál
se vaří s vodou
 silice těká s vodní parou,
tvoří horní vrstvu
Destilace s vodní parou
_____________________________________________________
Výhody
Nevýhody
_____________________________________________________
ve velkém měřítku
nebezpečí artefaktů (oxidace)
vhodná pro rostliny, ne pro živočišné
vzorky
_____________________________________________________
Extrakce rozpouštědlem
Shrnutí výhod a nevýhod při extrakci přírodního materiálu
rozpouštědlem
_____________________________________________________
výhody
nevýhody
_____________________________________________________
jednoduchost
přítomnost balastních látek
možnost opakovat analýzu
nároky na čistotu rozpouštědla
někdy nízká koncentrace vzorku
(odpovídá množství produkované
látky v okamžiku extrakce)
_____________________________________________________
Superkritická extrakce
superkritická kapalina se tvoří
za superkritických podmínek
teploty a tlaku
 nejpoužívanější CO2
 vysoká rozpouštěcí
účinnost pro některé látky
 extrakce je rychlá

Superkritická extrakce
_____________________________________________________
Výhody
Nevýhody
_____________________________________________________
značný extrakční potenciál
drahá aparatura
laboratorní teplota
CO2 je skleníkový plyn
recyklace rozpouštědla
CO2 - „green chemistry“
bezpečný pro potravinářské procesy
levný, jednoduché zacházení, netoxický
použitelné v průmyslovém měřítku
_____________________________________________________
„Head-space“ techniky
 statická

dynamická
 jímání
látek:
 sorbenty:
 aktivní
uhlí
 Porapak Q
 Tenax
 eluce
rozpouštědlem
 vymrazování
„Head-space“ techniky
„Head-space“ techniky
Shrnutí výhod a nevýhod při „head-space“ technikách
________________________________________________________
výhody
nevýhody
________________________________________________________
přesnější složení
nároky na aparaturu
vyšší koncentrace než při extrakci
nároky na čistotu rozpouštědla
možnost opakovat analýzu
nebezpečí „break-through“
možnost uzavřené smyčky
možnost kontaminace smyčky
________________________________________________________
Obaleč jablečný (Cydia pomonella)














žláza
10:OH
12:OH
E9-12:OH
E8E10-12:Ald
E8E10-12:Ac
E8E10-12:OH
Z8E10-12:OH
E8Z10-12:OH
14:OH
16:OH
18:OH
18:Ac
20:Ac














ovzduší
10:OH
12:OH
E9-12:OH
E8E10-12:OH
Z8E10-12:OH
E8Z10-12:OH
14:OH
16:OH
18:OH
-
Mikroextrakce na pevné fázi
 solid
phase microextraction (SPME)
 původně vyvinuta pro stopová množství
organických látek ve vodných roztocích
 adsorpce na tenký film polysiloxanu
 tepelná desorpce v GC injektoru
SPME
SPME
Shrnutí výhod a nevýhod při mikroextrakci na pevné fázi
_____________________________________________
výhody
nevýhody
_____________________________________________
bez rozpouštědla
jediná analýza
vysoká citlivost
drahé zařízení
jednoduchost
použití v přírodě
_____________________________________________
Chromatogram při DHS a SPME
head-space
SPME
Diskriminace „lehčích“ molekul
(preference „těžších“ molekul)
head-space
SPME
Nástřik
pevného vzorku
 biologický
materiál
(žláza) zataven
v kapiláře
 nutná úprava
nástřikového
systému
 zplynění těkavých
složek přímo
v nástřikovém
systému
Nástřik pevného vzorku
Shrnutí výhod a nevýhod při nástřiku pevného vzorku
___________________________________________________
výhody
nevýhody
___________________________________________________
bez rozpouštědla
jediná analýza
bez ztráty hmoty
speciální úprava GC nástřiku
kontaminace GC nástřiku
___________________________________________________
Metody určení struktury
 klasické
spektrální metody (IČ, NMR,
MS, UV, CD) při větším množství
vzorku
 příprava derivátů, odbourávání, X-ray
 „pomlčkové techniky“ (GC-MS, LC-MS,
GC-IR) při mikrokvantech
 GCxGC-MS (nejnovější technika)
 2D-GC pro určení absolutní konfigurace
(standardy)
GC-MS
 stolní
přístroj, obvykle bez možnosti
přímého vstupu
 křemenná kapilární kolona, obvyklý
průměr 0,25 mm, nosný plyn helium
 konec kolony zaveden přímo do iontového
zdroje
 2 klasické typy - kvadrupól a iontová past
 nový typ – průletový analyzátor (Time Of
Flight)
Kvadrupólový GC-MS
obrázek
Kvadrupólový GC-MS
 ionty
vznikají v iontovém zdroji
 elektronová ionizace (EI)
 možnost registrace kladných i
záporných iontů
 chemická ionizace (CI) – určení
molekulové hmotnosti
 změna z EI na CI je u některých modelů
časově náročná
100
88
100
101
%
41 43
39 45
55
60
7073
74 83
89
102 115 129 143 157
0
R:931
%
102 111 125
143 157
0
R:911
30.000
40.000
50.000
60.000
70.000
55
45
88
Hit 4
101
57
60
69 70
74
83
89
95
111115
0
R:867
129 143
157
171
NIST 32384: ETHYL TRIDECANOATE
Hit 5
88
100
41
43
%
101
29
45
27 39
54
101
55
57 7073
67
89
74 83
102 115
129
143
157
158 171
0
R:849
185
197 199 213
242
NIST 29640: UNDECANOIC ACID, 2,8-DIMETHYL-, METHYL ESTER
Hit 6
88
100
55
43
70 73
57
101
60
39
45
89
83
67
81
51
0
157
97 102 115
90
129
143
139 144
158 171
186 199
%
228
183 185
200 213
41 43
27 39
229
m/z
30
228
41
100
41
183 185 199
43
80.000
%
%
171
88
rt
20.000
Hit 3
NIST 46382: NONADECANOIC ACID, ETHYL ESTER
100
10.000
228
101
41 43 55 7073
89
45 61
27 29 39
83
0
183 185 199
NIST 29645:
DODECANOIC ACID, ETHYL ESTER
88
100
%
171
40
50
60
70
80
90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250
55 57 69
71 83
59
97 102 111
157
129 143
171
228
185 197 199
0
m/z
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
Kvadrupólový GC-MS
 spektra
dobře srovnatelná se
sektorovými spektrometry
 porovnání s knihovnami National
Institute of Standards and Technology
(přes 60 000 spekter) a Wiley Library
(230 000 spekter)
 citlivost lze zvýšit metodou Selective
Ion Monitoring
Iontová past
Iontová past
 klasická
- s interní ionizací
 ionty vznikají v iontové pasti, kde se
dále skladují a analyzují
 vyšší citlivost než kvadrupólový GC-MS
 změřená spektra jsou někdy odlišná od
sektorových spektrometrů
 v jednom nástřiku lze měřit EI i CI
 tandemová technika MS/MS a MS(n)
Srovnání kvadrupól – IT
(selektivita detekce)
100
kvadrupólový GC-MS
%
0
2 0 .0 0 0
rt
2 2 .0 0 0
2 4 .0 0 0
2 6 .0 0 0
2 8 .0 0 0
3 0 .0 0 0
3 2 .0 0 0
3 4 .0 0 0
iontová past
1 7
1 8
1 9
2 0
2 1
m
in u te s
Spektrum hexadec-9-en-1-olu
81
100%
iontová past
75%
95
67
50%
109
25% 39
124
55
222
138
152
166
180
0%
50
100
150
194
241
207
200
250
m/z
55
100
67 81
69
41
54
%
53
32
kvadrupólový GC-MS
95 96
83
56
31
82
97 109
70
84
66
98
123
0
40
60
80
100
120
138 152 166
180 194 207
140
160
180
200
222
220
224240
240
m/z
Spektrum hexadekan-1-olu
97
100%
iontová past
83
69
75%
111
50%
55
125
25% 39
138
152
0%
50
100
55
69
57
100
150
225
200
250
m/z
70
68
67
54
58
82
111
71 84
85 98 112
125
81
110
139
95
0
40
196
kvadrupólový GC-MS
97
%
31
180
83
43
41
166
60
80
100
120
140
154 168 181
160
180
196
200
222224
220
m/z
240
GC-TOF
Výhody GC-TOF
 měření
hmot s vysokým rozlišením
(elementární složení iontů, ale pomalý sběr
dat)
NEBO
 možnost
dvourozměrného chromatografického
uspořádání GCxGCxTOF (rychlý sběr dat, ale
jednotkové rozlišení)
Hmotnostní spektrum je stejné
přes celý chromatografický pík
Rozdíl mezi skenovací technikou a TOF
Simultaneous Sampling
GC Peak
Scanning
1000
1000
6000
500
250
0
Rel. Abund.
750
Intensity
Rel. Abund.
8000
4000
2000
0
60
80
100
m/z
120
140
42.5
750
500
250
0
43.0
43.5
Time (sec)
1000
60
80
100
m/z
120
140
60
80
100
m/z
120
140
60
80
100
m/z
120
140
1000
Intensity
6000
500
250
1000
2000
60
80
100
m/z
120
0
140
42.5
8000
750
250
4000
2000
0
60
80
100
m/z
120
140
42.5
43.0
43.5
Time (sec)
750
500
250
0
43.0
43.5
Time (sec)
6000
500
0
4000
1000
Rel. Abund.
0
Rel. Abund.
Rel. Abund.
750
Intensity
Rel. Abund.
8000
750
500
250
0
Chromatografické uspořádání
 první
kolona klasická, nepolární, délka
30 m, vnitřní průměr 0,25 mm
 druhá kolona velmi krátká (1-2 m) s
malým vnitřním průměrem (0,1 mm),
polární fáze
 separace na druhé koloně je velmi
rychlá, proto i sběr dat musí být rychlý
Rychlá GC: zkrácení doby analýzy
Konvenční GC
187 látek za 75 min
Fast GC
187 látek za 5 min
deriváty naftalenu
TOF má vysokou rychlost sběru dat,
což umožní registrovat i velmi úzké píky
dodekan
150 ms šířka píku
10 specter/s
250 specter/s
Vysoké citlivosti se docílí odstraněním
chemického šumu pomocí 2D-techniky
9-d29-C16:COOEt
Koeluce analytů o drasticky rozdílné
koncentraci
propylenglykol
furfural
plocha píku furfuralu je 0.001% píku glykolu
Spektra snímaná v různých
místech píku propylenglykolu
At Peak
35 Seconds
45 Seconds
50 Seconds
bez dekonvoluce nelze spektrum furfuralu odečíst
Srovnání spekter
po odečtení
pozadí v apexu
píku
po dekonvoluci
spektrum
z knihovny
LC-MS
 nutnost
odstranění velkého množství
mobilní fáze
 tok částic (particle beam interface)
 termosprej (TSP)
 elektrosprej (ESI)
 chemická ionizace za atmosférického
tlaku (APCI)
LC-MS
 pouze
při technice „particle beam
interface“ se získají spektra srovnatelná
se sektorovými spektrometry
 ostatní techniky poskytují
kvazimolekulární ionty (adice nebo
eliminace další částice z molekulového
iontu)
GC-FTIR
 průtoková
detekční cela, pokrytá
vrstvou zlata („light pipe“)
 méně citlivé ve srovnání s GC-MS
(~ 100x)
 GC kolony o větším průměru
(0,32-0,5 mm)
 nosný plyn helium
 spektra v plynné fázi
(bez intermolekulárních interakcí)
Určení konfigurace dvojné vazby
H
H
O
3012 cm-1
O
Derivatizace v mikroměřítku
 charakterizace
funkčních skupin v molekule
 získání lépe interpretovatelných spekter
 zlepšení separace
 zvýšení těkavosti či tepelné stability látky
pro plynově chromatografickou analýzu
 snížení přílišné těkavosti
 stanovení enantiomerního složení
 zlepšení detekčních vlastností
Derivatizační reakce
 methylace
kyselin diazomethanem (pro GC)
 acetylace alkoholů a aminů (pro GC)
 silylace alkoholů (pro zvýšení těkavosti)
 příprava dimethylhydrazonů (CO, CHO)
 transesterifikace triacylglycerolů (pro GC)
 katalytická hydrogenace (carbon skeleton
chromatography)
Určení polohy dvojné vazby
- jen u čisté látky, vznik aldehydů
 jiné oxidativní štěpení C=C vazby (RuO4) vznik kyselin
 oxidace OsO4 - vznik diolu
 methylthiolace dvojné vazby (reakce s
dimethyldisulfidem, DMDS) - i ve směsi
 epoxidace m-chlorperoxybenzoovou
kyselinou (MCPBA) a následné reakce
 ozonolýza
Určení polohy dvojné vazby
R2 CHO
CH3S SCH3
R2 C C R1
H H
OHC R1
O3
Me2S2/I2
R2 C C R1
H H
H H
R C C R1
HO OH
ClC6H4COOOH
OsO4
2
2
R
[SiMe3]2NH
H H
1
R C C R
Me3SiO OSiMe3
2
H H
C C R1
O
Fragmentace DMDS aduktů
oktadec-9-en-1-yl-acetát
S
(CH2)5
m/z 173
100
M+ 404
S
(CH2)3
OAc
m/z 231
43
173
61
69
% 41
231
81
55
87
79
0
123
95
122
171
174
232
404
m/z
55
100
spektrum DMDS aduktů ikosa-11,15-dienalu
67
%
41
81
117
43
79
95
87 97
123
215
269 291
171
338
0
50
100
150
200
250
300
350
M+. 386
m/z 171
S
m/z 215
S
(CH2)8
S
m/z 117
S
m/z 269
CHO
386
m/z
400
Chemická ionizace methylvinyletherem
H
C
H
C
H2C
C
H
R1
H
C
H
C
R2
H2C
C
H
OCH 3
R1
R2
H
C
H
C
OCH 3
R2
OCH 3
R1
H
C
H
C
H3CO
C
H
CH2
R1
H
C
R2
H
C
OCH 3
Chemická ionizace acetonitrilem
v iontové pasti
320
100%
75%
50%
25%
97
111
123
137
151
165
180
194 204
222
236
250
265
279
302
0%
100
150
200
250
CI spektrum oktadec-11-enalu
m/z 180
[C3H4N]
aktivní částice [C3H4N]+
m/z 54
m/z
300
CH3(CH2)4
+
M 320
+
(CH2)8CHO
m/z 250
Absolutní konfigurace přírodních látek
mohou mít různé
ekologické funkce
 mohou se lišit fysiologické účinky
enantiomerů
 nutnost stanovení enantiomerní čistoty
přírodních látek s vysokou přesností
 enantiomery
Transformace složek pryskyřice
na feromon kůrovce
OH
(–)--pinen
(–)-cis-verbenol
lýkožrout smrkový
(Ips typographus)
OH
(+)--pinen
(+)-trans-verbenol
Určení absolutní konfigurace
 separace
látky a měření optické rotace
 chiroptické metody
 měření NMR s posunovými činidly
 příprava diastereoisomerů
 enantioselektivní chromatografické
separace
Stanovení enantiomerní čistoty
přírodních látek klasickou cestou
 potřebné
velké množství přírodního
materiálu
 obtížná separace enantiomerního páru
od ostatních složek přírodního vzorku
 měření optické rotace – nepřesné,
zvláště při nízkých hodnotách
specifické rotace
Enantioselektivní chromatografické
separace
 kolony
na bázi cyklodextrinu, hydroxyskupiny
substituované různými skupinami
OH
HO
-cyklodextrin, 6 jednotek
b-cyklodextrin, 7 jednotek
g-cyklodextrin, 8 jednotek
O
OH O
HO
O
OH
O HO
O
HO
OH
OH
O
O
HO
HO
OH
O
OH O
HO
OH
O HO
O
HO
O
-Cyclodextrin
OH
Dvoudimenzionální GC
2D-GC, ukázky separace
Výhody 2D-GC
 uskutečnitelné
v malých množstvích
 není nutná separace složek ze směsi
 vysoká přesnost za předpokladu dobré
separace enantiomerních párů
 vysoká citlivost, detekce i malých
znečištění druhým enantiomerem
 informace o enantiomerní čistotě
několika složek v jedné analýze
nutnost použití standardů!